GCs對慢性低灌注大鼠海馬腦組織IL-2及KRT 6A蛋白表達影響的實驗研究

張艷梅， 李 攀， 朱潤秀

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GCs對慢性低灌注大鼠海馬腦組織IL-2及KRT 6A蛋白表達影響的實驗研究

張艷梅， 李 攀， 朱潤秀

目的 采用免疫組化及蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)觀察慢性腦缺血大鼠海馬腦組織IL-2及蛋白表達產(chǎn)物變化。方法 BCAO建立慢性腦缺血大鼠模型,隨機分為假手術(shù)組、模型組，GCs低中高劑量組及陽性藥物(奧拉西坦)對照組。免疫組化ABC法檢測海馬腦組織IL-2表達改變；蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析鑒定慢性腦缺血大鼠模型及GCs干預(yù)后差異蛋白表達改變。結(jié)果 (1)模型組大鼠海馬腦區(qū)IL-2表達量顯著上升(2.15±0.45)，與假手術(shù)組相比差異顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),GCs低中高劑量干預(yù)后IL-2表達水平出現(xiàn)顯著上升，分別是(2.01±0.54、1.76±0.61、1.56±0.31)(P<0.01，P<0.05);(2)研究發(fā)現(xiàn)，慢性腦缺血大鼠海馬腦組織Ⅱ型細胞骨架蛋白(typeⅡ cytoskeletal 6A，KRT 6A)表達發(fā)生顯著下降。結(jié)論 慢性腦缺血病理過程中存在炎性相關(guān)蛋白的活化，推測其病理生理機制與炎癥反應(yīng)及細胞活化密切相關(guān)。

慢性腦缺血； IL-2; Ⅱ型細胞骨架蛋白

慢性腦缺血是指機體腦組織血流長期處于低灌注病理狀態(tài)，這一病理狀態(tài)在眾多神經(jīng)系統(tǒng)變性病的病理過程中扮演重要的作用。大量臨床證據(jù)表明認知功能障礙(VCI)乃至癡呆(dementia)患者發(fā)病過程中都存在腦組織低灌注的特征性病理改變；但是長期以來，對慢性低灌注所致腦組織損害的分子病理改變認識較為局限。文獻查證顯示在機體慢性低灌注狀態(tài)時普遍存在免疫炎癥反應(yīng)[1]；前期研究表明肉蓯蓉苷(GCs)顯著改善癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶缺陷，然而GCs是否能夠?qū)δX組織低灌注狀態(tài)的免疫炎癥反應(yīng)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用仍需進一步研究探討?；谝陨涎芯勘尘?，我們采用BCAO誘發(fā)慢性腦缺血大鼠模型并給予GCs干預(yù)，觀察炎性相關(guān)蛋白IL-2表達，通過比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)手段對大鼠海馬腦組織進行分析，從而探討慢性腦組織低灌注發(fā)生發(fā)展過程中可能的關(guān)鍵蛋白，為闡明慢性腦缺血在神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病發(fā)病機制中的作用提供理論依據(jù)，同時旨在尋找GCs調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)過程的依據(jù)，并尋找防治的關(guān)鍵靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 老齡Wistar大鼠，實驗動物使用許可證號：SYXK(鄂)2008-030，隨機數(shù)字表法分為6組：假手術(shù)組10只、模型組12只、GCS低中高干預(yù)組各10只、陽性藥物對照組10只。所有實驗過程嚴格遵循科技部《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》[2]。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及GCs干預(yù) 根據(jù)文獻采用BCAO(永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈)制作慢性腦缺血模型[3]：術(shù)前禁食12 h，禁水4 h，大鼠腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉；永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈(common carotid arteries，CCA)制備慢性腦缺血模型。假手術(shù)組僅暴露雙側(cè)頸動脈后縫合。造模過程中及之后死亡者予以剔除并立即補充。

將大鼠隨機分為對照組、BCAO模型組、GCs治療組(高劑量治療組10 mg/kg/d、中劑量治療組5 mg/kg/d、低劑量治療組2.5 mg/kg/d)，給藥方式腹腔注射，調(diào)整藥物濃度為給藥1 ml/只。模型組動物腹腔注射等體積生理鹽水。連續(xù)治療14 d后，進行Morris水迷宮試驗及免疫組化實驗。

1.2.2 Morris水迷宮定位航行實驗 Morris水迷宮由圓形有機玻璃水池、平臺、自動記錄系統(tǒng)、供水系統(tǒng)4部分組成。水池被等分成4個象限，其中1個象限正中放置1個玻璃平臺。上方裝有攝像機并與計算機連接，實時動態(tài)記錄大鼠游泳軌跡。定位航行試驗每天兩次，歷時5 d，跟蹤記錄大鼠游泳軌跡。將大鼠面向池壁，分別從4個入水點下水，記錄逃避潛伏期；2 min 以上未找到平臺，潛伏期記為120 s。訓(xùn)練時實驗者可以幫助大鼠找到平臺，并停留10 s。

1.2.3 大鼠海馬腦組織IL-2的表達 術(shù)后2 w斷頭處死大鼠并完整剝離鐮狀海馬腦組織，冰浴操作。免疫組化ABC法操作步驟如下[4]:(1)取材、切片常規(guī)脫臘至水；(2)濕盒37 ℃一抗孵育2～3 h；(3)二抗孵育；(4)DAB顯色；(5)染色后脫水風干。Olympus顯微鏡觀察，拍照?；叶葯z測軟件計算灰度表達。

1.2.4 大鼠海馬腦組織蛋白樣本制備 同免疫組化實驗條件取大鼠海馬腦組織，液氮研磨、4 ℃，12000×g，20 min，收集上清。超聲破碎核酸，加入裂解液振蕩混勻。同前離心條件，棄上清取蛋白質(zhì)團塊；Bradford法蛋白定量。

1.2.5 雙向電泳分離蛋白質(zhì) 固相pH等電聚焦電泳(isoelectric focusing,IEF)：大鼠海馬腦區(qū)總蛋白1200 μg與水化液(8 mol尿素、2%CHAPS、2%IPG Buffer、20mmol DTT)及IPG緩沖液混合。加入相應(yīng)IPG膠槽中于EttanIPGphorⅡ等電聚焦電泳儀進行等電分離；垂直SDS-PAGE：IPG膠條經(jīng)在平衡液Ⅰ、Ⅱ中分別平衡15 min，轉(zhuǎn)移至12.5%SDS-PAGE凝膠上端瓊脂糖封膠后，進行垂直電泳，直至溴酚藍到達膠的底端(垂直電泳條件2 W 45 min、17 W 4 h)。分析膠進行硝酸銀染色，制備膠進行考馬斯亮藍染色。2-DE圖像掃描系統(tǒng)掃描凝膠成像，Image Master 2D platinum5.0軟件對凝膠圖像進行比較分析。

1.2.6 質(zhì)譜分析及鑒定 凝膠上切割差異表達蛋白質(zhì)點、脫色、酶解，將蛋白質(zhì)分解為短鏈肽段。除鹽肽段與基質(zhì)混合后點樣于鋼靶上，ABI4700 MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜儀進行肽段質(zhì)譜信息分析并獲得肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)。Mascot公司軟件(http://www.matrixscience.com)搜索IPI_mouse數(shù)據(jù)庫，尋找相匹配的蛋白質(zhì)。

2 結(jié) 果

2.1 Morris水迷宮逃避潛伏期的檢測 大鼠逃避潛伏期是代表學(xué)習(xí)記憶能力的主要指標，潛伏期越長，記憶功能越差。本項研究結(jié)果顯示模型組大鼠潛伏期明顯延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01) 。而經(jīng)過GCs干預(yù)后平均潛伏期均明顯縮短。說明GCs具有顯著的改善大鼠學(xué)習(xí)記憶的作用(見圖1)。

2.2 IL-2半定量分析 各組IL-2免疫組化圖(見圖2)，并應(yīng)用灰度計算軟件對每個標本進行檢測。以假手術(shù)組灰度值記為(1.00±0.18)，各組IL-2灰度值分別是模型組(2.15±0.45)、GCs低劑量(2.01±0.54)、GCs中劑量(1.76±0.61)、GCs高劑量(1.56±0.31)。經(jīng)t檢驗分析發(fā)現(xiàn)差異顯著(P<0.05或P<0.01)。5 cells/5個視野，取平均值代表1例標本灰度值。統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)模型組IL-2高表達，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而經(jīng)過GCs干預(yù)后，IL-2表達隨GCs梯度濃度上升依次發(fā)生表達下降。提示在慢性低灌注狀態(tài)時炎癥反應(yīng)參與其中；GCs能顯著改善上述病理過程中的炎癥反應(yīng)。

2.3 海馬腦區(qū)蛋白雙向電泳結(jié)果 Image Master 2D platinum5.0圖像分析軟件掃描凝膠并獲得雙向凝膠電泳圖，研究表明Ⅱ型細胞骨架蛋白(keratin,type Ⅱ cytoskeletal 6A KRT 6A)表達顯著下降，下圖綠線圈出的蛋白點即為KRT6A(見圖3)。

2.4 差異蛋白質(zhì)譜分析鑒定結(jié)果 分析膠與制備膠上蛋白點進行匹配分析，發(fā)現(xiàn)差異蛋白點后再切取該蛋白點進行質(zhì)譜信息的鑒定，Mascot distiller過濾基線峰、識別信號峰。Mascot軟件搜索IPI_mouse數(shù)據(jù)庫，尋找相匹配的蛋白質(zhì)。質(zhì)譜鑒定的蛋白質(zhì)信息如下：MALDI-TOF MS鑒定出的蛋白質(zhì)名稱為Ⅱ型細胞骨架蛋白(type Ⅱ cytoskeletal 6A，KRT 6A)，其在NCBI中的標號為gi|155369696，在電泳凝膠上的編號為114。研究發(fā)現(xiàn)與對照組相比，經(jīng)GCs干預(yù)后KRT 6A表達值下降1.58倍。

圖1 上圖為大鼠Morris水迷宮游泳路線圖；下圖為逃避潛伏期統(tǒng)計圖

圖2 對照組、模型組及GCs各干預(yù)組IL-2免疫組化圖；標尺：22.9 mm胞漿呈棕黃染色為IL-2蛋白

圖3 左圖為KRT6A凝膠上的截圖，綠線圈出的既是差異蛋白點。黃色圖標表示GCs干預(yù)-組，紅色圖標表示模型組

3 討 論

眾所周知，腦組織低灌注是以認知功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的一大類神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的特征性病理改變；文獻檢索查證表明腦組織慢性低灌注狀態(tài)時存在免疫炎癥反應(yīng)的病理生理過程[1,5]，但其確切機制仍不清楚。因此本研究擬采用蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)技術(shù)這一高通量分析技術(shù)手段對慢性腦缺血大鼠海馬腦組織凋亡差異蛋白深入探討，為闡明慢性腦缺血在神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病發(fā)病機制中的作用提供理論依據(jù)。研究中我們發(fā)現(xiàn)IL-2在海馬腦組織中表達異常升高，經(jīng)過GCs干預(yù)后，IL-2表達水平出現(xiàn)不同程度的下降，提示免疫炎癥反應(yīng)參與腦組織慢性低灌注狀態(tài)。GCs具有顯著提高大鼠水迷宮實驗逃避潛伏期的作用，推測其腦組織保護作用可能涉及抑制機體免疫炎癥反應(yīng)。

KRT家族包括一大類細胞支架蛋白，且不同細胞表達不同類型KRT[6,7]，主要分為I型與Ⅱ型KRT，KRT 6A蛋白為其中一種Ⅱ 型骨架蛋白。KRT 6A蛋白可以和其他角蛋白相互作用形成角蛋白細絲，這些細絲可以形成稠密的網(wǎng)絡(luò)，從而可以給組織提供支撐[8,9]。此外，KRT6A蛋白與其他一些角蛋白還參與創(chuàng)傷修復(fù)[10]。而在本研究中通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)經(jīng)GCs干預(yù)后，Ⅱ型細胞骨架蛋白(type Ⅱ cytoskeletal 6A，KRT 6A)表達顯著下降1.58倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，據(jù)此我們推測GCs可能通過抑制免疫炎癥反應(yīng)，抑制炎癥增生從而達到修復(fù)保護神經(jīng)元的作用，然而關(guān)于其改善認知功能詳盡的分子機制仍有待進一步深入研究。

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[2]《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》.中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部,2006,9:30.

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Experimental research between IL-2 and KRT6A protein expression in rats after chronic cerebral hypoperfusion

ZHANG Yanmei,LI Pan,ZHU Runxiu.

(Department of Neurology,The people’s Hospital of Inner Monogolia，Hohhot 014000,China)

Objective To observe the IL-2 and the protein expression of the hippocampal tissue in chronic cerebral ischemia rats by immunohistochemical and proteomics techniques.Methods Establishing the model of chronic cerebral ischemia rats by BCAO,and were randomly divided into control group,model group,GCs low、middle、high dosage group.IL-2 expression was detected using immunohistochemical method.Proteomics technology identified the difference expression protein of chronic cerebral ischemia rats and the intervention rats by GCs.Results (1)The expression of IL-2 in hippocampal brain of model rats markedly increased (2.15±0.45);however,IL-2 expression level significantly rise after intervention by GCs,respectively (2.01±0.54、1.76±0.61、1.56±0.31)(P<0.01，P<0.05).(2)The typeⅡ cytoskeleton protein (typeⅡ cytoskeletal 6A) was founded significantly decreased after intervention by GCs.Conclusion Immuno-inflammatory may be exist in chronic ischemic.Speculated that the pathophysiological mechanism is closely related to inflammatory reaction and cell activation.

Chronic cerebral ischemia; IL-2; Type Ⅱ cytoskeletal 6A

1003-2754(2016)10-0909-03

2016-06-14；

2016-09-29

國家自然科學(xué)基金(30960520)，內(nèi)蒙自然科學(xué)基金(20080404MS1114、2016MS0837)

(內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000)

朱潤秀，E-mail：zhurunxiu@163.com

R743.3

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