超聲輔助法在亞洲日月蛤多糖提取工藝優(yōu)化中的應(yīng)用

胡 偉，唐小牛

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.醫(yī)學(xué)寄生蟲學(xué)教研室;2.活性生物大分子研究安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖 241002)

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·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

超聲輔助法在亞洲日月蛤多糖提取工藝優(yōu)化中的應(yīng)用

胡 偉1，2，唐小牛1，2

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.醫(yī)學(xué)寄生蟲學(xué)教研室;2.活性生物大分子研究安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖 241002)

目的：探討超聲輔助法對(duì)亞洲日月蛤多糖最佳提取工藝。方法：分別用熱水浸提法和超聲輔助熱水浸提法提取亞洲日月蛤多糖，并比較兩種方法的生物多糖得率。再分別以液固比、提取溫度和提取時(shí)間為條件，采用超聲輔助法提取亞洲日月蛤多糖，通過單因素正交實(shí)驗(yàn)確定多糖得率的最優(yōu)提取條件。結(jié)果：相同條件下，熱水浸提法提取出的亞洲日月蛤多糖得率為1.05%，而超聲輔助熱水浸提法的多糖得率為1.71%。超聲輔助熱水法提取亞洲日月蛤多糖的最優(yōu)條件是：在超聲功率160 W條件下，液固比40∶1(mL/g)、溫度為90℃、時(shí)間4 h，在此條件下亞洲日月蛤多糖得率為2.01%，其中液固比(P<0.01)和提取溫度(P<0.05)對(duì)多糖提取率影響較大。結(jié)論：超聲輔助法提取亞洲日月蛤多糖得率明顯優(yōu)于熱水浸提法。

超聲；亞洲日月蛤；多糖；優(yōu)化

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.06.002

亞洲日月蛤(Amusiumpleuronectes)俗稱日月貝，屬于軟體動(dòng)物門、甲殼綱、鶯蛤目、海扇蛤科，廣泛分布于我國(guó)東南沿海地區(qū)，是重要的海洋經(jīng)濟(jì)貝類。研究證實(shí),生物多糖在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化及抗病毒等方面具有重要的生物學(xué)作用[1-4]。而貝類多糖是貝殼類動(dòng)物的主要成分之一，研究發(fā)現(xiàn)，貝類多糖也具有多方面的生物學(xué)作用，如Yuan Q等[5]研究發(fā)現(xiàn)縊蟶多糖具有較強(qiáng)的免疫刺激活性；Wang T等[6]研究證實(shí)太平洋牡蠣多糖具有較好的抗高血壓作用等。隨著生活水平的提高，海洋貝類越來越多地出現(xiàn)在人們餐桌之上，因其味美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高而深受人們喜愛。生物多糖傳統(tǒng)工藝包括水溶劑提取法、乙醇溶劑提取法、酸提取法和堿提取法，不僅耗時(shí)長(zhǎng)、溫度高、浪費(fèi)資源，且其提取的生物多糖生物活性會(huì)降低。所以目前很少用單一的傳統(tǒng)工藝提取生物多糖，基本上都是兩種提取方法聯(lián)合使用，從而更快速、更有效的提取生物多糖。貝類生物多糖因其蛋白質(zhì)含量很高，所以其脫蛋白是難點(diǎn)，因此必須進(jìn)行多次重復(fù)脫蛋白，方可得到純度較高的貝類多糖。日月貝作為重要的海洋經(jīng)濟(jì)貝類，其多糖的提取及生物活性尚不清楚。因此本研究擬優(yōu)化日月貝多糖提取工藝，從而為日月貝多糖的生物活性研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 日月貝(南京眾彩批發(fā)市場(chǎng))。

1.1.1 試劑 丙酮、無水乙醇、三氯甲烷、正丁醇(所有試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純)；活性炭、D301-R型大孔樹脂，均為國(guó)產(chǎn)。

1.1.2 主要儀器 MODEL電子分析天平(上海金山亭林工業(yè)開發(fā)區(qū))，XHF-D高速分散器內(nèi)切式勻漿機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)，JY96-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)，SIGMA? 3-18KS高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)賽多利斯公司)，KW-1000DC數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇市億通電子有限公司)，KQS200B超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，ELELA OSB-2100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)，SIMFD8-3凍干機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，U2800紫外分光光度計(jì)(尤尼柯上海儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 日月貝粗多糖提取 將日月貝去殼、洗凈、風(fēng)干稱質(zhì)量，組織攪碎機(jī)攪碎，加丙酮在室溫下脫脂24 h。脫脂后加雙蒸水(不同液固比)在超聲功率160 W條件下冰浴細(xì)胞粉碎30 min。以提取溫度和提取時(shí)間為可變因素，在不同條件下水浴提取。提取液經(jīng)過濾、離心，減壓抽濾至原溶液1/5容積，加3倍容積95%乙醇，4℃下醇沉24 h，去除上清，收集沉淀，依次用無水乙醇和丙酮脫水，重復(fù)2次，加雙蒸水復(fù)溶2次收集復(fù)溶液。

1.2．2 脫蛋白 用Sevage法脫蛋白(Sevage試劑為三氯甲烷∶正丁醇=4∶1)。將復(fù)溶液與Sevage試劑按照3∶1的比例混合，在搖床上以220 r/min充分混合1 h后離心，混合液分三層，收集上層糖溶液。上述步驟重復(fù)10次，以充分脫去蛋白質(zhì)。

1.2.3 脫色

1.2.3.1 活性炭脫色 取6只潔凈的試管，向試管中各加入脫蛋白后的日月貝多糖溶液5 mL，再分別稱取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g顆粒狀活性炭，依次加入含有日月貝多糖溶液的試管內(nèi)搖勻。55℃恒溫水浴2 h后12 000 r/min離心10 min，取上清雙層濾紙抽濾2次。測(cè)定各試管中糖溶液脫色率[7]。

1.2.3.2 大孔樹脂脫色 大孔樹脂處理：先取一定量的D301-R型大孔樹脂，用雙蒸水浸泡1 h后減壓去氣泡，去水后加5%NaCl溶液攪拌 4 h，雙蒸水洗至中性；再加2% NaOH溶液攪拌4 h，雙蒸水洗至中性備用。

取6只潔凈的試管，向試管中各加入脫蛋白后的日月貝多糖溶液5 mL，再分別稱取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6g處理后的D301-R大孔樹脂，依次加入含有日月貝多糖溶液的試管內(nèi)搖勻，55℃恒溫水浴2 h后12 000 r/min離心10 min，取上清雙層濾紙抽濾2次，測(cè)定各試管中糖溶液脫色率。脫色后的多糖提取液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾、透析、冷凍干燥，得到純度較高的日月貝多糖，測(cè)其多糖含量。

1.3 多糖含量測(cè)定 采用硫酸-蒽酮法檢測(cè)多糖含量[8]。硫酸蒽酮溶液配制：稱取0.2 g蒽酮放入100 mL容量瓶?jī)?nèi)，加濃硫酸定容至刻度，利用超聲清洗器超聲使蒽酮完全溶解(現(xiàn)配現(xiàn)用)。稱取在105℃條件下烘干至恒質(zhì)量的葡萄糖10 mg，置于100 mL容量瓶?jī)?nèi)，加雙蒸水定容至刻度并搖勻。在該容量瓶?jī)?nèi)量取10 mL溶液，加入到100 mL容量瓶?jī)?nèi)，并用雙蒸水定容至刻度，所得溶液即為標(biāo)準(zhǔn)液。量取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9mL標(biāo)準(zhǔn)液分別置于10 mL試管內(nèi)，用雙蒸水將各體積補(bǔ)至1.0 mL之后向各試管內(nèi)加入4 mL硫酸蒽酮溶液搖勻并加橡皮塞，先冰浴10 min再100℃水浴10 min，冷卻至室溫。利用紫外分光光度計(jì)在620 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)吸光度值，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取10 mg日月貝粗多糖，加雙蒸水稀釋至100倍后搖勻，吸取1 mL溶液，測(cè)其吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得直線回歸方程y=0.00432+0.00339x，相關(guān)系數(shù)r2=0.99938。計(jì)算得出日月貝多糖得率。計(jì)算公式如下:

多糖含量N(%)=M×D/0.010×100%；多糖得率(%)=W×N/Q×100%。其中，M為多糖濃度，D為稀釋倍數(shù)，Q為樣本質(zhì)量(g)，W為各條件所得多糖質(zhì)量。

2 結(jié)果

2.1 多糖提取工藝優(yōu)化條件 通過單因素實(shí)驗(yàn)探討超聲輔助法提取日月貝多糖最優(yōu)條件，以液料比、溫度和時(shí)間3個(gè)因素設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，見表1、2。由表3可知，液固比(P<0.01)和提取溫度(P<0.05)對(duì)多糖提取率影響較大，其影響作用大小依次為RA﹥RB﹥RC，即影響因素為液固比﹥溫度﹥時(shí)間，由表1和表2可知其最佳提取工藝為A2B3C2，即其最優(yōu)提取條件為液固比40∶1( mL/g)，提取溫度為90℃，提取時(shí)間4 h下，日月貝多糖的提取率為2.01%。

表1 超聲輔助法提取日月貝多糖正交實(shí)驗(yàn)因素水平

因素A:液固比/(mL/g)B:溫度/℃C:時(shí)間/h130∶1703240∶1804350∶1905

表2 超聲輔助法提取日月貝多糖L9(33)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

序號(hào)因素ABC提取率/%11110.7421220.7931331.0542131.7152211.7762322.0173121.1783231.4393311.64k10.861.211.38-k21.831.241.32-k31.411.571.40-R0.970.360.08-

表3 超聲輔助法提取日月貝多糖正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析

因素偏差平方和自由度均方F值P值A(chǔ)1.42120.710212.3950.005B0.20120.10030.0230.032C0.00920.0051.3690.422

2.2 活性炭和大孔樹脂脫色比較

2.2.1 活性炭脫色 由圖1可知活性炭對(duì)日月貝多糖脫色效果明顯，當(dāng)添加活性炭量為0.04 g/mL時(shí)，多糖脫色率達(dá)89.51%。隨著活性炭量的增加，其脫色率變化不大，但多糖損失量會(huì)增多，所以活性炭對(duì)日月貝多糖脫色的最優(yōu)條件為活性炭量為0.04 g/mL，在55℃恒溫水浴條件下脫色2 h。

圖1 活性炭脫色效果曲線

2.2.2 大孔樹脂脫色 由圖2可知大孔樹脂對(duì)日月貝多糖脫色效果明顯，當(dāng)添加大孔樹脂量為0.06 g/mL時(shí)，多糖脫色率達(dá)81.25%。隨著大孔樹脂量的增加，其脫色率變化不大，但多糖損失量會(huì)增多，所以大孔樹脂對(duì)日月貝多糖脫色的最優(yōu)條件為大孔樹脂量為0.06 g/mL，在55℃恒溫水浴條件下脫色2 h。

圖2 D301-R大孔樹脂脫色效果曲線

3 討論

超聲輔助法提取日月貝多糖，在超聲條件下，使液體介質(zhì)不斷受到壓縮和拉伸，產(chǎn)生空化作用，其產(chǎn)生的空化泡可以機(jī)械地破壞日月貝的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使其破裂釋放有效糖成份并能更好地溶解在水溶液中，從而能節(jié)約提取時(shí)間和能源，并能提高生物多糖提取率。但因其在超聲條件下會(huì)產(chǎn)生大量的熱量，故必須進(jìn)行冰浴細(xì)胞粉碎，防止高溫破壞生物多糖活性。本研究利用超聲輔助熱水浸提法提取日月貝多糖，在相同條件下熱水浸提法日月貝多糖得率為1.05%，而超聲輔助熱水浸提法日月貝多糖得率為1.71%，其多糖得率明顯比單一熱水法多糖得率高。超聲輔助法在超聲功率160 W條件下，液固比40∶1(mL/g)、溫度90℃、時(shí)間4 h條件下，日月貝多糖提取率為2.01%。目前常用的輔助法提取生物多糖，如陳明等[9]利用超臨界CO2萃取法提取茶多糖；Maran JP等[10]利用微波輔助法從芒果皮中提取多糖；Cheng Z等[11]利用微波酶輔助法提取五味子多糖；Liu JL等[12]采用高壓超聲波輔助法提取川穹多糖等，其生物多糖提取率較傳統(tǒng)工藝有明顯的提高。

比較活性炭和大孔樹脂兩種脫色工藝：活性炭和大孔樹脂脫色效果都較明顯，活性炭脫色率為89.51%，較大孔樹脂81.25%高。目前活性炭脫色和大孔樹脂脫色是最常用的兩種脫色方法。通過實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示：活性炭黏附力強(qiáng)，脫色效果較好，工藝簡(jiǎn)便、快速，但糖含量損失較多，如果只是將提取的生物多糖溶液經(jīng)透析后用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，可以選擇脫色效果較好的活性炭脫色。大孔樹脂脫色前期對(duì)樹脂的處理較繁瑣，裝柱后脫色時(shí)間較長(zhǎng)，脫色效果不如活性炭脫色，但如果需要進(jìn)一步分離純化解析糖結(jié)構(gòu)實(shí)驗(yàn)，可選擇多糖保留率較高的大孔樹脂脫色。糖溶液經(jīng)初步DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析，色素和一些其他類物質(zhì)會(huì)被截留在層析柱的凝膠內(nèi)，從而收集到純度較高的中性糖和酸性糖。

綜上所述，超聲輔助法提取日月貝多糖得率明顯高于傳統(tǒng)工藝。超聲輔助法在超聲功率160 W條件下，其最佳提取條件為：液固比40∶1(mL/g)、溫度90℃、時(shí)間4 h，日月貝多糖得率為2.01%。活性炭脫色率為89.51%，較大孔樹脂81.25%高。日月貝多糖提取工藝的優(yōu)化為日月貝多糖的生物活性研究提供更好的基礎(chǔ)。

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Optimizing the ultrasound-assisted extraction technology in isolation of the polysaccharide from Amusium pleuronectes

HU Wei,TANG Xiaoniu

Department of Medical Parasitology,Wannan Medical College,Wuhu 241002,China

Objective：To optimize the ultrasound-assisted extraction technique in isolating the polysaccharide fromAmusiumpleuronectes.Methods:Isolation of polysaccharide fromAmusiumpleuronecteswas performed with simple hot water extraction or ultrasound-assisted hot water extraction,and polysaccharide yield was compared pertaining to the two techniques.Then optimal polysaccharide extraction condition was determined by single factor and orthogonal test on water to material ratio,extraction temperature and extraction time basis.Results:Polysaccharide yield ofAmusiumpleuronecteswas 1.05% by simple hot water extraction and 1.71% by ultrasound-assisted hot water isolation in the same condition.Optimal conditions for polysaccharide production by ultrasound assistance were as follows:ultrasound power at 160 W，water to material ratio by 40∶1(mL/g),extraction temperature at 90℃ and extraction time for 4 hours.This condition resulted in polysaccharide yield fromAmusiumpleuronectesby 2.01%.In addition,the water-material ratio and extraction time had great impact on the recovery rate(P<0.01;P<0.05,respectively).Conclusion:Ultrasound-assisted hot water extraction may lead to higher polysaccharide yield fromAmusiumpleuronectesthan simple hot water isolation technique.

ultrasound;Amusiumpleuronectes;polysaccharide;optimization

1002-0217(2016)06-0515-04

安徽高校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目(KJ2014A270)

2016-08-04

胡 偉(1987-)，男，2014級(jí)碩士研究生，(電話)13145531616，(電子信箱)412397487@qq.com； 唐小牛，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，(電子信箱)txniu163.com,通信作者.

R 284

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