姜黃素對LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)的抑制作用

郭敏芳，張慧宇，劉華

山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，山西大同 037009

姜黃素對LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)的抑制作用

郭敏芳，張慧宇，劉華

山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，山西大同 037009

目的 探討脂多糖 （LPS）誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生炎性反應(yīng)及姜黃素對它的抑制作用。方法 在2015年3月—2015年7月期間，分離培養(yǎng)了10只新生1～2 d的昆明小鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞，培養(yǎng)10 d后傳代分組，實驗分PBS對照組（n=6）、LPS刺激組（n=6）、LPS聯(lián)合姜黃素干預(yù)組（n=6）。ELISA檢測炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α的釋放。結(jié)果 與PBS組的IL-6（873.82±20.28）、IL-1β（680.62±10.35）和TNF-α（492.73±8.56）比較，LPS刺激組IL-6（1132.42±78.09）、IL-1β（821.87±14.33）和TNF-α（559.32±9.6）的分泌增加（P＜0.05）；姜黃素能顯著抑制 LPS誘導(dǎo)的IL-6（1014.79±52.08）、IL-1β（738.84±7.33）和 TNF-α（476.7±10.38）的分泌，與 LPS組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 姜黃素能抑制LPS激活星形膠質(zhì)細(xì)胞所致的炎性反應(yīng)。

脂多糖；星形膠質(zhì)細(xì)胞；姜黃素；炎性反應(yīng)

近年來研究發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞 （astrocyte AST）可以調(diào)節(jié)中樞免疫反應(yīng)，在多種神經(jīng)免疫性疾病的病理生理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。AST可以通過增加血腦屏障的通透性，分泌各種炎性因子和趨化因子，比如IL-6、IL-1β和TNF-α等，抑制軸突和髓鞘再生等機(jī)制促進(jìn)神經(jīng)免疫性疾病的嚴(yán)重程度[1]。姜黃素（curcumin Cur）是姜黃中色素類化合物的主要成分，具有多種生物活性，比如抗炎、抗氧化、清除自由基、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等藥理作用。有研究認(rèn)為，Cur可以通過調(diào)節(jié)NO合成和分泌，抑制NF-κB信號途徑等機(jī)制發(fā)揮抗炎作用[2]。

該次試驗在2015年3月—2015年7月期間，取了10只新生1～2 d昆明小鼠，原代培養(yǎng)的大腦皮質(zhì)AST，培養(yǎng)10 d后將細(xì)胞傳代分組，觀察Cur對LPS誘導(dǎo)的AST炎性反應(yīng)的影響。為臨床上應(yīng)用Cur治療神經(jīng)炎性病提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

10只清潔級飼養(yǎng)條件下的新生1～2 d昆明小鼠由山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心提供 （符合國際上擬定的動物公約）；LPS和Cur購自美國Sigma公司；ELISA試劑盒購自美國PeproTech公司；胎牛血清（FBS）和高糖DMEM均購自美國Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 原代小鼠AST培養(yǎng) 無菌條件下取出1～2 d昆明小鼠的大腦皮質(zhì)，剝除殘余腦膜及血管后用預(yù)冷的PBS液清洗3次，吹打制成單細(xì)胞懸液，離心后棄上清，沉淀用AST基本培養(yǎng)液(含10%FBS的高糖DMEM)重新懸浮。接種于預(yù)先用L-多聚賴氨酸（0.1mg/ml）包被的培養(yǎng)瓶中，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后換液去除組織碎片及未貼壁的細(xì)胞。以后每3 d換液1次直到細(xì)胞達(dá)到80%～90%的融合，然后置于恒溫?fù)u床，37℃、180轉(zhuǎn)/min離心18 h，去除上層的少突膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞[3]。然后胰酶消化傳代培養(yǎng)。將第2代AST以1.5× 106/mL的密度接種于6孔板中，24 h后換液，實驗分三組:PBS對照組、LPS（1 μg/mL）刺激組、LPS（1 μg/mL）聯(lián)合Cur（10 μmol/L）干預(yù)組。作用24 h后收集培養(yǎng)上清液冰凍保存。

1.2.2 ELISA法檢測AST上清液中炎性因子的含量收集各組AST培養(yǎng)上清液，按ELISA試劑盒說明書檢測細(xì)胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α，檢測各組樣品在450 nm的光密度值。參照各細(xì)胞因子的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出含量，以pg/mL表示其結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計方法

所得數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，計數(shù)資料均以（）表示。組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

結(jié)果表明，LPS誘導(dǎo)后AST分泌 IL-6、IL-1β和TNF-α明顯增加 (P＜0.05)；與LPS組相比，Cur干預(yù)組IL-6、IL-1β和TNF-α的分泌顯著下降 (表1，P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 Cur對LPS刺激AST釋放炎性因子的影響（）

表1 Cur對LPS刺激AST釋放炎性因子的影響（）

組別IL-6 IL-1β TNF-α PBS組（n=6）LPS組（n=6）LPS+Cur組（n=6）873.82±20.28 1132.42±78.09 1014.79±52.08 680.62±10.35 821.87±14.33 738.84±7.33 492.73±8.56 559.32±9.6 476.7±10.38

3 討論

在CNS的感染、損傷及多種病變過程中均伴有發(fā)生在腦實質(zhì)中的非典型炎性反應(yīng)，這種局部炎性反應(yīng)不涉及外周免疫系統(tǒng)，只有有限的白細(xì)胞浸潤，這一反應(yīng)過程稱為神經(jīng)炎性反應(yīng)[4]。雖然小膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為是存在于CNS的固有免疫細(xì)胞，但是AST可以通過清除細(xì)胞間的毒素和細(xì)胞碎片，調(diào)節(jié)免疫炎性反應(yīng)，保護(hù)神經(jīng)元免受內(nèi)源性和外源性毒性損傷。越來越多的證據(jù)證明AST在神經(jīng)炎性反應(yīng)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[5]。

LPS是存在于革蘭氏陰性菌外膜的一種內(nèi)毒素，是膿毒癥的觸發(fā)因素，常引起全身炎癥反應(yīng)，甚至引發(fā)多器官功能衰竭。有研究顯示，LPS可以誘導(dǎo)AST產(chǎn)生多種炎性細(xì)胞因子，比如NO、TNF-α、IL-1β、IL-17、IL-6和IL-8等[1]。并且LPS激活的AST可以引起NF-κB炎性反應(yīng)通路活化。NF-κB是一種功能多樣的核轉(zhuǎn)錄因子，是機(jī)體炎性、免疫和氧化應(yīng)激等反應(yīng)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[6]，比如，NF-κB可以調(diào)控TNF-α、IL-1β和誘導(dǎo)型環(huán)氧合酶(COX-2)的表達(dá)，而COX-2參與花生四烯酸類物質(zhì)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的合成，iNOS又能介導(dǎo)NO的釋放[7]。而且越來越多的證據(jù)表明這些物質(zhì)的釋放可導(dǎo)致與多種神經(jīng)性疾病有關(guān)的興奮毒作用，促進(jìn)神經(jīng)退行性疾病的炎癥病理過程，最終引起神經(jīng)元的死亡[8]。我們的結(jié)果顯示，LPS刺激可以引起AST分泌IL-6、TNF-α和IL-1β明顯增加。因此，尋找有效的抗炎藥物減少AST的激活，成了治療多種神經(jīng)退行性疾病的重要思路。

體內(nèi)實驗證實，Cur可以穿過血腦屏障并且保持高生物活性[9]。近年來Cur的神經(jīng)保護(hù)作用被廣泛研究，Cur對多種CNS的炎性和神經(jīng)退行性疾病具有預(yù)防和治療作用，比如阿爾茨海默病、心腦血管病、帕金森病等[10]。有研究表明，Cur能夠抑制LPS引起的小膠質(zhì)細(xì)胞激活及分泌炎性因子的增加，但是到目前為止，關(guān)于Cur抑制LPS激活 AST炎性反應(yīng)的研究則少有報道。該研究結(jié)果顯示，Cur可以抑制LPS刺激AST引起的炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α的高表達(dá)，進(jìn)一步證明Cur具有抗神經(jīng)炎性作用。

綜合以上實驗結(jié)果，LPS刺激AST誘導(dǎo)炎性因子分泌增加，從而導(dǎo)致神經(jīng)損傷。而Cur可以有效的抑制AST炎性反應(yīng)，為神經(jīng)炎癥患者的治療提供希望和幫助，但是其確切機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

[1]Correale J,Farez MF.The Role of Astrocytes in Multiple Sclerosis Progression[J].Front Neurol,2015，6（180）：1-12.

[2]Wang J,Zhu R,Sun D,et al.Intracellular Uptake of Curcumin-Loaded Solid Lipid Nanoparticles Exhibit Anti-InflammatoryActivities Superior to Those of Curcumin Throughthe NF-κB Signaling Pathway[J].J Biomed Nanotechnol,2015，11(3):403-415.

[3]辛崗，蘇蕓，張娟，等.星形膠質(zhì)細(xì)胞純化方法改良及脂多糖刺激后一氧化氮系統(tǒng)的表達(dá)[J].廣東醫(yī)學(xué)，2011，32(4): 429-431．

[4]Lee KM1,MacLean AG.New advances on glial activation in health and disease[J].World J Virol，2015，4(2):42-55.

[5]Rossi D.Astrocyte physiopathology:At the crossroads of intercellular networking,inflammation and cell death[J].Prog Neurobiol,2015(130):86-120.

[6]Brown JD,Lin CY,Duan Q,et al.NF-κB directs dynamic super enhancer formation in inflammation and atherogenesis[J]. Mol Cell.2014;56(2):219-31.

[7]Lee SH,Kwak CH,Lee SK,et al.Anti-Inflammatory Effect of Ascochlorin in LPS-Stimulated RAW 264.7 Macrophage Cells Is Accompanied with the Down-Regulation of iNOS, COX-2 and Proi nflammatory Cytokines throuthNF-κB, ERK1/2 and p38 Signaling Pathway[J].J Cell Biochem, 2016,117(4):978-987.

[8]Yang F,Lim GP,Begum AN,et al..Curcumin inhibits formation of amyloid beta oligomers and fibrils,binds plaques, and reduces amyloid in vivo[J].J Biol Chem.2005;280(7): 5892-5901.

[9]Fu W,Zhuang W,Zhou S,et al.Plant-derived neuroprotective agents in Parkinson's disease[J].Am J Transl Res.2015, 7（7）:1189-1202.

[10]Zhu HT,Bian C,Yuan JC,et al.Curcumin attenuates acute inflammatory injury by inhibiting the TLR4/MyD88/ NF-κB signaling pathway in experimental traumatic brain injury[J].J Neuroinflammation，2014(11):59.

In Astrocyte Stimulated with Lipopolysaccharide

GUO Min-fang，ZHAGN Hui-yu，LIU Hua
Department of histology and embryology,Medical School,Shanxi Datong University,Datong,Shanxi Province,037009 China

Objective To investigate the inflammatory response in astrocytes induced by lipopolysaccharide (LPS)and the inhibition of curcumin on inflammatory response.Methods And the PBS group IL-6(873.82±20.28)IL-1 beta(680.62± of 10.35)TNF-a and(492.73±8.56),LPS stimulated IL-6 group(1132.42±78.09),IL-1 beta(821.87±14.33),and TNF-(559.32±9.6)secretion increased(P＜0.05);curcumin could significantly inhibit the LPS induced IL-6(1014.79±52.08), interleukin 1 IL-1 (738.84±7.33)and tumor necrosis factor alpha(476.7±10.38)secretion,and LPS group compared to the difference was statistically significant(P＜0.05).Results Compared with IL-6（873.82±20.28）、IL-1β（680.62±10.35）and TNF-α（559.32±9.6）of PBS control group，LPS significantly increased the production of IL-6（1132.42±78.09）、IL-1β（821.87±14.33）and TNF-α（559.32±9.6）(P＜0.05).Cur treatment inhibited LPS-induced IL-6（1014.79±52.08）、IL-1β（738.84±7.33）and TNF-α（476.7±10.38）production compared with LPS stimulated group,the differences were statistically significant(P＜0.05).Conclusion Cur could inhibit LPS-induced inflammatory response in astrocytes.

Lipopolysaccharide;Astrocyte cell;Lipid;Inflammatory response

R28

A

1674-0742（2016）06（b）－0018-03

10.16662/j.cnki.1674-0742.2016.17.018

2016-03-18）

山西大同大學(xué)2011年度青年科學(xué)研究基金項目（NO.2011Q13）。

郭敏芳（1980－），女，山西廣靈人，碩士，講師，主要從事組織胚胎學(xué)的教學(xué)工作。