15d-PGJ2對神經元氧糖剝奪/復氧損傷的影響

李 鍵， 馮 江， 段 宇， 徐 鋒， 毛仁玲

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15d-PGJ2對神經元氧糖剝奪/復氧損傷的影響

李 鍵1， 馮 江1， 段 宇1， 徐 鋒2， 毛仁玲1

目的 觀察過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)激動劑15d-PGJ2對神經元氧糖剝奪/復氧(OGD/R)損傷的影響，并探討其可能的作用機制。方法 采用原代培養(yǎng)的小鼠胎鼠大腦皮質神經元，建立OGD/R損傷模型。將培養(yǎng)的神經元細胞進行分組，Western blot檢測各組神經元內LC3-1、LC3-Ⅱ、Bcl-2、Beclin1、AMPK、mTOR及p70S6K等蛋白的表達；MTT法檢測細胞活性，乳酸脫氫酶(LDH)漏出率測定細胞毒性。結果 OGD/R損傷6 h、12 h及24 h后神經元LC3-Ⅱ、Beclin 1表達明顯增高，而p62表達持續(xù)下降，神經元的生存率明顯下降，LDH漏出率增加。15d-PGJ2可顯著降低LC3-Ⅱ和Beclin 1表達水平，改善神經元的生存率及降低LDH的漏出率。OGD/R后Bcl-2的蛋白表達水平均明顯減少，而Beclin 1表達則顯著增加。15d-PGJ2預處理顯著增加OGD/R 24 h的Bcl-2表達量。利用Bcl-2 siRNA或scRNA轉染神經元細胞發(fā)現(xiàn)，Bcl-2 siRNA可消除15d-PGJ2對OGD/R后各時間點的抑制效應。結論 15d-PGJ2能夠有效地對神經元OGD/R損傷起到保護作用，其機制可能是通過上調Bcl-2的表達進而抑制自噬的發(fā)生實現(xiàn)的。

缺血再灌注； 自噬； 過氧化物酶體增殖物激活受體γ； Bcl-2； Beclin1

缺血性腦卒中已成為嚴重威脅人類健康的臨床常見病，在中國，缺血性腦卒中約占腦卒中的80%[1]。目前治療手段仍以早期溶栓為主，但溶栓時間窗短及缺血再灌注損傷等因素影響溶栓療效及預后。如何在腦組織缺血缺氧的耐受時間窗內，給予有效的神經細胞保護，已成為減輕腦缺血再灌注損傷的一個熱門話題。

自噬是細胞的一種自我降解途徑，可通過膜囊泡包裹的方式將蛋白質、RNA、老化受損細胞器等轉運至溶酶體降解，從而維持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)[2]。目前已有研究表明，腦缺血后，能量感應、內質網缺氧及氧化應激等均可刺激神經元自噬[3]，且在缺血再灌注過程中，細胞的自噬與Beclin 1的表達上調有關[4]。Beclin 1基因的表達可被Bcl-2家族的多域蛋白所抑制，過氧化物酶增殖物激活受體反應元件(perosisome proliferater-activated receptor response element，PPRE)激動劑可通過上調Bcl-2的表達，從而防止神經元的缺血再灌注損傷[5]。因此，本研究旨在觀察過氧化物酶增殖物激活受體-γ(perosisome proliferater-activated receptor， PPAR-γ)激動劑15-Deoxy-Delta-12,14-prostaglandin J2(15d-PGJ2)對氧糖剝奪/復氧(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)的影響，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 制備氧糖剝奪/復氧(OGD/R)的細胞模型及分組

1.1.1 制備氧糖剝奪/復氧(OGD/R)的細胞模型 妊娠15 d的C57BL/6J雌性小鼠(由南京醫(yī)科大學動物實驗中心提供)，予10%水合氯醛1 ml腹腔注射麻醉后，切開孕鼠下腹取出子宮，剝離胎鼠并分離出胎鼠的大腦皮質組織，將皮質組織剪碎并加入胰蛋白酶，37 ℃條件下消化15 min后加入5 ml DMEM溶液終止消化，離心后棄去上清液，將細胞懸液置于培養(yǎng)板并放置在37 ℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱內進行培養(yǎng)。原代神經元培養(yǎng)到第7天時，棄去培養(yǎng)基，并加入無糖的DMEM培養(yǎng)基，每孔加入1 ml，然后將培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱(37 ℃，95%N2，5%CO2)進行缺氧缺糖培養(yǎng)120 min。OGD培養(yǎng)結束后，棄去無糖DMEM培養(yǎng)基，預溫37 ℃PBS洗滌培養(yǎng)板一次，加入神經元專用培養(yǎng)基，每孔加入1 ml，置于5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。對照組不作任何缺氧缺糖處理，復氧后24 h終止實驗。

1.2 實驗分組和設計

1.2.1 15d-PGJ2對神經元OGD/R后細胞存活率及自噬的影響 將原代神經元培養(yǎng)至7 d開始OGD處理，根據再復氧復糖的時間點不同，隨機分為5組：對照組、OGD/R 2 h組、OGD/R 6h組、OGD/R 12 h組、OGD/R 24 h組；再根據OGD/R前加入15d-PGJ2劑量的不同，將OGD/R 24 h隨機分為4組：對照組+15d-PGJ2(0 μmol)、OGD/R+15d-PGJ2(0.1 μmol)、OGD/R+15d-PGJ2(0.5 μmol)、OGD/R+15d-PGJ2(1.0 μmol)，對上述各組進行MTT及LDH漏出率檢測，采用Western blot法分析各組LC3-Ⅱ、Beclin 1、p62的表達。

1.2.2 15d-PGJ2對神經元細胞AMPK、mTOR、p70S6K表達的影響 將原代神經元發(fā)生OGD后，根據復糖復氧時間分為對照組、OGD/R 2 h組、OGD/R 6 h組、OGD/R 12 h組及OGD/R 24 h組；再根據OGD/R前有無15d-PGJ2，隨機分為4組：對照組、OGD/R 24 h組、對照組+15d-PGJ2(1.0 μmol)組、OGD/R 24 h+15d-PGJ2(1.0 μmol)組，對照組不進行OGD/R處理。Western blot法分析各組p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、p-p70S6K、p70S6K的表達。

1.2.3 15d-PGJ2對神經元細胞Bcl-2/Beclin 1表達的影響 將原代神經元發(fā)生OGD后，根據復糖復氧時間分為對照組、OGD/R 2 h組、OGD/R 6 h組、OGD/R 12 h組及OGD/R 24 h組；并將原代神經元發(fā)生OGD后24 h隨機分為對照組、OGD/R 24 h組、對照組+15d-PGJ2(1.0 μmol)組、OGD/R 24 h+15 d-PGJ2(1.0 μmol)組；再將原代神經元OGD/R 24 h時，根據是否有Bcl-2 siRNA干擾，及OGD/R前是否加入15d-PGJ2(1.0 μmol)干預，隨機分為6組：對照組+Bcl-2 scRNA組、OGD/R+Bcl-2 scRNA組、OGD/R+15d-PGJ2+Bcl-2 scRNA組、對照組+Bcl-2 siRNA組、OGD/R+Bcl-2 siRNA組、OGD/R+15d-PGJ2+Bcl-2 siRNA組。Western blot分析各組Bcl-2、LC3-II、Beclin-1、p62的蛋白表達情況。對照組不進行OGD/R處理，Western blot法分析以上各組Bcl-2、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62的蛋白表達情況。

1.3 細胞活力測定 神經元的活力測定則采用MTT比色法來確定。每孔加入20 μl MTT溶液，在細胞培養(yǎng)箱37 ℃下孵育4 h，吸出孔內培養(yǎng)液后再加入二甲基亞砜溶液，待顆粒完全溶解后以多孔分光光度計在570 nm測定吸光度，記錄結果并繪制曲線圖。以對照組細胞活力為100%，細胞死亡的百分比計算用下面的公式：細胞死亡(%)=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.4 細胞毒性測定 細胞毒性通過乳酸脫氫酶(LDH)測定法評估。OGD/R后各組細胞培養(yǎng)物的上清液保留，PBS漂洗后，用1%的Triton X-100在37 ℃下30 min指示，制備上清液和細胞裂解液的樣品，進行LDH漏出率的測定。多孔分光光度計測定440 nm處光密度值(A)，計算LDH漏出率(%)=(A+/A+空白)/(A-/A-空白)×100%。

1.5 Bcl-2 RNA干擾 使用Lipofectamine 2000轉染試劑盒，待神經元細胞生長密度達到50%時實施轉染。轉染前用Opti-MEM I Medium的稀釋液將其稀釋為比例為1∶50，輕柔混合后在室溫下孵育5 min，并將轉染的質粒按照1∶25的比例進行稀釋。將兩者稀釋的液體輕柔混合并放置在室溫20 min，待其形成Bcl-2-siRNA-轉染混合物。將Bcl-2-siRNA-轉染混合物(500 μl)加入六孔板中，輕柔晃動，放置在孵箱中進行培養(yǎng)，對照組則以Bcl-2-scRNA替代Bcl-2-siRNA進行試驗。

1.6 Western blot檢測 將實驗組細胞棄去培養(yǎng)液，用預冷的PBS清洗2～3遍，加入適量的細胞蛋白裂解液，冰上不停搖晃20 min以充分裂解細胞，用細胞刮順序刮取細胞，移液器收集細胞至1.5 ml離心管中，4 ℃條件下12000 r/min離心10 min，收集上清即為各組蛋白，采用BCA法檢測蛋白濃度。所用一抗為LC3(1∶1000)、Beclin1 (1∶500)、Bcl-2 (1∶500)、mTOR (1∶200)、p-mTOR (1∶200)、p70S6K(1∶200)及β-actin(1∶5000)。

2 結 果

2.1 15d-PGJ2對神經元OGD/R后細胞存活率的影響 隨著再灌注時間的延長，與對照組相比，各組神經元細胞的生存率明顯下降(P<0.05)(見圖1A)。同時，與對照組相比，LDH的漏出率在再灌注2～24 h后逐步增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05) (見圖1B)。在再灌注開始前，分別予不同濃度的15 d-PGJ2(0.1，0.5，1 μmol)加入到培養(yǎng)基中，我們發(fā)現(xiàn)，與OGD/R組相比，0.5～1.0 μmol的15 d-PGJ2能顯著增加神經元細胞的存活率、抑制OGD/ R誘導的LDH釋放，且差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖1C、1D)。

2.2 15d-PGJ2對神經元OGD/R后細胞自噬的影響 與對照組相比，LC3-Ⅱ/LC3-I的比值和Beclin 1的表達在再灌注后的6 h開始顯著增加(P<0.05)，而p62的表達在再灌注后的6 h明顯降低，并持續(xù)至24 h(P<0.05) (見圖2A、B)。在再灌注開始前，分別予不同濃度的15d-PGJ2(0.1～1 μmol)加入到培養(yǎng)基中，結果發(fā)現(xiàn)，與OGD/R組相比，15 d-PGJ2的濃度在0.5～1.0 μmol時， LC3-Ⅱ/LC3-I的比值和Beclin 1的表達均顯著降低，而p62的表達則顯著增加(P<0.05)(見圖2C、D)。

2.3 15d-PGJ2對神經元細胞AMPK、mTOR、p70S6K表達的影響 與對照組相比，OGD/R后2 h、6 h及12 h，15d-PGJ2可誘導磷酸化的AMPK明顯增加(P<0.05)，隨著OGD后再灌注時間的延長，其表達逐漸下降，至再灌注24 h回到正常水平(P>0.05)(圖3A、B)。此外，與對照組相比，OGD/R后磷酸化的mTOR和p70S6K表達量在2 h及6 h均明顯下降(P<0.05)，在再灌注后24 h均恢復到正常水平(P>0.05)(見圖3A、B)。在OGD/R后24 h時，予以15d-PGJ2干預，與對照組相比，磷酸化的AMPK、mTOR及p70S6K水平均無顯著差異(P>0.05)(見圖3C、D)。

2.4 15d-PGJ2對神經元細胞Bcl-2/Beclin 1表達的影響 與對照組相比，OGD/R后6 h、12 h及24 h時，Bcl-2的蛋白表達水平均明顯減少，而Beclin 1表達則顯著增加(P<0.05)(見圖4A、B)。在OGD/R后24 h，15d-PGJ2(1 μmol)可顯著上調Bcl-2的蛋白表達，降低Beclin 1表達量，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖4C、D)。在OGD/R后24 h，在15d-PGJ2作用下，與給予Bcl-2 scRNA的對照組相比，轉染Bcl-2 siRNA的神經元細胞內Bcl-2的蛋白表達水平明顯下調，Beclin 1蛋白表達水平則明顯增高，且LC3-Ⅱ/LC3-I比值明顯升高(P<0.05)(見圖4E、F)。

A：MTT測定法分析細胞活力；B：通過LDH漏出率分析細胞毒性；C、D：15d-PGJ2對神經元細胞存活率的影響。在再灌注開始前，在神經元培養(yǎng)基中給予不同濃度的15d-PGJ2(0.1、0.5、1 μmol)，OGD/R后24 h，分析細胞活力和LDH漏出率。與對照組比較*P<0.05;與OGD/R組比#P<0.05

圖1 15d-PGJ2對原代神經元細胞OGD/R后存活率的影響

A、B:當原代神經元發(fā)生OGD/R損傷后，LC3-Ⅱ/LC3-I的比值、Beclin-1及p62表達的影響； C、D：15d-PGJ2對OGD/R后LC3-Ⅱ/LC3-I的比值、Beclin-1及p62表達的影響。與對照組比較*P<0.05；與OGD/R組比較#P<0.05

圖2 15d-PGJ2對神經元OGD/R后細胞自噬的影響

A、B：神經元細胞OGD/R后磷酸化的AMPK、mTOR及p70S6K表達量的變化；C、D：在OGD/R后24 h，15d-PGJ2(1 μmol)對磷酸化的AMPK、mTOR及p70S6K水平的影響。與對照組比較*P<0.05;與OGD/R組比較#P<0.05

圖3 15d-PGJ2對神經元細胞AMPK、mTOR、p70S6K表達的影響

A、B:在OGD/R后，Bcl-2及Beclin 1的蛋白表達量的變化；C、D：OGD/R后24 h，15d-PGJ2(1 μmol)對Bcl-2及Beclin 1的蛋白表達的影響；E、F：在OGD/R后24 h，Bcl-2 siRNA對Beclin 1、Bcl-2及LC3-Ⅱ/LC3-I的表達量的影響。與對照組比較*P<0.05；與OGD/R組比較#P<0.05

圖4 15d-PGJ2對神經元細胞Bcl-2/Beclin 1表達的影響

3 討 論

目前普遍認為，在腦缺血再灌注過程中，細胞的自噬起關鍵作用。且研究發(fā)現(xiàn)，PPAR反應元件激動劑可通過調節(jié)Bcl-2，從而對神經元的缺血再灌注損傷起一定程度的保護作用[5]。但在缺血再灌注過程中，PPAR反應元件激動劑是否對自噬產生影響，國內外尚未見相關報道。

腦缺血的本質為缺氧缺糖，氧糖剝奪(OGD)模型可模擬腦缺血病理變化。參照文獻[6]，本實驗成功復制神經元OGD/R損傷的細胞模型，選用PPAR反應元件激動劑15d-PGJ2，觀察其對OGD/R損傷的影響。結果發(fā)現(xiàn)，OGD/R損傷后，神經元細胞的生存率明顯下降，LDH的漏出率則顯著升高。給予15d-PGJ2干預后，神經元細胞的生存率則明顯升高，LDH的漏出率下降，提示15d-PGJ2可對原代神經元發(fā)生OGD/R損傷后起到顯著保護作用。

自噬在哺乳動物正常腦組織內通常很難檢測到，但在腦缺血的情況下，其表達則顯著增強。Gabryel等[7]發(fā)現(xiàn)在腦缺血的不同階段，自噬可能扮演著雙重角色。當腦輕度缺氧或是局部缺血時，自噬的激活能起到保護效應[8]。然而，在嚴重缺氧缺血的情況下，過度激活的自噬過程則是有害的[9]。Mo等[10]在利用PC12細胞復制缺血性卒中細胞模型中發(fā)現(xiàn)，β-細辛腦可通過下調自噬所依賴的Beclin 1表達，對OGD/R后細胞產生保護效應。相反地，Shi等[11]在腦缺血的細胞模型中發(fā)現(xiàn)，自噬的過度表達則促進神經元的死亡。

LC3-Ⅱ是真核細胞自噬研究中應用最廣泛的特異性蛋白，Beclin1 1是Ⅲ類磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)復合物中的組成成分，該復合物可誘導自噬的發(fā)生。我們在本次研究中發(fā)現(xiàn)，在OGD/R發(fā)生后6～24 h，LC3-Ⅱ和Beclin 1的表達顯著增加，這與文獻報道[12，13]。加入15d-PGJ2后我們發(fā)現(xiàn)，LC3-Ⅱ和Beclin 1的表達水平則明顯下降。此外，自噬抑制劑3-MA可明顯降低LC3ⅡI的蛋白表達量、增加細胞的存活率及減少LDH的漏出率。這些研究結果提示，神經元細胞在OGD/R后自噬表達水平顯著增強，從而促進OGD/R損傷后神經元的死亡。15d-PGJ2則可通過抑制自噬的表達，對神經元OGD/R損傷后起到一定程度的保護作用。

目前已有研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血所致的神經元細胞死亡中，自噬明顯增強，但調節(jié)自噬激活的具體信號通路仍不明確。Wang等[14]研究證實，在腦缺血發(fā)生過程中，TSC2-mTOR-S6K1信號通路在自噬的表達過程中起重要作用。Matsui等[15]研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺血時可通過AMPK-mTOR通路激活自噬的發(fā)生，而在再灌注時，自噬的激活卻依賴于Beclin 1通路，而非AMPK途徑。本實驗將原代神經元進行2 h的OGD后再灌注2～24 h，發(fā)現(xiàn)在OGD的初始階段，p-AMPK的蛋白表達水平明顯增加，同時p-mTOR及p-p70S6K的表達量下降，但這3種蛋白的磷酸化水平均在再灌注24 h后恢復到正常水平，且在OGD/R后24 h時，15 d-PGJ2對p-AMPK、p-mTOR及p-p70S6K表達變化無顯著影響。同時，我們還發(fā)現(xiàn)，OGD/R后6 h、12 h及24 h時，Bcl-2的蛋白表達水平均明顯下降，而Beclin 1的蛋白表達量則顯著增加，15d-PGJ2(1 μmol)可顯著上調Bcl-2、降低Beclin 1的蛋白表達量。同時，本實驗通過細胞轉染技術進一步研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2 siRNA可阻止15d-PGJ2對Beclin 1、Bcl-2和LC3-Ⅱ/LC3-1的影響。以上研究結果提示我們，15d-PGJ2對神經元OGD/R損傷的保護作用可能是通過Bcl-2/Beclin 1信號通路實現(xiàn)的，而并非依賴于AMPK-mTOR- p70S6K途徑，但是否還存在其他信號通路參與自噬過程的調節(jié)，還需要進一步研究。

綜上所述， 15d-PGJ2能夠有效的對神經元OGD/R損傷起到保護作用，其機制可能是通過上調Bcl-2的表達進而抑制自噬的發(fā)生實現(xiàn)的，從而為臨床上缺血性腦卒中的治療提供了新的思路。

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Effect of 15d-PGJ2on the neuron oxygen-glucose deprivation/reperfusion injury

LI Jian,FENG Jiang,DUAN Yu,et al.

(Department of Neurosurgery,Huadong Hospital,Fudan University,Shanghai 200040,China)

Objective To investigate the effect of PPAR-γ agonist 15d-PGJ2on the neuron oxygen-glucose deprivation/reperfusion injury and to clarify the underlying mechanism.Methods In this study,We established the cerebral ischemia-reperfusion models in vitro.Primary cortical neuron was exposed to a paradigm of ischemic insult by using an oxygen-glucose deprivation/reperfusion (OGD/R) device and were randomly divided into groups according to the experimental scheme.The expression of LC3、Bcl-2、Beclin1、AMPK、mTOR and p70S6K protein were deterined by Western blot.The neuronal cell viability was detected by MTT and the cytotoxicity was determined by lactate dehydrogenase (LDH) leakage.Results The expression of LC3-Ⅱ and Beclin 1 protein significantly increased,while the p62 protein expression decreased obviously.The neuronal cell viability was decreased and the LDH leakage was increased evidently.The LC3-Ⅱ and Beclin 1 protein expression were decreased significantly by the treatment of 15d-PGJ2,the neuronal cell viability was improved and the LDH leakage was decreased.The Bcl-2 protein expression decreased while the Beclin 1 protein expression increased obviously in the OGD/R injury model.And the pretreatment of 15d-PGJ2could upregulate Bcl-2 protein expression.Bcl-2 siRNA could abrogate the effect of 15d-PGJ2on OGD/R injury model.Conclusions Our study demonstrated that 15d-PGJ2could effectively protect the neuronal OGD/R injury,the underlying mechanism may involve in the upregulation of Bcl-2 protein expression and inhibit the process of autophagy.

Ischemia-reperfusion; Autophagy; Peroxisome proliferator-activated receptor-γ; Bcl-2; Beclin-1

1003-2754(2016)10-0873-05

2016-06-25；

2016-09-29

(1.復旦大學附屬華東醫(yī)院，上海 200040；2.復旦大學附屬華山醫(yī)院，上海 200040)

毛仁玲,E-mail:18939953717@189.cn

R741.02

A