人HCN4基因真核表達質粒構建及在HEK293細胞中的表達

謝向榮，左廣鋒，程 浪，汪 茗，曹 蘅，汪和貴，蔚有權，楊 浩，芮世寶，楊玉雯，湯圣興

(1.皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 心內科，安徽 蕪湖 241001；2.皖南醫(yī)學院 活性生物大分子研究安徽省重點實驗室，安徽 蕪湖 241002；3.南京醫(yī)科大學附屬南京醫(yī)院 心內科，江蘇 南京 210006)

?

·基礎醫(yī)學·

人HCN4基因真核表達質粒構建及在HEK293細胞中的表達

謝向榮1，2，左廣鋒3，程 浪2，汪 茗2，曹 蘅1，汪和貴1，蔚有權1，楊 浩1，芮世寶1，楊玉雯1，湯圣興1

(1.皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 心內科，安徽 蕪湖 241001；2.皖南醫(yī)學院 活性生物大分子研究安徽省重點實驗室，安徽 蕪湖 241002；3.南京醫(yī)科大學附屬南京醫(yī)院 心內科，江蘇 南京 210006)

目的：構建人HCN4基因的真核表達質粒并轉染人胚胎腎細胞，建立異源性表達HCN4通道模型。方法：通過聚合酶鏈反應擴增人HCN4基因全長核苷酸序列，雙酶切(XhoI和EcoRI)后插入真核表達質粒pIRES2-EGFP中，構建重組真核表達質粒pIRES2-HCN4-EGFP。應用脂質體法將重組質粒pIRES2-HCN4-EGFP轉染入HEK293細胞中進行表達。全細胞膜片鉗技術檢測HCN4通道電流。結果：酶切及測序的結果顯示pIRES2-HCN4-EGFP構建成功，倒置熒光顯微鏡能觀察到EGFP綠色熒光，反轉錄-聚合酶鏈反應檢測到HCN4 mRNA表達，膜片鉗檢測到HCN4基因編碼的通道電流。結論：成功建立異源性表達HCN4通道模型，為進一步研究HCN4通道電生理特性提供了實驗基礎。

HCN4基因；轉染；異源性表達；HEK293細胞

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.06.001

正常心臟節(jié)律的產(chǎn)生取決于起搏細胞4相自動除極化，而If電流在此除極化過程中起著重要作用[1]。If電流由超極化激活的環(huán)核苷酸門控通道(HCN通道)開放產(chǎn)生，該通道由HCN基因編碼，其電生理特性是超極化時被激活，呈電壓和時間依賴性，為非選擇性的內向陽離子通道[2]。目前已知HCN基因共有四個亞型，分別為HCN1～HCN4，這四個基因亞型分別編碼具有不同電生理特性及不同組織分布的HCN1～HCN4通道。心臟中的起搏細胞主要表達HCN4，該通道占總HCN mRNA的80%以上[3-4]，主要調節(jié)心率[5]。最近研究發(fā)現(xiàn)，嚴重的緩慢性心動過緩與HCN4基因某些位點突變相關[6-8]。通過基因工程構建生物起搏器來根治嚴重的緩慢性心動過緩，理想的基因表達載體不可或缺。因此，HCN4基因表達載體的構建成為重要的研究手段。本研究通過構建人HCN4基因的重組真核表達載體pIRES2-HCN4-EGFP，應用分子生物學及膜片鉗技術檢測pIRES2-HCN4-EGFP在HEK293細胞中的表達，以期建立異源性表達HCN4通道模型，為該通道的功能研究及緩慢性心律失常疾病的基因治療等提供了實驗基礎，同時也為該通道的藥物干預研究提供了實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 材料 HEK293細胞(中國科學院上海細胞庫)；無內毒素質粒大量提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒(QianGEN)；反轉錄-聚合酶鏈反應試劑盒、pMD-18T載體(Takara)；PCR試劑盒、DNA上樣緩沖液及瓊脂糖凝膠(南京凱基)；胰化蛋白胨、酵母提取物(Oxoid)；限制性內切酶XhoI、EcoRI，T4 DNA 連接酶(NEB)；胎牛血清及高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；Fugene HD轉染試劑(Roche)；pIRES-EGFP質粒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、DNA marker、 Platinum Pfx DNA聚合酶、Taq Polymerase、dNTP、MgSO4、Trizol均為Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 HCN4基因的反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增 根據(jù)GenBank報道的人HCN4基因的全長序列(NM_005477.2)設計單鏈oligo引物，并在正向引物和反向引物中分別添加EcoRI、XhoI兩個酶切位點，引物由Invitrogen公司合成。寡聚單鏈核苷酸進行兩輪PCR擴增。其中第一輪PCR反應條件為：95℃ 3 min 1 cycle；95℃ 20 s，55℃ 20 s，68℃ 1 min，25 cycles；68℃ 5 min 1 cycle。第二輪PCR反應條件為：95℃ 3 min 1 cycle；95℃ 20 s，60℃ 20 s，68℃ 1 min，25 cycles；68℃ 5 min 1 cycle。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后進行回收純化。

1.2.2 測序及HCN4基因拼接 將連接pMD-18T載體與回收純化的PCR產(chǎn)物，轉化DH5α感受態(tài)細胞，采用含氨芐青霉素的平板進行篩選，次日挑單克隆后搖菌，最后提取質粒并測序，鑒定插入片段的序列與目的序列是否一致。應用重疊PCR技術將插入片段拼接成完整的HCN4基因，并進行擴增。擴增條件為：95℃ 3 min 1 cycle；95℃ 40 s，60℃ 40 s，68℃ 3 min 40 s，25 cycles；68℃ 10 min 1 cycle。擴增產(chǎn)物再次采用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定后回收純化。

1.2.3 重組質粒pIRES2-HCN4-EGFP的構建XhoI和EcoRI雙酶切帶有相應酶切位點的HCN4基因和pIRES2-EGFP載體，回收HCN4片段和線性pIRES2-EGFP，用T4 DNA連接酶連接HCN4和pIRES2-EGFP。連接體系為：雙酶切HCN4基因5 μL,雙酶切pIRES2-EGFP載體 3 μL，10Х連接酶緩沖液1 μL，連接酶0.5 μL，雙蒸水0.5 μL。構建的pIRES2-HCN4-EGFP重組質粒采用雙酶切、PCR、測序等方法進行驗證，確定構建成功后擴增備用。

1.2.4 pIRES2-HCN4-EGFP質粒的瞬時轉染 HEK293細胞采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，2～3 d傳代1次，消化時采用0.25%的胰酶-EDTA消化液。質粒轉染參考既往文獻[9]中的方法進行，48 h后采用倒置熒光顯微鏡觀察轉染細胞的EGFP綠色熒光，確定轉染效率。

1.2.5 HCN4基因轉錄水平的檢測 參考既往文獻[9]中的方法收集HEK293細胞，提取總RNA，進行逆轉錄、基因擴增，最后用1.5%瓊脂糖110 V，15 min凝膠電泳進行分析。hHCN4上游引物：5′-CCCGCCTCATTCGATATATTCAC-3′，hHCN4下游引物：5′-GAGCGCGTAGGAGTACTGCTTC-3′。

1.2.6 電生理實驗 HEK293細胞轉染pIRES2-HCN4-EGFP質粒48 h后，采用全細胞膜片鉗技術記錄單細胞的HCN4通道電流。所有電生理操作均在室溫(20～25℃)下進行，按照文獻[10]中的方法進行數(shù)據(jù)采集及分析。

2 結果

2.1 HCN4基因擴增及pIRES2-HCN4-EGFP質粒測序XhoI和EcoRI雙酶切pIRES2-HCN4-EGFP重組質粒，采用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳(電壓110 V，時間15 min)，凝膠成像后可見一條與目的基因(3612bp)位置相符的條帶(如圖1所示)。測序結果經(jīng)NCBI blast比對后，序列一致，其中序列號為NM_005477.2(如圖2所示)。

M：DNA Marker；1:HCN4基因。

圖1 擴增帶有酶切位點的HCN4基因

圖2 pIRES2-HCN4-EGFP質?；驕y序結果

2.2XhoI和EcoRI雙酶切pIRES2-HCN4-EGFP質粒XhoI和EcoRI雙酶切鑒定結果可知pIRES2-HCN4-EGFP質粒被切成長度為5.3 kb的載體和3.6 kb的DNA片段，提示質粒構建的完全正確(如圖3所示)。

1:重組質粒被切成載體(5.3 kb)和3.6 kb的DNA片段;M：DNA Marker。

圖3XhoI和EcoRI雙酶切重組質粒pIRES2-HCN4-EGFP

2.3 EGFP表達檢測 通過倒置熒光顯微鏡觀察，轉染攜帶有EGFP質粒的HEK293細胞均可見綠色熒光，提示轉染成功。而未轉染質粒的HEK293細胞則未見綠色熒光(如圖4所示)。

a.轉染pIRES2-HCN4-EGFP質粒的HEK293細胞；b.轉染pIRES2-EGFP質粒的HEK293細胞;c.未轉染質粒的HEK293細胞。轉染pIRES2-HCN4-EGFP質粒和轉染pIRES2-EGFP質粒的HEK293細胞均可見綠色熒光，未轉染HEK293細胞未見綠色熒光表達。

圖4 轉染及未轉染的HEK293細胞熒光顯微鏡特點

2.4 轉染細胞的HCN4 mRNA表達 應用RT-PCR方法，提取HEK293細胞總的RNA，經(jīng)逆轉錄后獲取cDNA并進行擴增，凝膠電泳結果顯示pIRES2-HCN4-EGFP組擴增出大約233 bp的目的片段，而pIRES2-EGFP組和未轉質粒組則無相應條帶，表明導入的異源性人HCN4基因(hHCN4)已轉錄出相應的mRNA(如圖5所示)。

1：pIRES2-HCN4-EGFP組；2、3：pIRES2-EGFP組；4、5：未轉質粒組；M：DNA Marker。

圖5 RT-PCR檢測HCN4在轉基因細胞中的轉錄

2.5 異源性hHCN4通道電流的記錄 轉染pIRES2-HCN4-EGFP質粒的HEK293 細胞48 h后均可記錄到超極化激活的內向電流，并呈現(xiàn)出電壓依賴性(見圖6)，提示表達hHCN4通道蛋白，進一步證實了異源性hHCN4基因在HEK293 細胞中的表達。pIRES2-EGFP組和未轉質粒組則未檢測出電流。

3 討論

目前，HCN家族有HCN1～HCN4四個亞型，其在鼠及人等哺乳動物中已經(jīng)被克隆且得到廣泛的研究[11-12]，這一家族各亞型在組織分布、電生理特性、生理功能、不同動物種屬中的表達均不相同。HCN4是已知成年人竇房結中最主要的亞型，介導了在竇房結起搏活動中的關鍵因素If電流，因此相應的HCN4基因的突變也和嚴重的緩慢性心律失常密切相關[13]。

a：克隆hHCN4通道的I/t關系曲線；b：對照組未引出電流。

圖6 膜片鉗技術記錄hHCN4通道電流

近年來很多研究顯示了HCN4基因在形成心臟節(jié)律及控制心率中起著至關重要的作用：①胚胎期HCN4基因敲除的大鼠心率減少40%，缺少對cAMP的反應并最終死于子宮內[14-15]；②全HCN4基因敲除的成年小鼠可出現(xiàn)嚴重的心動過緩、房室傳導阻滯，甚至在第5天左右出現(xiàn)心臟驟停及死亡[16]；③在研究遺傳性竇房結功能障礙的患者中發(fā)現(xiàn)，嚴重的緩慢性心律失常與HCN4 點突變(D553N或1613delC位點)密切相關[6-8]。

目前，治療緩慢性心律失常的主要方法仍是在心臟中植入人工起搏器，雖然該方法具有很好的穩(wěn)定性，但它存在使用壽命有限、費用昂貴、不受神經(jīng)體液調節(jié)等缺點，因此，科研工作者開始探討生物起搏治療的可能。HCN4基因是HCN家族參與心臟節(jié)律形成的最重要的亞型，因此可以作為基因治療緩慢性心律失常的靶基因。但HCN4通道電生理特性及其對眾多藥物(尤其是抗心律失常藥物)的干預反應仍未充分研究，故需構建異源性HCN4通道模型，在此模型上進行電生理及藥物干預研究，為上述HCN4靶基因治療緩慢性心律失常提供更多的理論依據(jù)及實驗基礎。國內外關于HCN4基因的構建及轉染表達的研究多應用于實驗動物細胞，由于HCN4基因在不同動物種屬中的表達均不相同，因此本研究系構建人HCN4基因的真核表達質粒，并在人胚胎腎細胞中表達，對于人體的生物起搏治療具有更高的醫(yī)學研究價值。

本研究構建的pIRES2-EGFP-HCN4真核表達載體能有效地將hHCN4導入HEK293細胞中，通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光可明確轉染成功，并進一步通過RT-PCR方法和膜片鉗技術分別檢測了hHCN4的mRNA和通道蛋白的表達，表明成功建立了hHCN4基因異源性表達模型。該模型的建立為研究hHCN4通道的電生理特性及其對藥物干預的反應提供了廣闊的平臺，也為今后起搏通道基因治療竇房結功能障礙提供理論依據(jù)，并為后續(xù)的在體生物起搏器開發(fā)研究奠定了基礎。

[1] DARIO DIFRANCESCO.Funny channel gene mutations associated with arrhythmias[J].J Physiol，2013，591 (17)：4117-4124.

[2] MARTIN BIEL，CHRISTIAN WAHL-SCHOTT,STYLIANOS MICHALAKIS，etal.Hyperpolarization-Activated Cation Channels:From Genes to Function[J].Physiol Rev,2009,89:847-885.

[3] SHI W，WYMORE R，YU H，etal．Distribution and prevalence of HCN mRNAexpression in cardial tissue[J].Circ Res,1999,85：e1-6.

[4] THOLLON C,BEDUT S,VILLENEUVE N,etal.Use-dependent inhibition of hHCN4 by ivabradine and relationship with reduction in pacemaker activity[J].Br JPharmacol,2007,150:37-46.

[5] Pietro Scicchitano,Santa Carbonara,Gabriella Ricci，etal．HCN Channels and Heart Rate[J].Molecules 2012,17：4225-4235.

[6] SCHULZE-BAHR E，NEU A，F(xiàn)RIEDERICH P，etal．Pacemaker channel dysfunction in patient with sinus node disease[J]．J Clin Invest,2003,111：1537-1545.

[7] MILANESI R,BARUSCOTTI M,GNECCHI-RUSCONE T,etal.Familial sinus bradycardia associated with a mutation in the cardiac pacemaker channel[J].N Engl J Med,2006,354:151-157.

[8] NOF E,LURIA D,BRASS D,etal.Point mutation in the HCN4 cardiac ion channel pore affecting synthesis,trafficking,and functional expression is associated with familial asymptomatic sinus bradycardia[J].Circulation,2007,116:463-470.

[9] 左廣鋒,陳紹良,徐艷,等.人HCN2真核表達載體的構建及在HEK293細胞中的表達.現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2011,11(6):1068-1071.

[10]ZUO GF,LI MH,ZHANG JX，etal.Capsazepine concentration dependently inhibits currents in HEK 293 cells mediated by human hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated 2 and 4 channels[J].Exp Biol Med (Maywood)，2013,238(9):1055-1061.

[11]ISHII TM,TAKANO M,XIE LH.Molecular characterization of the hyperpolarization-activated cation channel in rabbit heart sinoatrial node[J].J.Biol Chem,1999,274:12835-12839．

[12]MOOSMANG S,STIEBUTI J,ZONG X，etal.Cellular expression and functional characterization of four hyperpolarization-activated pacemaker Channels in cardiac and neuronal tissues[J].Eur J Biochem,2001,268:1646-1652.

[13]NANA DUHME,PATRICK A.SCHWEIZER,DIERK THOMAS,etal.Altered HCN4 channel C-linker interaction is associated with familial tachycardia-bradycardia syndrome and atrial fibrillation[J].Eur Heart J,2013,34(35)：2768-2775.

[14]STIEBER J,HERRMANN S,FEIL S,etal.The hyperpolarization-activated channel HCN4 is required for the generation of pacemaker action potentials in the embryonic heart[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2004,100(25):15235-15240.

[15]HARZHEIM D,PFEIFFER KH,FABRITZ L,etal.Cardiac pacemaker function of HCN4 channels in mice is confined to embryonic development and requires cyclic AMP[J].Embo.J,2008,27:692-703.

[16]MIRKO BARUSCOTTI,ANNALISA BUCCHI,CARLO VISCOMI,etal.Deep bradycardia and heart block caused by inducible cardiac-specific knockout of the pacemaker channel gene Hcn4[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2011,108(4):1705-1710.

Construction of human HCN4 gene eukaryon expression vector and its expression in HEK293 cells

XIE Xiangrong，ZUO Guangfeng，CHENG Lang，WANG Ming，CAO Heng，WANG Hegui，YU Youquan，YANG Hao，RUI Shibao，YANG Yuwen，TANG Shengxing

Department of Cardiology，The First Affiliated Hospital of Wannan Medical College，Wuhu 241001，China

Objective：To construct eukaryon expression vector of human HCN4 gene and transfect it into human embryonic kidney cells (HEK293).Methods：cDNA encoding human HCN4 gene was amplified by polymerase chain reaction,then digested with the restriction endonucleasesXho1 andEcoR1 and inserted into eukaryotic expressing vector pIRES2-EGFP that was transfected into HEK293 cells by Fugene HD.Whole-cell patch clamp indicated that hHCN4 gene was transfected into HEK293cells.Results：Double enzyme digestion and DNA sequencing confirmed that the HCN4 gene was completely accurate.GFP was observed in the transfected 293 cells under a fluorescent microscope.HCN4 mRNA expression was confirmed by RT-PCR.Whole-cell patch clamp recorded ionic currents of transfected HCN4.Conclusion：The pIRES-HCN4-EGFP eukaryon expression vector was successfully constructed,and pacemaker channel HCN4 gene heterologous expression was established.

HCN4 gene；transfection；heterologous expression；HEK293 cell

1002-0217(2016)06-0511-05

安徽高校省級自然科學研究項目(KJ2013Z340；KJ2016A728)；活性生物大分子研究安徽省重點實驗室自主研究課題(LAB201403，LAB201401)；安徽省大學生創(chuàng)新訓練計劃項目(AH201410368150)

2016-06-16

謝向榮(1981-)，男，主治醫(yī)師，講師，(電話)13966032437，(電子信箱)xxr200611@sina.com; 湯圣興，男，主任醫(yī)師，教授，碩士生導師，(電子信箱)tsx2229@163.com，通信作者.

R 541.2

A