低溫層積過程中野鴉椿種子生理生化變化的研究

張莉梅 ，張子晗 ，喻方圓

（1.南京林業(yè)大學 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 林學院，江蘇 南京210037；2.北京林業(yè)大學 自然保護區(qū)學院，北京 100083）

低溫層積過程中野鴉椿種子生理生化變化的研究

張莉梅1，2，張子晗1，喻方圓1

（1.南京林業(yè)大學 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 林學院，江蘇 南京210037；2.北京林業(yè)大學 自然保護區(qū)學院，北京 100083）

通過對低溫層積不同時間野鴉椿種子內(nèi)含物質(zhì)變化情況，及不同播前預處理種子發(fā)芽情況的研究，得出如下結(jié)論：(1)野鴉椿種子不通過低溫層積處理無法萌發(fā)。(2)野鴉椿種子在層積過程中主要通過大分子油脂類物質(zhì)水解作種子萌發(fā)的物質(zhì)動員。(3)野鴉椿種子通過低溫層積的方法解除休眠的時間應控制在90～120 d內(nèi)，層積時間過長發(fā)芽率反而下降。這與同屬植物圓齒野鴉椿種子的萌發(fā)特性一致。(4)層積90～120 d時種子內(nèi)可溶性糖含量有較大幅度下降，同時在120 d時種子的發(fā)芽率達到峰值，表明可溶性糖是野鴉椿種子萌發(fā)的直接利用能源物質(zhì)。

野鴉椿種子；休眠；低溫層積；發(fā)芽；儲存營養(yǎng)物質(zhì)

野鴉椿Euscaphis japonica為省沽油科、野鴉椿屬落葉小喬木或灌木，是一種兼具工業(yè)、藥用及觀賞價值的樹種。由于其果實多被一層形狀奇特，色彩鮮艷的外種皮包被，結(jié)果豐碩而滿足園林綠化與美化功能[1]。同時野鴉椿根微苦，果辛溫，為藥品血脈通膠囊中的一味主要藥材[2]。干果有溫中理氣，消腫止痛的功效。主治胃痛、瀉疾等。根可祛風除濕,健脾調(diào)營?；芍晤^痛眩暈，是一種良好的中草藥材兼具優(yōu)良綠化樹種[3]，種子油可制皂[4]。

野鴉椿種子近圓形，直徑3～5 mm，內(nèi)種皮結(jié)構(gòu)木質(zhì)、堅硬，且具一層黑色膜質(zhì)外種皮，因此可能存在機械障礙和透性障礙及阻止內(nèi)源抑制物質(zhì)外滲。同時通過對相關(guān)文獻的查閱，野鴉椿屬種子具有明顯休眠特性，種子需催芽處理才能保證其發(fā)芽率[5-7]。因此我們在種子低溫層積催芽處理一段時間后展開相關(guān)試驗工作。

近年來在種子休眠與萌發(fā)影響方面的研究取得了很大進展，但這些研究很多都局限于一些模型植物，如：擬南芥、谷類植物、煙草等。大量的非模式植物，特別是一些自然萌發(fā)率低下的木本植物種子的休眠與萌發(fā)調(diào)節(jié)機制研究方面尚十分薄弱，急待開展深入研究[8]。而對于野鴉椿的研究主要集中于其藥理屬性方面，并未從野鴉椿種子萌發(fā)過程中內(nèi)含物質(zhì)變化機制的角度來探索萌發(fā)過程中內(nèi)含物質(zhì)與種子發(fā)芽率的關(guān)系。本文旨在探索打破野鴉椿種子休眠的方法及低溫層積過程中種子內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)變化情況。

1 材料與方法

1.1 材料來源

供試種子為2013年9月20日采自江蘇省鎮(zhèn)江市南京林業(yè)大學下蜀林場當年新鮮野鴉椿種子。補充實驗種子于2014年10月采自江蘇省鎮(zhèn)江市南京林業(yè)大學下蜀林場。

1.2 材料處理與測定

采取低溫層積加播前80℃溫水浸泡的方法對種子進行預處理。于2013年9月20日起對野鴉椿種子進行低溫層積處理，基質(zhì)為潔凈河沙，以體積比3份濕河沙與1份種子混合，在4℃條件下冷藏。試驗期間適時噴水，保證基質(zhì)處于濕潤狀態(tài)。當年12月20日第1次取樣，之后每30 d取1次樣，共取5次，于2014年4月20日取樣結(jié)束。取樣種子一部分立即做發(fā)芽試驗，另一部分用-70℃超低溫冰箱保存，用于生理指標測定。同時，實驗組于2014年9月第二次采種，以獲取未進行低溫層積處理時，種子的發(fā)芽情況與生理狀態(tài)。

1.2.1 野鴉椿種子發(fā)芽試驗

將不層積或不同層積時間的種子分為處理組和對照組。處理組種子用80 ℃溫水浸泡24 h，自然冷卻，對照組種子冷水浸泡。處理組與對照組均4次重復，每重復50粒種子。將種子置于發(fā)芽盒內(nèi)，基質(zhì)為濕河沙，于24 h光照、25 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1個月后統(tǒng)計發(fā)芽情況。期間適時噴水，使基質(zhì)保持濕潤狀態(tài)，為種子萌發(fā)提供充足的水分供應。

1.2.2 野鴉椿種子層積過程中內(nèi)含物質(zhì)含量測定

每次取樣后，測定種胚中可溶性糖含量、淀粉含量、粗脂肪含量以及可溶性蛋白質(zhì)含量。實驗中通過敲碎種殼而獲取完整種胚的方法，以避免種殼中營養(yǎng)物質(zhì)對實驗結(jié)果進行干擾。

可溶性糖含量和淀粉含量測定采用蒽酮比色法[9]、可溶性蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍法、粗脂肪含量測定采用索氏提取法[10]。

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007和SPSS18.0軟件進行圖表處理和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子發(fā)芽率的變化

種子的發(fā)芽率是對種子休眠研究的重要參照指標，其結(jié)果可較直觀的衡量種子休眠的解除程度。因此，本實驗用種子的發(fā)芽率來描述種子休眠的解除程度，試驗結(jié)果如表1。

表1 低溫層積不同時間+溫水浸泡處理對種子發(fā)芽率的影響Table 1 Effects of low temperature stritification at different length of time plus soaking with warm water treatment on germination rate of Euscaphis japonica seeds %

表1可見，在種子低溫層積解除休眠過程中，隨著層積時間的增加，對照組種子的發(fā)芽率很低，平均發(fā)芽率為0%。同時補充實驗種子中，不經(jīng)過低溫層積處理時，處理組即溫水浸泡亦不能使種子正常萌發(fā)。

通過對實驗數(shù)據(jù)的分析，低溫層積120 d時發(fā)芽率達峰值42%，而層積150、180和210 d時，發(fā)芽率分別下降了14.3%、61.9%和66.7%。

2.2 種子層積過程中生理生化變化

2.2.1 可溶性糖與淀粉含量的變化

由圖1可知，層積90～120 d，可溶性糖含量有小幅度下降，而在層積120～150d時，可溶性糖含量有大幅上升，150 d之后，可溶性糖含量小幅下降。低溫層積90～210 d這一時間段內(nèi)，種子內(nèi)可溶性糖含量的變化不大，此時可溶性糖含量相對穩(wěn)定。方差分析表明，不同層積時間種子可溶性糖含量差異極顯著（見表2）。

由圖2可知，在層積90～210 d的過程中，野鴉椿種子中淀粉含量逐漸小幅上升，而層積90～210 d期間，種子中淀粉含量相對穩(wěn)定。方差分析表明，不同層積時間種子淀粉含量差異不顯著（見表2）。

圖1 低溫層積過程中可溶性糖含量的變化Fig. 1 Change of soluble sugars during the low temperature strati fi cation

圖2 低溫層積過程中淀粉含量的變化Fig. 2 Change of starch during the low temperature strati fi cation

2.2.2 可溶性蛋白質(zhì)與粗脂肪含量的變化

由圖3可知，層積過程中，野鴉椿種子中可溶性蛋白質(zhì)的含量在90～150 d時大幅上升，而在150～210 d時小幅上升趨于平緩。90～150 d內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量上升了32%，而150～210 d內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量上升了2%。方差分析表明，不同層積時間種子可溶性蛋白質(zhì)含量差異極顯著（見表2）。

圖3 低溫層積過程中可溶性蛋白質(zhì)含量的變化Fig. 3 Change of soluble protein during the low temperature strati fi cation

由圖4可以看出，野鴉椿種子低溫層積過程中，粗脂肪含量呈下降趨勢，層積90 d時，粗脂肪含量占干重的10.89%；層積210 d時，粗脂肪含量占干重的8.43%。粗脂肪含量下降了22.59%。方差分析表明，不同層積時間種子粗脂肪含量差異顯著（見表2）。

圖4 低溫層積過程中粗脂肪含量的變化Fig. 4 Change of crude fat during the low temperature strati fi cation

表2 低溫層積過程中野鴉椿種子可溶性糖,淀粉,可溶性蛋白質(zhì)，粗脂肪含量方差分析?Table 2 ANOVA on content of soluble sugars, starch, soluble protein and crude fat during low temperatue stratification of Euscaphis japonica seeds

3 結(jié)論與討論

3.1 野鴨椿種子休眠的原因

休眠是種子植物抵抗外界不良環(huán)境的一種適應性，并且是隨著種子的發(fā)育、成熟而逐漸形成[11]。陳昕等[12]探索黃山花楸種子休眠影響因素的實驗中發(fā)現(xiàn)，種皮機械障礙是造成黃山花楸種子休眠的重要因素；洑香香等[13]實驗發(fā)現(xiàn)，山茱萸種子既有種皮的機械束縛作用，還存在胚的形態(tài)休眠，屬復雜的多因素綜合休眠。南方紅豆杉種子角質(zhì)化且堅硬致密，經(jīng)酸蝕處理能很快吸水膨大，而未處理時，吸水速度較慢[14-15]。在東京野茉莉種子休眠機制的探索中，休眠的原因主要包括種皮障礙、缺少萌發(fā)所需激素以及種皮、胚中存在萌發(fā)抑制物， 其中種皮障礙和抑制物的存在是限制種子萌發(fā)的首要因素[16]。野鴉椿種子種殼硬且濃，密度大，很難吸水膨脹，所以播種催芽難度很大[17]。未經(jīng)低溫層積處理的野鴉椿種子，無論是否通過80℃溫水浸種，均未能發(fā)芽，說明此時野鴉椿種子還不具備發(fā)芽條件，不能正常發(fā)芽。低溫層積處理210 d后不進行其他預處理情況下種子的發(fā)芽率仍極低，說明僅低溫層積處理并不足以解除野鴉椿種子的休眠現(xiàn)象。低溫層積后用溫水浸泡，能顯著提高種子發(fā)芽率。說明野鴉椿種子的種皮對種子的萌發(fā)存在較強的機械阻礙作用，但發(fā)芽率仍未達較高水平，因此推斷可能還存在其他抑制物質(zhì)抑制種子萌發(fā)。綜合來看，野鴉椿種子屬于綜合休眠類型，一是存在種皮障礙，二是存在抑制物質(zhì)。這與同屬植物圓齒野鴉椿種子的休眠類型一致[18]。

3.2 內(nèi)含物質(zhì)含量變化對種子萌發(fā)的影響

3.2.1 野鴉椿種子內(nèi)可溶性糖含量與淀粉含量變化

植物種子種胚中的淀粉、油脂是種子萌發(fā)過程中重要的儲能和供能物質(zhì)，而可溶性糖含量水平標志著源端的同化物供應能力，反映出庫端對同化物的轉(zhuǎn)化、利用能力[19]。張艷杰[14]實驗表明，南方紅豆杉種子層積過程中可溶性糖含量大體上呈現(xiàn)出先增加再減少的趨勢。本實驗數(shù)據(jù)顯示，可溶性糖含量在120～150 d時有較大幅度上升，90～120 d、150～180 d、180～210 d時，可溶性糖含量均下降，這可能是由于在120 d時，種子消耗大量的可溶性糖以萌發(fā)，在層積120～150 d期間種子內(nèi)淀粉、脂類等部分大分子儲藏物質(zhì)分解予以補充種子內(nèi)可溶性糖，通過代謝作用促進種子萌發(fā)，因此此階段可溶性糖含量有較大幅度的上升，同時層積120 d時，種子發(fā)芽率最高。

3.2.2 野鴉椿種子內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量變化

實驗中隨著低溫層積時間的增加，可溶性蛋白質(zhì)的含量也在上升，說明90～210 d這一階段大分子蛋白質(zhì)不斷水解為可溶性蛋白質(zhì)，為種子的萌發(fā)提供所需基本物質(zhì)。同時，90～150 d時，可溶性蛋白質(zhì)含量上升較快，幅度達32%；150～210 d時，含量上升較慢，幅度為2%。可能是由于90～150 d這一階段蛋白質(zhì)的水解更劇烈。

3.2.3 野鴉椿種子內(nèi)粗脂肪含量變化

野鴉椿種子隨著層積時間的增加，脂肪的總含量呈下降的趨勢，低溫層積90 d～210 d期間，粗脂肪含量下降了23%，結(jié)果表明，野鴨椿種子在低溫層積過程中，脂肪總含量不斷減少，這可能是為種子的萌發(fā)提供必要的能量物質(zhì)，如可溶性糖等小分子可直接利用物質(zhì)，在種子萌發(fā)層積過程中通過大分子油脂類物質(zhì)水解作萌發(fā)的物質(zhì)動員。張艷杰[14]實驗發(fā)現(xiàn)，南方紅豆杉種子在層積過程中粗脂肪含量呈逐漸下降趨勢。黃儒珠等[20]認為脂類物質(zhì)的分解、轉(zhuǎn)化和利用可能是南方紅豆杉種子休萌解除的關(guān)鍵。筆者認為脂類物質(zhì)的分解與轉(zhuǎn)化為野鴉椿種子解除休眠過程提供能量，是種子萌發(fā)過程中的主要供能物質(zhì)。野鴉椿種子含油量高，種子油可制皂[4]， 筆者認為，由于脂肪類物質(zhì)對于種子萌發(fā)起關(guān)鍵作用，種子油的利用應為及時采種及時制油[21]。

3.3 種子最適層積時間的探討及引起種子發(fā)芽率降低的因素

由表1可知，野鴉椿種子低溫層積120 d后，處理組種子的發(fā)芽率下降了14.3%，說明僅通過溫水浸種破除種皮障礙的方法來處理野鴉椿種子時，低溫層積時間應控制在90～120 d，層積時間不宜過長。同時，課題組在2013年進行的低溫層積打破同屬植物圓齒野鴉椿種子休眠的實驗中也發(fā)現(xiàn)，在低溫層積超過120 d時，圓齒野鴉椿種子的發(fā)芽率大幅下降[18]，因此筆者認為，層積時間的長度與野鴉椿屬植物種子萌發(fā)特性的關(guān)系有一定研究意義。值得一提的是，在低溫層積過程中，IAA、ABA、GA3、ZT等種子內(nèi)源激素含量的變化情況已在部分木本植物中進行了研究討論[22-24]，但野鴉椿屬種子的相關(guān)研究目前還是空白，而對于發(fā)芽率下降的問題，可通過研究內(nèi)源激素含量的變化來做進一步探究。

[1] 龔敏元.觀果樹種野鴉椿在泰寧縣的綠化應用[J].中國城市林業(yè),2014,12(5):36-38.

[2] 羅海羽,姚 默,申萬祥,等.野鴉椿屬藥學研究概況[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2012,40(12): 8462-8463.

[3] 葛玉珍.野鴉椿資源及其利用[J].中國野生植物資源,2004,23(5): 24-25.

[4] 龍春林,宋洪川.中國柴油植物[M].北京:科學出版社,2012: 158-159 .

[5] Bewley J D, Black M. Physiology of Development and Germination [M]. New York: Plenum Press, 1994.

[6] 歐 斌,李遠章.圓齒野鴉椿種子預處理和苗木生長規(guī)律及育苗技術(shù)研究[J].江西林業(yè)科技,2006(3):16-18.

[7] 覃嘉佳,龍云英.圓齒野鴉椿扦插繁殖技術(shù)[J].林業(yè)科技開發(fā),2007,21(3): 71-73.

[8] 程 鵬,王 平,孫吉康,等.植物種子休眠與萌發(fā)調(diào)控機制研究進展[J].中南林業(yè)科技大學學報,2013,33(5):52-58.

[9] 黃學林,陳潤政.種子生理試驗手冊[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1998.

[10] 劉正祥,張華新,劉 濤.省沽油種子油脂分析與功能特性評價[J].林業(yè)科學,2008,44 (2):48-54.

[11] 廖卓毅,錢存夢,馬秋月,等.烏桕種子成熟過程中種皮和胚乳超微結(jié)構(gòu)觀察[J]．南京林業(yè)大學學報:自然科學版,2014,38(6): 43-47.

[12] 陳 昕,曹珊珊,張紅星.黃山花楸種子休眠影響因素[J].東北林業(yè)大學學報,2010,38(7):5-7.

[13] 洑香香,周曉東,劉紅娜.山茱萸種子休眠機理與解除方法初探[J].中南林業(yè)科技大學學報,2013,33(4):7-12.

[14] 張艷杰. 南方紅豆杉種子休眠機理的研究[D].南京林業(yè)大學,2007.

[15] 魯定偉,周要全,李曙波,等.南方紅豆杉生物學、生態(tài)學特性及培育技術(shù)[J].經(jīng)濟林研究,2014,32(4):159-164.

[16] 許曉嵐,丁芳芳,李 翔,等.東京野茉莉種子休眠機制及其破除方法初探[J].西北植物學報, 2012,32(11):2270-2278.

[17] 楊燕凌.打破圓齒野鴉椿種子休眠及外植體選擇誘導實驗研究[D].福建農(nóng)林大學,2008.

[18] 張莉梅,張子晗,劉 源,等.低溫層積過程序中圓齒野鴉椿種子的生理生化變化[J].種子,2015,34(7):37-40.

[19] 郝麗麗,張存旭,楊 陽.栓皮櫟種胚發(fā)育過程中儲藏物質(zhì)積累變化研究[J].西北林學院學報,2011,26(4):128-131.

[20] 黃儒珠,郭祥泉,方興添,等.變溫層積處理對南方紅豆杉種子生理生化特性的影響[J]. 福建師范大學學報:自然科學版,2006, 22(2):95-98.

[21] 王湘南,陳永忠,伍利奇,等.油茶種子含油率和脂肪酸組成研究[J].中南林業(yè)科技大學學報,2008,28(3):11-17.

[22] 楊立學,王海南,張 琳,等.低溫層積過程中紫椴種子內(nèi)源激素含量的變化[J].經(jīng)濟林研究,2012,30(2):15-18.

[23] 李冬林,張亞楠,金雅琴,等.毛梾種子低溫層積過程中內(nèi)源激素的變化及其與發(fā)芽的關(guān)系[J].經(jīng)濟林研究,2014,32(3):36-41.

[24] 金雅琴,李冬林,黃雪方.梾木種子低溫層積過程中內(nèi)源激素含量的動態(tài)變化特征[J].西北植物學報,2014,34(11):2255-2261.

Biochemical and physiological changes of Euscaphis japonica seeds during the period of strati fi cation

ZHANG Li-mei1,2, ZHANG Zi-han1, YU Fang-yuan1
(1. Collaborative Innovation Center of Sustainable Forestry in Southern China, College of Forestry, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, Jiangsu, China; 2. School of Nature Reserve,Beijing Forestry University, Beijing 100083, China)

Changes of reserved nutrients in Euscaphis japonica seeds during the process of stratification were studied, and seed germination characteristics after different pretreatments were investigated in this paper. The results were shown as following: (1)Seeds are unable to germinate under no low temperature strati fi cation. (2)Seed germination of Euscaphis japonica were primary mobilized by hydrolysis of macromolecular grease-like substance in the process of strati fi cation. (3) The strati fi cation time should be controlled within the 90～120 d, longer strati fi cation time would make the rate of germination declined. The conclusions was the same as the result of Euscaphis konishii Hayata seeds, which belongs to the same genus as Euscaphis japonica seeds. (4)During the strati fi cation period of 90～120 d, the content of soluble sugar declined signi fi cantly, as the same time, seeds germination rate arrived at peak in the 120 d,showing that soluble sugar was directly used for energy source of seed germination.

Seeds of Euscaphis japonica; Dormancy; Low temperature strati fi cation; Germination; Reserved nutrients

S723.1+31.1

A

1673-923X(2016)11-0036-05

10.14067/j.cnki.1673-923x.2016.11.007

2015-05-09

江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目（PAPD）；國家林業(yè)局林業(yè)科技成果推廣項目“南方珍貴用材樹種苗木高效培育技術(shù)示范與推廣”

張莉梅，碩士研究生 通訊作者：喻方圓，教授；E-mail：fyyu@njfu.edu.cn

張莉梅，張子晗，喻方圓.低溫層積過程中野鴉椿種子生理生化變化的研究[J].中南林業(yè)科技大學學報，2016,36(11):36-40.

[本文編校：吳 毅]