非血緣臍血輔助親緣單倍體異基因造血干細(xì)胞移植治療急性髓系白血病的臨床分析

韋中玲，戴 艷，黃來全，蔣藝枝，黃東平

(皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 血液科，安徽 蕪湖 241001)

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·臨床醫(yī)學(xué)·

非血緣臍血輔助親緣單倍體異基因造血干細(xì)胞移植治療急性髓系白血病的臨床分析

韋中玲，戴 艷，黃來全，蔣藝枝，黃東平

(皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 血液科，安徽 蕪湖 241001)

目的：探討非血緣臍血輔助親緣單倍體異基因造血干細(xì)胞移植治療急性髓系白血病的安全性和療效。方法：回顧性分析2014年5月～2015年11月在我科行臍血輔助親緣單倍體異基因造血干細(xì)胞移植治療4例急性髓系白血病的臨床資料，并復(fù)習(xí)相關(guān)文獻(xiàn)。結(jié)果：4例患者移植后造血全部重建，中性粒細(xì)胞植入中位時(shí)間為13 d，血小板植入中位時(shí)間為15 d，移植后14 d外周血STR-PCR檢測(cè)為100%供者；3例患者發(fā)生急性移植物抗宿主反應(yīng)(aGVHD)，其中2例發(fā)生Ⅱ度aGVHD，1例發(fā)生Ⅳ度aGVHD，隨訪至2016年4月，1例患者于移植后106 d死亡；3例患者存活。結(jié)論：非血緣臍血輔助親緣單倍體異基因造血干細(xì)胞移植治療急性髓系白血病臨床安全，造血重建快，但aGVHD發(fā)生率較高，有待探索更有效的方法控制aGVHD的發(fā)生。

單倍體造血干細(xì)胞移植；臍血；aGVHD；急性髓系白血病

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.06.019

目前異基因造血干細(xì)胞移植已成為多種惡性血液病治愈的唯一方法。供者首選HLA全相合供者，但來源不足30%；親緣單倍體相合異基因造血干細(xì)胞移植(Haplo-HSCT)供者來源豐富、能夠優(yōu)化供者以及移植物的選擇、可提供移植后細(xì)胞治療，因此受到廣泛關(guān)注。而植入失敗率高、急性移植物抗宿主反應(yīng)(acute graft versus host disease，aGVHD)發(fā)生重、免疫重建延遲卻制約著Haplo-HSCT的發(fā)展。強(qiáng)化清髓性預(yù)處理、在移植物中加入第三方細(xì)胞、移植后大劑量環(huán)磷酰胺調(diào)節(jié)T細(xì)胞等手段用于提升Haplo-HSCT療效，改善預(yù)后。我科于2014年5月～2015年11月利用臍血輔助Haplo-HSCT治療4例急性髓系白血病，取得良好療效，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 病例資料 2014年5月～2015年11月在我科進(jìn)行臍血輔助Haplo-HSCT共4例患者，男性2例，女性2例，中位年齡22歲(18～28歲)，急性髓系白血病M2型3例(2例高危，1例復(fù)發(fā))，急性髓系白血病M5型1例(高危組)。原發(fā)病診斷符合張之南[1]《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》，根據(jù)MICM進(jìn)行分型診斷。具備單倍體異基因造血干細(xì)胞移植適應(yīng)證。

1.2 移植前檢查 所有患者完善HLA配型、臍血配型、人類白細(xì)胞抗原(HLA)-Ⅰ、Ⅱ類抗體、主要組織相容性Ⅰ類相關(guān)基因 A(MICA)抗體，以及供受者的殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(KIR)基因型檢查。

1.3 供者干細(xì)胞動(dòng)員與采集 健康供者于移植前3天開始采用皮下注射重組人粒細(xì)胞集落刺激因子，移植當(dāng)天給予在硬膜外麻醉下行骨髓采集術(shù)，在雙側(cè)髂后上棘多點(diǎn)穿刺抽取骨髓液400 mL。術(shù)中輸注動(dòng)員前采集的自體血400 mL。第2天采集外周血造血干細(xì)胞。單個(gè)核細(xì)胞(MNC)>2×108/kg受者體質(zhì)量，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34+細(xì)胞>2.0×106/kg受者體質(zhì)量，若達(dá)不到要求，第3天繼續(xù)采集外周血干細(xì)胞。對(duì)于供受者血型主要不合骨髓采集后進(jìn)行去紅細(xì)胞處理，對(duì)于次要不合者，進(jìn)行去血漿處理。

1.4 預(yù)處理方案 預(yù)處理化療采用甲環(huán)亞硝脲、阿糖胞苷、白消安、環(huán)磷酰胺、抗胸腺細(xì)胞球蛋白(兔ATG)方案：Me-CCNU 250 mg/(m2·d) -10 d；Ara-C 2 g/(m2·q12 h) -9 d、-8 d；Bu 0.8 mg/(kg·q6 h)-7 d、-6 d、-5 d；CY 1.8 g/(m2·d)-4 d、-3 d；r-ATG 2.5 mg/(kg·d) -5d、-4 d、-3 d、-2 d(以輸注干細(xì)胞當(dāng)天為0天)。

1.5 aGVHD預(yù)防 采用聯(lián)合免疫抑制方案，CSA：3 mg/(kg·d)，24 h持續(xù)輸注，-10 d開始，血清CSA濃度維持在200～300 μg/mL 至40～50 d，胃腸道功能恢復(fù)后，按照靜脈劑量的2倍改口服，分兩次，維持谷濃度在150～250 μg/mL。驍悉(MMF)：25 mg/(kg·d)，分3～4次口服，第1～30天。甲氨蝶呤(MTX)：15 mg/(m2·d)，靜注，第1天；10 mg/(m2·d)，靜注，第3、6、11天。

1.6 植入監(jiān)測(cè) 干細(xì)胞輸注后每日行血常規(guī)檢查，移植后第7、14、21天抽取外周血行STR-PCR檢測(cè)，第30、60、90天留取骨髓細(xì)胞STR-PCR檢查，對(duì)于供受者性別、血型不同者進(jìn)行染色體檢查及血型監(jiān)測(cè)。

1.7 原發(fā)病療效評(píng)估 移植前1天、移植后每月復(fù)查骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)，并行白血病基因、微小殘留病灶、WT1等檢查。

2 結(jié)果

2.1 供受者以及臍血HLA配型、KIR、DSA結(jié)果 所有供者均為父親，供受者HLA配型均為5/10相合(半相合)。臍血相合程度為4/6以上。病例1受者未行KIR檢測(cè)。4例患者中，病例4移植前檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HLA-Ⅰ抗體可疑陽性，HLA-Ⅱ抗體陽性，移植前給予血漿置換1次及利妥昔單抗輸注，所有患者M(jìn)ICA抗體陰性(表1)。

2.2 供者干細(xì)胞與臍血輸注 所有患者移植當(dāng)天輸注骨髓干細(xì)胞前4 h給予輸注臍血，第2天輸注外周血干細(xì)胞。所有患者骨髓及外周血干細(xì)胞單個(gè)核細(xì)胞和CD34+細(xì)胞達(dá)到異基因移植要求。所有患者輸注臍血以及骨髓和外周血干細(xì)胞未出現(xiàn)輸注不良反應(yīng)(見表2)。

2.3 植入情況 所有患者造血全部重建，中性粒細(xì)胞植入中位時(shí)間為13 d(12～14 d)，血小板植入中位時(shí)間為15 d(13～17 d)，見表3。

表1 供受者及臍血HLA配型、KIR、DSA結(jié)果

病例號(hào)供受者關(guān)系供受者HLA相合程度供受者血型臍血性別/血型臍血相合程度供受者KIR檢測(cè)HLA-抗體MICA1父/女5/10A+/AB+男/AB+4/6B/X,-陰性陰性2父/子5/10A+/AB+男/AB+4/6A/A,A/A陰性陰性3父/女5/10B+/B+女/B+5/6A/B2,A/A陰性陰性4父/子5/10O+/O+男/O+4/6A/B4,A/B4陽性陰性

表2 骨髓、外周血、臍血干細(xì)胞單個(gè)核細(xì)胞、CD34+細(xì)胞數(shù)量

病例號(hào)骨髓干細(xì)胞MNCCD34+外周血干細(xì)胞MNCCD34+臍血干細(xì)胞MNCCD34+11.85×108/kg0.74×106/kg18.06×108/kg2.53×106/kg2.64×107/kg1.43×105/kg21.92×108/kg0.44×106/kg28.60×108/kg2.42×106/kg3.24×107/kg3.89×105/kg31.14×108/kg0.55×106/kg11.36×108/kg2.73×106/kg2.38×107/kg0.76×105/kg41.29×108/kg0.46×106/kg8.94×108/kg2.68×106/kg1.94×107/kg1.11×105/kg

表3 患者造血重建資料

病例號(hào)中性粒細(xì)胞植入時(shí)間血小板植入時(shí)間STR14d30d60d3個(gè)月4個(gè)月113d16d100%供者100%供者100%供者100%供者100%供者213d14d100%供者100%供者100%供者85.7%供者100%供者14.3%臍血314d17d100%供者100%供者100%供者100%供者死亡412d13d100%供者100%供者100%供者未達(dá)到未達(dá)到

2.4 移植相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生情況

2.4.1 aGVHD 4例患者中有3例出現(xiàn)aGVHD，病例2為Ⅱ度GVHD(Ⅰ級(jí)腸道aGVHD)，經(jīng)過一線甲強(qiáng)龍0.5～2 mg/kg及短程使用甲氨蝶呤(MTX)、更換他克莫司、間充質(zhì)干細(xì)胞、巴利昔單抗等二線治療好轉(zhuǎn)；病例4為Ⅱ度aGVHD(Ⅰ級(jí)腸道aGVHD)，經(jīng)甲強(qiáng)龍及CD25單抗治療，好轉(zhuǎn)；病例3出現(xiàn)Ⅳ度aGVHD(Ⅳ級(jí)腸道GVHD合并Ⅱ級(jí)皮膚aGVHD)，療效不佳，于106 d死亡。

2.4.2 其他并發(fā)癥 所有患者在移植后出現(xiàn)感染，部分培養(yǎng)結(jié)果陽性。病例1中段尿培養(yǎng)提示肺炎克雷伯亞種；病例2多次咽拭子培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)窄食嗜麥芽桿菌；病例3血培養(yǎng)提示大腸埃希菌。造血干細(xì)胞輸注后4例患者均出現(xiàn)CMV血癥，經(jīng)更昔洛韋、鱗甲酸納聯(lián)合丙種球蛋白輸注治療，CMV拷貝數(shù)降至正常范圍。4例患者均出現(xiàn)遲發(fā)性出血性膀胱炎，表現(xiàn)為鏡下血尿、尿頻、尿急、尿痛癥狀，肉眼血尿；2例患者出現(xiàn)血凝塊。3例患者存在尿BK、JC病毒陽性。根據(jù)出血性膀胱炎分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ度1例(病例1)，Ⅱ度1例(病例4)，Ⅲ度2例(病例2和3)，經(jīng)過水化、堿化、強(qiáng)迫利尿、高壓氧、抗病毒等治療，癥狀改善。無VOD、間質(zhì)性肺炎等發(fā)生。

2.5 原發(fā)病療效 病例1和病例2在第120、150天復(fù)查骨髓仍處于分子生物學(xué)緩解期。病例3由于Ⅳ度GVHD在第106天死亡。病例4移植后尚未達(dá)到90 d。

2.6 隨訪 隨訪至2016年4月，中位隨訪時(shí)間4.5個(gè)月(2.5～22個(gè)月),3例無病存活，1例死亡。

3 討論

單倍體異基因造血干細(xì)胞移植術(shù)目前已逐漸成為成人和大體質(zhì)量患兒異基因造血干細(xì)胞移植的主流模式。一項(xiàng)來自2013年歐洲43個(gè)國家、685個(gè)移植中心，包含34 809名患者的移植資料顯示[2]，對(duì)于沒有HLA匹配全相合親緣或無關(guān)供者的患者使用同胞和無關(guān)供者半相合異基因造血干細(xì)胞移植術(shù)比例大幅度增加。自2010～2013年親緣半相合移植數(shù)量增長96%(2010年802例vs.2013年1571例)。但由于HLA不合程度高，易發(fā)生植入失敗，aGVHD發(fā)生率高，重度aGVHD多見，Haplo-HSCT的發(fā)展受到嚴(yán)重限制。國內(nèi)外許多學(xué)者嘗試使用多種方法來促進(jìn)供者造血干細(xì)胞植入，降低aGVHD發(fā)生率，減少非復(fù)發(fā)死亡，改善Haplo-HSCT預(yù)后。

研究人員發(fā)現(xiàn)供體特異性抗人白細(xì)胞抗原抗體(donor-specific anti-human leukocyte antigen antibodies，DSA)與植入失敗密切相關(guān)。Chang YJ等[3]在一項(xiàng)包含345名患者的Haplo-HSCT研究中發(fā)現(xiàn)，11.3%的患者存在DSA陽性，其中熒光強(qiáng)度>10 000的患者易出現(xiàn)原發(fā)性植入失敗(GR)，而熒光強(qiáng)度在2000以上與原發(fā)性植入不良(PGF)有關(guān)；與熒光強(qiáng)度<2000的患者相比，熒光強(qiáng)度在2000～10 000以及10 000以上的患者組植入失敗(3.2%vs. 31.6%vs. 60%,P<0.001)和移植相關(guān)死亡發(fā)生率(17.2%vs. 14.7%vs. 33.3%,for groups A,B,and C,respectively,P= 0.022)更高，總生存率降低 ( 77.3%vs. 85.3%vs. 44.4%,P=0.015)。因此，DSA已成為移植并發(fā)癥重要相關(guān)因素，對(duì)于DSA陽性的患者移植前可使用大劑量丙種球蛋白或血漿置換[4]減少抗體產(chǎn)生,減少植入失敗。本組患者中例4在移植前DSA陽性，給予血漿置換1次以及利妥昔單抗治療，移植后造血重建時(shí)間與其他患者類似，且14 d獲得STR100%供者。

國內(nèi)還有學(xué)者采用臍血[5]、間充質(zhì)干細(xì)胞[6]等第三方細(xì)胞輸注輔助單倍體異基因造血干細(xì)胞移植，從而達(dá)到進(jìn)一步促進(jìn)植入、降低aGVHD的作用。國內(nèi)杜振蘭等[7]利用第三方臍血輔助單倍體異基因造血干細(xì)胞移植發(fā)現(xiàn)，36例患者全部植入成功，中性粒細(xì)胞平均植入時(shí)間為(13.9±2.2)d，PLT 平均植入時(shí)間為(14.6±1.8)d，而且STR觀察至移植后 100 d，38.9%發(fā)生Ⅰ～Ⅱ度 GVHD，5.6%患者發(fā)生Ⅲ～Ⅳ度 GVHD。臨床上發(fā)現(xiàn)臍血輸注輔助Haplo-HSCT能夠起到促進(jìn)植入、降低aGVHD的作用，但具體機(jī)制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+FoxP3Treg細(xì)胞具有抑制T 細(xì)胞活化和增殖的作用[8]，國外Parmar S等[9]研究同樣發(fā)現(xiàn)臍血中的Treg細(xì)胞能夠減輕aGVHD發(fā)生。本組研究采用HLA配型4/6以上的臍血輸注聯(lián)合Haplo-HSCT，植入率達(dá)100%，中性粒細(xì)胞植入中位時(shí)間為13 d，血小板植入中位時(shí)間為15 d，與上述文獻(xiàn)類似[7]。但本組中aGVHD發(fā)生率較高，達(dá)75%；重度aGVHD發(fā)生1例，并在移植第106天后死亡，較文獻(xiàn)報(bào)道比例明顯增高[7，10]。可能與移植過程中感染發(fā)生率高，誘發(fā)aGVHD有關(guān)。但由于本組報(bào)道病例數(shù)較少，有待大樣本進(jìn)行進(jìn)一步探索。

總之，Haplo-HSCT來源豐富，移植潛能極大，可通過多種方法減少Haplo-HSCT并發(fā)癥發(fā)生。臍血輔助Haplo-HSCT治療惡性血液病臨床安全，能夠促進(jìn)造血重建，但是否能降低aGVHD發(fā)生值得商榷。

[1] 張之楠,沈悌.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[M].3版.北京科學(xué)出版社,2007:103-134．

[2] PASSWEG JR,BALDOMER H,BADER P,etal.Hematopoietic SCT in Europe 2013:recent trends in the use of alternative donors showing more haploidentical donors but fewer cord blood transplants[J].Bone Marrow Transplantation,2015,50(4):476-482.

[3] CHANG YJ,ZHAO XY,XU LP,etal.Donor-specific anti-human leukocyte antigen antibodies were associated with primary graft failure after unmanipulated haploidentical blood and marrow transplantation:a prospective study with randomly assigned training and validation sets[J].J Hematol Oncol，2015,10(8):84.

[4] ZHANG X,WANG J,ZHOU Z.The Role of HLA Antibodies in HLA Mismatched Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation[J].Clin Transpl，2014:245-50.

[5] 高力,劉嘉,陳幸華，等.HLA 不全相合造血干細(xì)胞聯(lián)合臍血移植治療急性白血病的臨床觀察[J].中國輸血雜志,2012,25(2):115-119.

[6] 吳亞妹,曹永彬,李曉紅.間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合單倍體異基因造血干細(xì)胞移植治療27例重型再生障礙性貧血臨床療效[J].解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2014,35(12):1191-1195.

[7] 杜振蘭,陳鵬,羅榮牡，等.第三方臍血輔助輸注的單倍型造血干細(xì)胞移植36例療效分析[J].中華臨床醫(yī)師雜志(電子版),2014,8(6):1200-1203.

[8] SHEVACH EM,MCHUGH RS,PICCIRILLO CA,etal.Control of T-cell activation by CD4+CD25+suppressor T cells[J].Immunol Rev，2001，182:58-57.

[9] PARMAR S,LIU XY,TUNG SS,etal.Third Party Umbilical Cord Blood-Derived Regulatory T cells Prevent Xenogenic Graft-versus-Host Disease[J].Cytotherapy，2014，16(1):90-100.

[10] 周平,王易,李丹，等.混合移植治療兒童血液病療效觀察[J].中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2014，22(2):434-439.

Clinical analysis on combined allogeneic hematopoietic stem cell transplantation withunrelated cord blood for acute myeloid leukemia

WEI Zhongling,DAI Yan,HUANG Laiquan,JIANG Yizhi,HUANG Dongping

Department of Hematology,The First Affiliated Hospital of Wannan Medical College,Wuhu 241001,China

Objective：To investigate the efficacy and safety of combined allogeneic hematopoietic stem cell transplantation(allo-HSCT) with unrelated umbilical cord blood in the treatment of acute myeloid leukemia.Methods:The clinical data were retrospectively analyzed in 4 patients with acute myeloid leukemia undegone allo-HSCT with umbilical cord blood in our department between May 2014 and November 2015,and related literatures wer reviewed.Results:The hematopoietic function was restored in the 4 patients.The median time of neutrophil engraftment was 13 days and platelet engraftment,15 days.PCR analysis of the short tandem repeat(STR) 14 days after transplantation indicated that peripheral blood chimerism was 100% of donor′s.Acutegraft-versus-host diseases(aGVHD) occurred in 3 patients,in whocm 2 were in degree II aGVHD and 1 in degree IV.Follow-up by April 2016 suggested one death by 106 days after transplantation,and survival of three.Conclusion:Allo-HSCT with unrelated umbilical cord blood may be an effective for acute myeloid leukemia,and lead to early restoration of teh lematopoietic function.However,this therapy may be associated with higher incidence of aGVHD of which managment of its advsere effect needs furter investigation.

haploidentical hematopoietic stem cell transplantation;umbilical cord blood;aGVHD；acute myeloid leukemia

1002-0217(2016)06-0575-04

安徽高校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目(KJ2016SD58)

2016-05-12

韋中玲(1979-)，女，主治醫(yī)師，(電話)13965181847，(電子信箱)liuwu66@sohu．com. 黃東平，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，(電子信箱)hdp_9713@163.com，通信作者．

R 733.7

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