結(jié)直腸癌、癌前病變中KLF6 mRNA與蛋白表達(dá)的研究

吳 鑫，張義勝，趙海遠(yuǎn)，劉銀華，彭俊璐

(皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 1.胃腸外科三；2.病理科，安徽 蕪湖 241001)

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·臨床醫(yī)學(xué)·

結(jié)直腸癌、癌前病變中KLF6 mRNA與蛋白表達(dá)的研究

吳 鑫1，張義勝1，趙海遠(yuǎn)1，劉銀華2，彭俊璐1

(皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 1.胃腸外科三；2.病理科，安徽 蕪湖 241001)

目的：檢測(cè)抑癌基因KLF6(kruppel-like factor 6)在結(jié)直腸癌、癌前病變(均結(jié)直腸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變)及癌旁正常黏膜組織細(xì)胞中的表達(dá)水平，探討KLF6表達(dá)水平在各類型組織中的相互關(guān)系及在結(jié)直腸癌病程中的作用。方法：采集弋磯山醫(yī)院2014年1月～2015年1月間結(jié)直腸手術(shù)切除后標(biāo)本共88例，其中癌組織46例、癌前病變(結(jié)直腸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變)組織21例及正常腸管黏膜組織21例。以SP法進(jìn)行免疫組化和Q-PCR方法檢測(cè)結(jié)直腸癌(結(jié)直腸癌組)、結(jié)直腸癌癌前病變(癌前病變實(shí)驗(yàn)組)及癌旁組織(對(duì)照組)中KLF6表達(dá)水平；并探討KLF6的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果：①KLF6在結(jié)直腸癌組織、結(jié)直腸癌癌前病變組織中的表達(dá)水平低于癌旁正常組織(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；且KLF6表達(dá)與浸潤(rùn)情況、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有一定相關(guān)性(P<0.05)；KLF6表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤組織學(xué)類型、癌灶大小無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。②Q-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果正常組織中KLF6基因相對(duì)表達(dá)量高于結(jié)直腸癌癌前組織和結(jié)直腸癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：KLF6基因在結(jié)直腸癌及癌前病變中起到了一定的作用，并與腫瘤浸潤(rùn)情況、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有一定相關(guān)性。

結(jié)直腸癌；癌前病變；KLF6基因

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.06.013

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，具有發(fā)病率高、致死率高及預(yù)后不良等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅人類的生命和健康[1]。 因此，不斷探索與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后相關(guān)的機(jī)制，并從中發(fā)現(xiàn)與之相對(duì)應(yīng)的分子標(biāo)志物對(duì)結(jié)直腸癌早期診斷、不同的治療方案制定及判斷其預(yù)后具有重要臨床意義[2]。

隨著腫瘤因子機(jī)制的深入研究，相關(guān)因子的定位及識(shí)別已成為結(jié)直腸癌研究的熱點(diǎn)。 Gloor描述一只蒼蠅因?yàn)镵LFS突變?cè)斐闪藝?yán)重的身體畸形，并將之命名為Krüppel，意思是“殘廢”[3]。KLF6(kruppel-like factor 6)是其中一員，同時(shí)也是新近發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，KLF6的缺失、突變極其容易導(dǎo)致許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[4]。 國(guó)內(nèi)外對(duì)KLF6基因的研究多集中在前列腺癌[5]、肝癌[6]及胃癌[7]中，鮮有結(jié)直腸癌研究的相關(guān)報(bào)道。研究KLF6基因與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系具有深刻的意義[8]。本研究應(yīng)用Q-PCR及免疫組化方法檢測(cè)結(jié)直腸癌及癌前病變中KLF6基因與蛋白的表達(dá)情況，探討KLF6基因?qū)τ诮Y(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展及腫瘤浸潤(rùn)的影響及其相互關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本采集 收集弋磯山醫(yī)院普外科2014年1月～2015年1月間結(jié)直腸手術(shù)后切除的離體標(biāo)本88例，其中結(jié)直腸癌組46例，結(jié)直腸癌前病變組(均結(jié)直腸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變)21例及正常癌旁腸管黏膜組織(距癌灶邊緣5 cm以上)21例為對(duì)照組。結(jié)直腸癌組患者平均年齡(55±4.96)歲，其中>55歲20例，≤55歲26例。男性24例，女性22例。離體后標(biāo)本分為兩部分，其中約0.5 g離體后1 h內(nèi)放入-80℃冰箱中保存，余下手術(shù)切除標(biāo)本大部送至病理科，4%甲醛固定，石蠟常規(guī)包埋備用，HE染色以確定結(jié)直腸癌組織學(xué)類型、TNM分期等。其中中高分化腺癌14例、低分化腺癌32例；30例標(biāo)本有多處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，16例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；TNM分期Ⅰ期3例、Ⅱ期共18例，Ⅲ期16例、Ⅳ期共9例；所有取材的標(biāo)本均來(lái)自手術(shù)切除治療后，且患者術(shù)前均未接受放療和化療。

1.2 材料與方法

1.2.1 材料 Triozol細(xì)胞裂解液購(gòu)自Life Technologies公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自 Invitrogen公司，引物由上海生工生物技術(shù)公司合成，鼠抗人KLF6多克隆抗體來(lái)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，免疫組化試劑盒來(lái)自北京中衫生物技術(shù)公司；KLF6上游引物序列5′-CCTGTAAGAAGCGGCATAGC-3′，下游引物序列5′-TCAACCCAACCATTAGCATTC-3′，擴(kuò)增片段137 bp，內(nèi)參β-actin上游引物序列5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，下游序列5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′，擴(kuò)增片段207 bp。

1.2.2 免疫組織化學(xué)SP 法 切片常規(guī)脫蠟，梯度酒精脫水后，3%過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性生物素酶，滴加一抗，4℃冰箱內(nèi)過(guò)夜孵育，滴加二抗，DAB顯色，蘇木精襯染，脫水，透明、中性樹(shù)膠封固。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。用已知陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照。KLF6以細(xì)胞核、質(zhì)、膜出現(xiàn)棕黃色細(xì)顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。根據(jù)腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)度并結(jié)合陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)來(lái)綜合判讀陽(yáng)性，通過(guò)用免疫組化半定量積分法來(lái)計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，其中每張切片隨機(jī)選擇3個(gè)倍數(shù)×400的高倍視野計(jì)數(shù)，每個(gè)視野以50個(gè)細(xì)胞為計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。先按染色強(qiáng)度打分：不著色為0分，顏色淡黃色為1分，棕色為2分，深棕色為3分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分；兩種評(píng)分相乘得分：0分為陰性(-)，1分為弱陽(yáng)性(弱+)，2分以上為陽(yáng)性(+)，同時(shí)以弱陽(yáng)性和陽(yáng)性表達(dá)同為陽(yáng)性表達(dá)。

1.2.3 Q-PCR 取21例結(jié)直腸癌組織以及21例癌前病變組為實(shí)驗(yàn)組，21例癌旁正常組織為對(duì)照組，分別檢測(cè)KLF6基因及內(nèi)參β-actin的表達(dá)量。采用Triozol試劑盒分別提取結(jié)直腸癌及癌旁正常組織中總RNA檢測(cè)其完整性、純度及濃度，后逆轉(zhuǎn)錄，Q-PCR。KLF6及β-actin的循環(huán)條件為95℃預(yù)變性30 s，95℃變性15 s，60℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)?；虻南鄬?duì)表達(dá)量用比較CT值計(jì)算，計(jì)算公式：F=2-ΔΔCT，ΔΔCT值=(胃癌組目的基因CT值 - 胃癌組內(nèi)參基因CT值) - (癌旁組目的基因CT值 - 癌旁組內(nèi)參基因CT值)。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。KLF6表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系采用卡方檢驗(yàn)。Q-PCR數(shù)據(jù)采用ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，數(shù)據(jù)經(jīng)GraphPad軟件處理后以柱狀圖表示。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 KLF6蛋白在結(jié)直腸癌細(xì)胞、癌前病變細(xì)胞和癌旁正常細(xì)胞中的表達(dá) KLF6蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜中，結(jié)直腸癌組織中 KLF6表達(dá)呈陰性，如圖1所示，結(jié)直腸癌癌旁正常腸管組織中KLF6表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，如圖2所示；結(jié)直腸癌癌前病變組織中KLF6表達(dá)呈弱陽(yáng)性，如圖3所示。結(jié)果顯示：KLF6蛋白在癌旁組織組、癌前病變組和結(jié)直腸癌組3組總體間表達(dá)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.799,P=0.003)。見(jiàn)表1。

定位于細(xì)胞核、質(zhì)、膜，×400。

圖1 KLF6在結(jié)直腸癌細(xì)胞中表達(dá)呈陰性

定位于細(xì)胞核、質(zhì)、膜，×400。

圖2 KLF6在癌旁細(xì)胞中表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性

定位于細(xì)胞核、質(zhì)、膜，×400。

圖3 KLF6在癌前病變細(xì)胞中表達(dá)呈弱陽(yáng)性

表1 KLF6蛋白在3組中的表達(dá)水平

組別KLF6表達(dá)+-χ2P結(jié)直腸癌組(n=46)a1927癌前病變組(n=21)b101111.7990.003癌旁對(duì)照組(n=21)c183

注：結(jié)直腸癌組與癌旁對(duì)照組比較：χ2=11.5，aP<0.05；癌前病變組與癌旁對(duì)照組比較：χ2= 6.857，bP< 0.05；結(jié)直腸癌組與癌前病變組比較：χ2=0.234，cP=0.628。

2.1.2 KLF6蛋白表達(dá)水平與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 KLF6表達(dá)與浸潤(rùn)情況、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有一定相關(guān)性(P<0.05)；KLF6表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤組織學(xué)類型、癌灶大小無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 KLF6表達(dá)水平與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

臨床病理參數(shù)nKLF6表達(dá)+-χ2P年齡 ≤552611150.025>0.05 >5520812性別 男2410140.003>0.05 女22913浸潤(rùn)情況 肌層內(nèi)205153.880<0.05 肌層外261412分化程度 高中分化142126.060<0.05 低分化321715淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有3017138.396<0.05 無(wú)16214TNM分期 A、B211293.998<0.05 C、D25718癌灶大小 癌灶≥3cm17890.368>0.05 癌灶<3cm291118腫瘤組織學(xué)類型 管狀、乳頭狀腺癌2810180.922>0.05 黏液癌、未分化癌1899

2.2 Q-PCR檢測(cè)結(jié)直腸癌、癌前病變及癌旁組織中KLF6的mRNA表達(dá)水平 經(jīng)過(guò)核酸蛋白定量?jī)x測(cè)定的RNA樣品OD值1.8～2.0，純度符合實(shí)驗(yàn)要求。RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行Q-PCR實(shí)驗(yàn)，溶解曲線顯示KLF6及內(nèi)參β-actin均為單一波峰且無(wú)明顯雜峰(圖4)，說(shuō)明該擴(kuò)增產(chǎn)物無(wú)非特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增曲線顯示擴(kuò)增效率較好(圖5)。3組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)兩兩比較用F檢驗(yàn)，每組比較所得P值均小于0.05，相對(duì)表達(dá)量用柱狀圖表達(dá)如圖6所示。

3 討論

鋅指(ZNF)結(jié)構(gòu)是在大量DNA結(jié)合基序中最具代表的真核轉(zhuǎn)錄因子，并且Cys2His2 ZNF基因序列是最規(guī)范類型[9]。Kruppel-like轉(zhuǎn)錄因子家族為鋅指(ZNF)結(jié)構(gòu)的一種，同樣對(duì)腫瘤發(fā)生可能也很重要。Kruppel樣因子6(Kruppel like factor 6，KLF6)，是一種參與生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化及血管生成等調(diào)控過(guò)程的核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[10]。Reeves等[11]使用直接測(cè)序法和微衛(wèi)星分析法確立了KLF6和TP53等位基因的失衡機(jī)制，并在結(jié)直腸癌衍生中用此方法明確KLF6、TP53、K-RAS和APC基因突變導(dǎo)致的發(fā)病率與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性密切相關(guān)。

圖4 Q-PCR檢測(cè)結(jié)直腸癌、癌前病變及癌旁組織中KLF6表達(dá)的溶解曲線

圖5 Q-PCR檢測(cè)結(jié)直腸癌、癌前病變及癌旁組織中KLF6表達(dá)的擴(kuò)增曲線

圖6 Q-PCR檢測(cè)結(jié)直腸癌、癌前病變及癌旁組織中KLF6 mRNA的表達(dá)(2-ΔΔCT法)

本實(shí)驗(yàn)我們分別采用免疫組化和Q-PCR的方法檢測(cè)了結(jié)直腸癌和結(jié)直腸癌癌前病變中KLF6的表達(dá)水平，結(jié)果提示了KLF6在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平明顯低于癌旁正常組織(P<0.05)，KLF6在結(jié)直腸癌癌前病變組織中的表達(dá)水平明顯低于癌旁正常組織(P<0.05)，可能因?yàn)镵LF6為抑癌基因，

所以在直腸癌及癌前與正常組織存在明顯表達(dá)差異?；蛟S我們將來(lái)可以將KLF6因子當(dāng)作一種腫瘤標(biāo)記物。KLF6在結(jié)直腸癌組織的表達(dá)與癌前病變組織中表達(dá)尚無(wú)明確定論，本實(shí)驗(yàn)的免疫組化和Q-PCR結(jié)果存在差異，可能與免疫組化結(jié)果為定性的，而Q-PCR數(shù)據(jù)讀取是定量的有關(guān)，因此存在差異，還需要我們進(jìn)一步的研究。

本研究同時(shí)還顯示結(jié)直腸癌中KLF6的表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)情況、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(guān)(P<0.05)；KLF6蛋白表達(dá)減弱時(shí)，腫瘤浸潤(rùn)肌層，TNM分期越晚，淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移越多，分化程度也越差；以上均提示KLF6可能作為一種新型的KLF6抑癌基因，可能成為結(jié)腸癌治療的新靶點(diǎn)，為結(jié)直腸癌治療提供分子生物學(xué)依據(jù)。

[1] 曾志良.結(jié)腸直腸癌的臨床病例特征及預(yù)后分析[J].醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐，2013,26(3):283-284.

[2] 張梁，羅桂飛.結(jié)直腸癌患者血清中可溶性P-選擇素和L-選擇素水平及臨床意義[J].中國(guó)癌癥雜志,2014,24(8):599-603.

[3] ZANDBERGWF,KUMARASAMY J,PINTO BM,etal.Metabolic inhibition of sialy l-Lewis X biosynthesis by 5-thiofucose remodels the cell surface and impairs selectinmediated cell adhesion[J].Biol Chem，2012,287(47):40021-40030.

[4] 李娜，佟秀琴.KLF6在腫瘤中的研究進(jìn)展[J].疾病監(jiān)測(cè)與控制雜志，2012,6(5)：273-277.

[5] LUPO A,CESARO E,MONTANO G,etal.KRAB-Zinc Finger Proteins:A Repressor Family Displaying Multiple Biologi-cal Functions[J].Curr Genomics，2013，14:268-278.

[6] 王勇強(qiáng)，孫燕.轉(zhuǎn)錄因子KLF6通過(guò)下調(diào) Basigin -2的表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2015(9):1188-1192.

[7] 張修穩(wěn)，趙國(guó)海.KLF6蛋白在胃炎、上皮內(nèi)瘤變和胃癌中的表達(dá)及意義[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)刊，2014(24)：9-12.

[8] 于寧,關(guān)媛.抑癌基因KLF6在腫瘤中作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].健康研究，2010,30(2)：141-145.

[9] CHUA YJ,ZALCBERG JR.Progress and challenges in the adjuvant treatment of stage II and III colon cancers[J].Expert Review Of Anticancer Therapy，2008,8(4):595-604.

[10]YANG G,MA F,ZHONG M，etal.ZNF703 acts as an oncogene that promotes progression in gastric cancer[J].Oncology Reports，2014,31(4):1877-1882.

[11]REEVES HL,NARLA,OGUNBIYIO,etal.Kruppel-like factor 6(KLF6) is a tumor suppressor gene frequently inactivated in colorectal cancer[J].Castroenterology，2004,126(40):90-103.

KLF6 mRNA and protein expression levels in colorectal cancer and precancerous lesions

WU Xin,ZHANG Yisheng,ZHAO Haiyuan,LIU Yinhua,PENG Junlu

Department of Gastrointestinal Surgery，The First Affiliated Hospital of Wannan Medical College,Wuhu 241001,China

Objective： To investigate the association and role of Kruppel-like factor 6(KLF6)gene and protein expression with precancerous lesions and in the development of colorectal cancers via detecting the levels of the gene and protein in the malignant and adjancent tissues.Methods:The samples were collected in 88 patients with colorectal cancer treated in our hospital from 2014 through 2015.Of the 88 samples,46 were from cancer tissues,21 from precancerous lesions and another 21 from adjacent normal colorectal mucosa.KLF6 mRNA and protein expression levels were detected with immunohistochemistry and quantitative polymerase chain reaction (Q-PCR) in the tissues of colorectal cancer(colorectal cancer group),precancerous lesions(precancerous lesions group) and in tumor-adjacent tissues(control group),and the association of KLF6 expression with clinical pathological parameters were also determined.Results:① KLF6 expression was significantly lower in either of the tissues from colorectal cancer or precancerous lesions than that of tumor-adjacent normal tissues(P<0.05),and was somewhat correlated with the extent of tumor infiltration,differentiation,lymph node metastasis and TNM staging(P<0.05),yet was not significantly with the patient′s age,gender,histological type and tumor size(P>0.05);②Q-PCR indicated that KLF6 gene expression was relatively higher than the level in either tissues from precancerous lesions or from colorectal cancers.The difference was significant(P<0.05).Conclusion:KLF6 gene can be important role in colorectal cancer and precancerous lesions,and is associated to a certain extent with tumor infiltration,differentiation,lymph node metastasis and TNM staging.

colorectal cancer;precancerous lesions;KLF6

1002-0217(2016)06-0555-04

皖南醫(yī)學(xué)院中青年科研基金項(xiàng)目(WK2013F21)

2016-03-16

吳 鑫( 1976-)，男，主治醫(yī)師，碩士，(電話)13905535321，(電子信箱)wuxin28577@sohu.com; 張義勝，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，(電子信箱)huhzhao@163.com，通信作者.

R 735.3

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