NT-3轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞對腦缺血再灌注的機制研究

宗海斌， 尉 娜， 崔明星， 董玉珍

?

NT-3轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞對腦缺血再灌注的機制研究

宗海斌1， 尉 娜2， 崔明星3， 董玉珍3

目的 研究神經(jīng)營養(yǎng)素-3( neurotrophin-3，NT-3)轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)移植對腦缺血再灌注損傷的作用機制。方法 制作腦缺血再灌注損傷模型，將60只大鼠根據(jù)注射物不同分為3組：生理鹽水對照組、BMSCs組和NT-3+BMSCs組(n=20)，觀察不同時間3組大鼠的神經(jīng)學(xué)功能評分、腦組織光鏡觀察、TUNEL法檢測神經(jīng)元細胞的凋亡及丙二醛含量情況。結(jié)果 BMSCs+NT-3組移植后大鼠神經(jīng)學(xué)功能評分較BMSCs組低，而BMSCs組較NS組較低,兩組間比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；BMSCs+NT-3組腦組織光鏡觀察細胞形態(tài)學(xué)變化最輕；BMSCs組神經(jīng)元凋亡較NS組減少，BMSCs+NT-3組的神經(jīng)元凋亡數(shù)量較BMSCs組減少，兩組間比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；NS組丙二醛(MDA)含量明顯高于BMSCs組(P<0.05)；而BMSCs+NT-3轉(zhuǎn)染組明顯低于BMSCs組(P<0.05)。結(jié)論 大鼠BMSCs經(jīng)NT-3轉(zhuǎn)染后相互促進，移植于急性腦缺血再灌注損傷通過減緩神經(jīng)元細胞凋亡、降低丙二醛含量抑制自由基的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)進行修復(fù)。

神經(jīng)營養(yǎng)素-3； 骨髓間充質(zhì)干細胞； 神經(jīng)元凋亡； 腦缺血再灌注損傷； 機制

隨著老齡化社會和生活壓力增加，缺血性腦血管病成為臨床的主要疾病，具有高發(fā)病率、高致殘率、高致死率等特點，嚴(yán)重威脅人類的健康和生活質(zhì)量 。腦缺血再灌注損傷是指在損傷因素作用下經(jīng)一定時間缺血后得到血液再灌注繼而導(dǎo)致缺血，局部神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞缺血缺氧，發(fā)生腦組織中心性壞死出現(xiàn)明顯的功能障礙[1,2]。它是多種因素參與而引發(fā)的腦組織進行性、毀損性的破壞甚至出現(xiàn)不可逆性神經(jīng)元遲發(fā)性死亡的現(xiàn)象[3]。了解腦缺血再灌注的機制及時終止腦組織缺血后自毀性聯(lián)鎖反應(yīng)是改善繼發(fā)性損傷的理想策略。

神經(jīng)營養(yǎng)素-3(NT-3)能夠維持運動神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的存活，促進神經(jīng)-肌突觸的成熟，對缺血后神經(jīng)功能康復(fù)有促進作用[4]。但吸收率低，不能持續(xù)作用。骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)是具有多方向分化潛能的干細胞，能夠分泌多種生物活性物質(zhì)，促進血管、髓鞘神經(jīng)再生和突觸聯(lián)系，抑制細胞凋亡，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[5,6]。將NT-3基因轉(zhuǎn)染入BMSCs具有相互促進作用,但尚未見聯(lián)合用于治療腦缺血再灌注損傷的研究報道。本實驗將NT-3+BMSCs移植于缺血再灌注損傷腦組織中，觀察其對損傷腦組織的作用效果，探討其對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用和機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 將60只SD雄性大鼠(體重180～200 g)。以40 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，消毒、固定。將60只大鼠根據(jù)注射物不同隨機分為3組：分別于造模后30 min給予尾靜脈注射0.1 ml生理鹽水、1×106/ml BMSCs和NT-3+BMSCs(NT-3轉(zhuǎn)染入已分離、培養(yǎng)的BMSCs)分為NS組、BMSCs組、NT-3+BMSCs組 (n=20)。注射后動物常規(guī)分籠飼養(yǎng)。

1.2 試劑 NT-3質(zhì)粒(北京塞百盛生物工程有限公司合成提純)、納米微球轉(zhuǎn)染試劑盒(美國Sigma生物公司)； HE免疫組化染色(湖北武漢博士德生物工程有限公司)；凋亡細胞試劑盒(美國Sigma生物公司)。恒溫培育箱、離心機、冰凍切片機(德國Leica 公司)；熒光顯微鏡及成像系統(tǒng)(日本Nikon公司)；TJTY-300圖像分析軟件及光鏡(日本Philips 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠腦缺血再灌注模型制作 采用Zea Longa改良線栓法制備大鼠右側(cè)大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。取頸正中線切口，沿胸鎖乳突肌內(nèi)緣分離肌肉和筋膜，分離左側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內(nèi)動脈(ICA)，在 CCA 遠心端和近心端及ECA處掛線備用。用微動脈夾暫時夾閉ICA，近心端結(jié)扎CCA、ECA，然后在距CCA 分叉部4 mm剪一小口，將栓線插入到ICA，用繞在CCA遠心端的細線系牢栓線。從血管分叉處計算插入18 mm 時，系牢 CCA 遠心端的細線。阻斷血流2 h 后抽出栓線，再灌注時間為24 h。大鼠術(shù)后肌注慶大霉素預(yù)防感染。

1.3.2 神經(jīng)學(xué)功能評分 各組大鼠在術(shù)后6 h、12 h、24 h、48 h清醒后，進行神經(jīng)功能體征評分，1～3分的大鼠為造模成功，對于不符合條件的大鼠預(yù)以剔除。0分：正常，無任何神經(jīng)功能損傷;1 分:對側(cè)前肢蜷曲不能完全伸展，輕度神經(jīng)功能缺損;2分:行走時，大鼠向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈，為中度神經(jīng)功能缺損;3分:行走時身體向癱瘓側(cè)傾倒，重度神經(jīng)功能缺損;4分:意識喪失不能自發(fā)行走。 評分越高，說明神經(jīng)損傷障礙越嚴(yán)重。

1.3.3 HE染色 于注射分組后12 h、24 h麻醉大鼠，快速取各組大鼠大腦至培養(yǎng)皿中，置于體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛緩沖液中固定，脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片厚約2 μm的組織切片，經(jīng)HE染色，取互不重疊的5個視野在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.4 Tunel檢測神經(jīng)元凋亡 于移植后12 h、24 h、48 h，麻醉下取各組大鼠腦組織切片，用4%多聚甲醛溶液4 ℃固定2 h，置入30%蔗糖溶液過夜后采用恒冷箱-25 ℃切片法連續(xù)冰凍切片厚約3 μm的組織切片，做TUNEL熒光染色，按試劑盒說明操作，400倍視野熒光顯微鏡下觀察(藍色光激發(fā))，計算平均凋亡細胞數(shù)量。

1.3.5 腦組織丙二醛含量的測量 于移植后6 h、12 h、24 h、48 h稱取各組腦組織濕質(zhì)量100 mg，冰上勻漿后待測。采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛含量，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)學(xué)功能評分 于移植后6 h、12 h、24 h、48 h，大鼠清醒后，對其進行神經(jīng)行為學(xué)評價，NT-3+BMSCs組平均分?jǐn)?shù)最低，與BMSCs移植組和NS對照組比較差異有顯著性意義(P<0.05),而BMSCs移植組和NS對照組比較差異亦有顯著性意義(P<0.05)(見圖1)。

2.2 大鼠腦形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 12 h大鼠腦組織HE染色觀察見BMSCs+NT-3組腦組織細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本清晰，神經(jīng)元較大而多角，細胞核較清晰，胞漿豐富，空泡較少；NS組出現(xiàn)明顯的組織炎性細胞浸潤,組織充血，神經(jīng)元胞體脹大，胞核不清，胞漿中出現(xiàn)空泡狀改變，BMSCs介于兩組之間，腦組織病理變化明顯較NS組減輕,24 h后3組變化更加明顯(見圖 2)。

2.3 TUNEL法神經(jīng)元凋亡檢測 術(shù)后12 h、24 h、48 h NS組大鼠腦組織內(nèi)出現(xiàn)較多的染色陽性神經(jīng)元細胞凋亡，細胞核固縮，顆粒深染，形態(tài)不規(guī)則，而神經(jīng)元數(shù)量較少；BMSCs組神經(jīng)元凋亡較NS組減少，BMSCs+NT-3移植組的染色陽性的神經(jīng)元凋亡數(shù)量較少、染色強度弱；而細胞凋亡率NS組均高于其他組， BMSCs組顯著高于BMSCs+NT-3移植組,比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),3組隨著時間延長凋亡數(shù)量和凋亡率均逐漸增加(見表1)。

2.4 丙二醛含量活性測定 缺血再灌注6 h、12 h、24 h、48 h NS注射組大鼠腦組織組織中丙二醛(MDA)含量明顯高于BMSCs組(P<0.05)；而BMSCs+NT-3轉(zhuǎn)染組MDA含量明顯低于BMSCs組,兩組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表2)。

表1 各組神經(jīng)元細胞凋亡率檢測結(jié)果比較 ±s)

BMSCs+NT-3組與NS組相比*P<0.05;與BMSCs組相比#P<0.01

表2 各組大鼠不同時間點MDA含量的比較±s,n=20)

BMSCs+NT-3組與NS組相比*P<0.05;與BMSCs組相比#P<0.01

圖1 各時間點3組大鼠腦組織神經(jīng)學(xué)功能評分比較

A:12 h NS組；B:12 h BMSCs組；C:12 h BMSCs+NT-3組成；D:24 h NS組；E:24 h BMSCs組；F: 24 h BMSCs+NT-3組

圖2 12 h、24 h各組腦組織HE染色比較×400

3 討 論

腦缺血再灌注后，氧自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、鈣離子超載、興奮性氨基酸、前列腺素等因素在損傷機制中起著重要作用，氧化應(yīng)激大量自由基的產(chǎn)生可氧化細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸，導(dǎo)致細胞損傷、凋亡。缺血時間的不同決定再灌注后腦組織功能是否可以恢復(fù)[7]。BMSCs 可在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)下跨胚層分化為具有神經(jīng)元或膠質(zhì)細胞表型的細胞，能分泌大量有益于神經(jīng)再生的營養(yǎng)因子，可促進軸突再生和髓鞘形成、遷移的分子保護損傷神經(jīng)細胞存活并促進其再生而達到修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)的作用[8]。研究表明：BMSCs在一定條件下可跨胚層誘導(dǎo)分化為外胚層的神經(jīng)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元樣細胞，且部分具有神經(jīng)元的電生理特性。并且移植BMSCs通過抑制氧自由基的生產(chǎn)來促進其他組織缺血再灌注損傷的恢復(fù)[9,10]。

Ito等[11,12]實驗研究表明利用DNA測序方法檢出脊髓內(nèi)存在EGF受體(EGFR)、FGF受體(FGFR)等受體，可以促進BMSCs的增殖,當(dāng)以上生長因子單獨或聯(lián)合作用于BMSCs時,可以與BMSCs的表面受體結(jié)合,進一步激活一系列的胞內(nèi)反應(yīng),促使BMSCs向神經(jīng)細胞分化。NT-3通過與這些受體的胞外區(qū)結(jié)合，將神經(jīng)細胞存活和分化的信號傳遞到細胞內(nèi)部，促進BMSCs向神經(jīng)元細胞的增殖與分化，可以激活MAPK途徑,促進細胞外基質(zhì)蛋白的分泌，對神經(jīng)元細胞的成熟和存活起到非常重要的作用。腦缺血再灌注損傷后BMSCs提高神經(jīng)系統(tǒng)的血管再生可以促進損傷神經(jīng)元的恢復(fù)，減輕腦缺血的后遺癥，改善腦缺血后康復(fù)的臨床效果[13,14]。

實驗研究證實腦缺血再灌注后引起一系列損傷性生化改變將導(dǎo)致細胞內(nèi)鈣聚集，氧自由基清除系統(tǒng)受到破壞或抑制含量增高，大量自由基的產(chǎn)生是繼發(fā)腦組織損傷的重要病理生理環(huán)節(jié)[15]。丙二醛是脂質(zhì)過氧化最終產(chǎn)物,對膜蛋白受體有很強的破壞作用,測定丙二醛含量的變化一定程度上可以反映組織細胞抗氧化能力，表明機體受自由基攻擊的MPO嚴(yán)重程度，是判斷腦組織內(nèi)自由基清除的檢測指標(biāo)之一[16]。通過實驗顯示:NS注射組大鼠缺血再灌注腦組織中MDA含量明顯高于BMSCs組；經(jīng)BMSCs+NT-3轉(zhuǎn)染后，丙二醛含量明顯低于BMSCs組，兩組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明BMSCs經(jīng)NT-3轉(zhuǎn)染后降低機體內(nèi)MDA含量，即提高了清除氧自由基的能力明顯增強,可以有效的保護腦組織內(nèi)細胞受到缺血再灌注損傷。

通過將NT-3+BMSCs移植于腦組織缺血再灌注檢測術(shù)后不同時間NT-3+BMSCs組神經(jīng)學(xué)功能評分最低，與BMSCs移植組和NS對照組比較差異有顯著性意義(P<0.05),而BMSCs組功能評分比NS組減低，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。BMSCs+NT-3轉(zhuǎn)染組腦組織光鏡觀察細胞形態(tài)學(xué)變化最輕；而神經(jīng)元凋亡數(shù)量較少、染色強度弱,肌細胞凋亡率NS組均高于其他組，BMSCs組顯著高于BMSCs+NT-3移植組,比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),3組隨著時間延長凋亡數(shù)量和凋亡率均逐漸增加。結(jié)果顯示：BMSCs能夠明顯減少血中MDA含量 ,并且促進神經(jīng)元細胞增殖減少凋亡,而經(jīng)NT-3轉(zhuǎn)染后的BMSCs的作用更強，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

因此,本研究認(rèn)為BMSCs對腦缺血再灌注損傷有修復(fù)神經(jīng)、阻止神經(jīng)元凋亡和清除氧自由基的作用，經(jīng)NT-3轉(zhuǎn)染后可以相互增強作用,BMSCs+NT-3通過抑制自由基的脂質(zhì)過氧化反應(yīng),促進組織細胞抗氧化能力、減緩神經(jīng)元細胞凋亡達到了對腦缺血再灌注損傷的保護作用。

[1]Chen YL,Wu XM,Yu SS,et al.Neuroprotection of tanshinone IIA against cerebral ischemia/reperfusion injury through inhibition of macrophage migration inhibitory factor in rats[J].PloS One,2012,7(6):e40165 .

[2]Manzanero S,Santro T,Arumugam TV.Neuronal oxidative stress in acute ischemic stroke: sources and contribution to cell injury[J].Neurochem Int,2013,62(5):712-718.

[3]Wolfrum S,Nienstedt J,Heidbreder M,et al.Calcitonin gene related peptide mediates cardioprotection by remote preconditioning[J].Regul Pept,2005,127(1-3):217-224.

[4]Brunella C,Oliver AS,Andrea C,et al.Neurotrophin-3 is a novel angiogenic factor capable of therapeutic neovascularization in a mouse model of limb ischemia[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2010,30(6):1143-1150.

[5]Wang J,Ding F,Gu Y,et al.Bone marrow mesenchymal stem cells promote cell proliferation and neurotrophic function of Schwann cells in vitro and in vivo[J].Brain Res,2009,12(1):7-15.

[6]Dong YZ,Yang LB,Yang L,et al.Transplantation of neurotrophin-3-transfected bone marrow mesenchymal stem cells for the repair of spinal cord injury[J].Neural Regeneration Research,2014,9(16):1520-1524.

[7]Lopez MS,Dempsey RJ,Vemuganti R.Resveratrol neuroprotection in stroke and traumatic CNS injury[J].Neurochem Int,2015,89(1):75-82.

[8]Gou S,Wang C,Liu T,et al.Spontaneous differentiation of murine bone marrow-derived mesenchymal stem cells into adipocytes without malignant transformation after long-term culture[J].Cells Tissues Organs,2010,191(3):185-192.

[9]Brohlin M,Mahay D,Novikov LN,et al.Characterisation of human mesenchymal stem cells following differentiation into Schwann cell-like cells[J].Neurosci Res,2009,64(1):41-49.

[10]Cantinieaux D,Quertainmont R,Blacher S,et al.Conditioned medium from bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves recovery after spinal cord injury in rats:an original strategy to avoid cell transplantation[J].PLoS One,2013,8(8):e69515.

[11]Ito T,Itakura S,Todorov I,et al.Mesenchymal stem cell and islet co-transplantation promotes graft revascularization and function[J].Transplantation,2010,89(12):1438-1445.

[12]Komatsu K,Honmou O,Suzuki J,et al.Therapeutic time window of mesenchymal stem cells derived from bone marrow after cerebral ischemia[J].Brain Res,2010,1334(1):84-92.

[13]Gong Y,Wang H,Xia H.Stable transfection into rat bone marrow mesenchymal stem cells by lentivirus-mediated NT-3[J].Mol Med Rep,2015,11(1):367-373.

[14]尉 娜,王建平,申小龍,等.腺苷預(yù)處理對大鼠腦缺血再灌注損傷后VEGF 的表達[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志,2014,31(2):107-110.

[15]Hu X,Zhang M,Leak RK,et al.Delivery of neurotherapeutics across the blood brain barrier in stroke[J].Curr Pharm Des,2012,18(25):3704-3720.

[16]Shi LL,Chen BN,Gao M,et al.The characteristics of therapeutic effect of pinoccenbrin in transient global brain ischenia/reperfusion rats[J].Life Sci,2011,88(11/12):521-528.

The mechanisms of neurotrophin-3 transferred into bone marrow mesenchymal stem cells on cerebral ischemia-reperfusion injury

ZONG Haibin,WEI Na,CUI Mingxing,et al.

(Skill Laboratory of Basic Medical Science of Xinxiang Medical College，Xinxiang 453003 China)

Objective To observe the mechanisms of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) by transferred neurotrophin-3 with nanoparticle repaired cerebral ischemia-reperfusion injury of adult rat.Methods BMSCs isolated primarily were transfered NT-3 with nanoparticle carrier,the 60 adult rats of cerebral ischemia-reperfusion injury model were divided into group of NS group、BMSCs group and BMSCs+NT-3 transplanted.The nerve function was evaluated at the different times.The cross section of brain tissue and neuron cell apoptosis were observed after being transplanted into cerebral ischemia- reperfusion injury.Levels of malondialdehyde (MDA) was analyzed.Results After BMSCs+NT-3 treated brain cerebral ischemia-reperfusion injury,the score of nerve function was significantly lower than those of BMSCs,and BMSCs group showed lower than NS group,the differences were statistically significant(P<0.05);HE staining showed cell structure significantly improved and nuclear structure became clear after BMSCs+NT-3 treated;TUNEL study showed apoptosis cells were significantly decreased of BMSCs+NT-3 group compared to other groups,the difference was statistically significant(P<0.05).In NS group the contents of MDA showed significantly higher than BMSCs group at the same time,BMSCs+NT-3 group was lower than BMSCs group,there were statistical significance (P<0.05).Conclusions BMSCs by transferred NT-3 could be induced each other,which transplanted into cerebral ischemia-reperfusion injury model,can repair brain tissue by alleviating neuron cells apoptosis and inhibiting the lipid peroxidation of free radicals by decreasing the contents of MDA.

Neurotrophin-3; Bone mesenchymal stem cells; Neuron cells apoptosis; Cerebral ischemia-reperfusion injury; Mechanisms

1003-2754(2016)10-0912-04

2016-06-29；

2016-09-29

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機能實驗室，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453003；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨外二科，河南 衛(wèi)輝 453100)

董玉珍，E-mail：394331568@qq.com

R7443.3

A