小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增和分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的實驗研究

朱曉瓞， 余資江， 孫寶飛， 余 彥， 李玉美， 羅時鵬， 肖朝倫， 賀菊芳

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小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增和分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的實驗研究

朱曉瓞1， 余資江1， 孫寶飛1， 余 彥1， 李玉美1， 羅時鵬1， 肖朝倫2， 賀菊芳1

目的 體外分離和擴(kuò)增小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)，并觀察不同方法誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的差異，以尋找一種效果理想的BMSCs體外誘導(dǎo)方法。方法 取昆明小鼠雙股骨骨髓，采用全骨髓貼壁法體外純化擴(kuò)增BMSCs，流式細(xì)胞術(shù)檢測其表面標(biāo)志物，并對其進(jìn)行成脂、成骨誘導(dǎo)鑒定。分別用化學(xué)誘導(dǎo)法和共培養(yǎng)法誘導(dǎo)BMSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，比較兩種方法所獲得的神經(jīng)元樣細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果 采用全骨髓貼壁法能有效分離小鼠BMSCs，隨著傳代次數(shù)的增加能得到逐漸純化的BMSCs，而過多的傳代次數(shù)則出現(xiàn)細(xì)胞生長速度緩慢、核固縮、脫離等衰老征象。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示P4代BMSCs陽性表達(dá)CD29和Sca-1，而陰性表達(dá)CD11b。具有成脂、成骨誘導(dǎo)分化的能力。共培養(yǎng)法誘導(dǎo)第5天可見神經(jīng)細(xì)胞樣形態(tài)且細(xì)胞突起數(shù)量較多并有分支；化學(xué)誘導(dǎo)法培養(yǎng)第7天細(xì)胞出現(xiàn)較長突起，形成神經(jīng)樣結(jié)構(gòu)。結(jié)論 采用全骨髓貼壁法能有效分離純化小鼠BMSCs，通過共培養(yǎng)法誘導(dǎo)BMSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞效果優(yōu)于化學(xué)誘導(dǎo)法。

小鼠； 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 擴(kuò)增； 分化； 神經(jīng)元樣細(xì)胞

長期以來，由于神經(jīng)元再生能力差，細(xì)胞受損后很難重建樹突和軸突之間的聯(lián)系，神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療是臨床上棘手的問題[1]。因此，尋找神經(jīng)元細(xì)胞的有效移植物對于神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展具有重要意義。近年來， BMSCs作為理想的生物工程種子細(xì)胞因其具有多向分化潛能而備受關(guān)注，多項研究證實BMSCs在體外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，并且具有取材方便、連續(xù)傳代培養(yǎng)或冷凍保存后依然保留生物學(xué)特征、組織修復(fù)能力強(qiáng)、抗原性小等特征，為腦組織損傷等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供一種新思路[2]。目前，誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的方法較多，主要包括抗氧化劑等化學(xué)誘導(dǎo)法，生長因子和改變BMSCs所處微環(huán)境共培養(yǎng)法和分步誘導(dǎo)、慢病毒轉(zhuǎn)染的方法[3～5]。本研究通過體外分離純化擴(kuò)增小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并采用兩種誘導(dǎo)法對小鼠BMSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞進(jìn)行實驗研究，旨在為臨床神經(jīng)再生應(yīng)用提供一種高效、安全的誘導(dǎo)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級健康雄性昆明種小鼠10只，4周齡，體重(20±2)g，購自貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[合格證號：SCXK(黔)(2012-0004)]。

1.1.2 主要試劑和儀器 DMEM/F12培養(yǎng)基、D-Hanks緩沖液購自HyClone公司，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自GIBCO公司，谷氨酰胺(L-Glutamine)、胰島素、3-異丁基-1甲基黃嘌呤(IBMX)、羅格列酮、地塞米松、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、油紅O染液、茜素紅染液購自Cyagen公司，F(xiàn)ITC anti-mouse/rat CD29、PE anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)、APC/Cy7 anti-mouse/human CD11b抗體購自Biolegend公司，PBS干粉、β-巰基乙醇、丁羥基茴香醚(BHA)購自Sigma公司，0.25%胰蛋白酶-EDTA購自HyClone公司，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱購自LEAD-Tech公司；37×B倒置相差顯微鏡購于上海光學(xué)儀器六廠。

1.2 方法

1.2.1 小鼠BMSCs分離培養(yǎng)[6]4周齡小鼠頸椎脫臼處死后，75%酒精全身浸泡消毒10 min，于無菌條件下取出雙側(cè)股骨及脛骨，盡量去除骨表面結(jié)締組織及表面血污，置于含有D-Hanks緩沖液的培養(yǎng)皿中，于酒精燈火焰周圍移入超凈工作臺。用D-Hanks緩沖液洗滌兩次后，眼科剪小心剪斷雙側(cè)股骨頭，用含10% FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基(含100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素)從股骨一端反復(fù)沖洗，另一端收集沖出的骨髓懸液。均勻混合后，用1 ml注射器反復(fù)抽吸制成單細(xì)胞懸液。以1000 r/min離心5 min，棄上清。加入完全培養(yǎng)基重懸后調(diào)整細(xì)胞密度為106/ml接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中。將培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。接種后24 h后，進(jìn)行首次換液，去掉未貼壁的懸浮細(xì)胞，留下貼壁的BMSCs繼續(xù)培養(yǎng)。之后每隔 2～3 d換液一次，每日用相差倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和生長狀況。當(dāng)貼壁細(xì)胞超過85%時棄去培養(yǎng)基，D-Hanks緩沖液輕輕沖洗兩次。用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化至鏡下觀察到大部分細(xì)胞突起回縮變圓、細(xì)胞間隙變大時，加入等體積DMEM/F12完全培養(yǎng)基終止消化。用吸管吹打，使細(xì)胞從瓶壁上脫落并分散，收集細(xì)胞懸液，以1000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min。離心結(jié)束后，棄上清，D-Hanks重懸細(xì)胞沉淀，重復(fù)上述離心操作以盡可能洗去殘留的胰蛋白酶。DMEM/F12完全培養(yǎng)基重懸后，按1∶2比例傳代，倒置相差顯微鏡下觀察傳代細(xì)胞不同生長時期細(xì)胞的生長情況及形態(tài)變化。

1.2.2 小鼠不同傳代BMSCs的生長曲線測定 取體外擴(kuò)增第3、5、7代BMSCs按3×104/ml接種于24孔板內(nèi)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天取2孔細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，計算均值，并以細(xì)胞生長時間為橫坐標(biāo)，以細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)鑒定小鼠BMSCs的細(xì)胞表面標(biāo)記物 取體外擴(kuò)增P4代BMSCs細(xì)胞，胰酶-EDTA消化后，PBS洗滌兩次，以1000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106/ml，分裝于試管中(200 μl/管)，每管分別加入抗鼠CD29、Sca-1、CD11b抗體(設(shè)不加抗體的陰性對照組)，室溫避光孵育20 min，PBS洗滌，離心收集細(xì)胞，PBS重懸并上流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4 BMSCs成骨誘導(dǎo) 誘導(dǎo)分化：取80%～90%融合的P4代BMSCs細(xì)胞，以胰酶-EDTA消化，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104/ml接種于預(yù)先包被0.1%明膠的六孔板中，加完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞融合達(dá)60%～70%時，吸棄完全培養(yǎng)基，每孔加入2 ml成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(每100 ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基含10% FBS、100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素、L-Glutamine 1 ml、抗壞血酸200 μl、β-甘油磷酸鈉1 ml、地塞米松10 μl)，每隔3 d換液一次，每日以倒置相差顯微鏡觀察誘導(dǎo)細(xì)胞生長情況及形態(tài)變化。鑒定：誘導(dǎo)21 d后吸棄六孔板內(nèi)的培養(yǎng)基，PBS沖洗兩次，每孔加入2 ml 4%中性甲醛溶液，固定30 min，PBS沖洗兩次，每孔加入1 ml 茜素紅染液染色3～5 min，PBS沖洗兩次，倒置相差顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.2.5 BMSCs成脂誘導(dǎo) 誘導(dǎo)分化：取80%～90%融合的P4代BMSCs細(xì)胞，以胰酶-EDTA消化，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104/ml接種于六孔板中，加完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞過融合時，吸棄完全培養(yǎng)基，換用成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基A (每100 ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基中含10%FBS、100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素、谷氨酰胺1 ml、胰島素200 μl、IBMX 100 μl、羅格列酮100 μl、地塞米松100 μl)2 ml/孔誘導(dǎo)3 d后，換用成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基B(每100 ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基中含10% FBS、100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素、谷氨酰胺1 ml、胰島素200 μl)2 ml/孔誘導(dǎo)24 h后，再換回成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基A進(jìn)行誘導(dǎo)，A液和B液交替誘導(dǎo)3次后，繼續(xù)用B液維持培養(yǎng)4 d，每2 d換液一次，誘導(dǎo)期間每日以倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化及生長情況。鑒定：成脂誘導(dǎo)結(jié)束后，PBS沖洗兩次，每孔加入2 ml 4%中性甲醛溶液，固定30 min，PBS沖洗兩次，每孔加入1 ml油紅O染料工作液染色30 min，PBS沖洗3次，鏡下觀察染色情況。

1.2.6 BMSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。

1.2.6.1 共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化[7]取小鼠大腦組織，于低糖型DMEM培養(yǎng)液中將皮質(zhì)剪成小塊，用2 ml注射器芯桿碾壓過40 μm濾網(wǎng)，收集濾液，用培養(yǎng)基洗滌3次，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×103/ml，并接種于6孔板內(nèi)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行首次換液，去除未貼壁細(xì)胞，之后每隔2～3 d換液一次，第6天可見典型神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)。取培養(yǎng)好的神經(jīng)細(xì)胞，胰酶消化后收集細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106/ml，接種于Transwell培養(yǎng)皿底層。取體外擴(kuò)增P4代BMSCs細(xì)胞，胰酶消化后收集細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105/ml，接種于Transwell培養(yǎng)皿的insert內(nèi)，培養(yǎng)液為低糖型DMEM(含10% FBS，100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，對照組insert內(nèi)及Transwell培養(yǎng)皿底層均接種BMSCs。

1.2.6.2 化學(xué)誘導(dǎo)分化[8]取體外擴(kuò)增P4代BMSCs細(xì)胞，胰酶-EDTA消化后收集細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105/ml，接種于24孔板生長達(dá)到60%～70%融合時，用含3 mmol/L β-巰基乙醇的DMEM/F12(含10% FBS，100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素)預(yù)誘導(dǎo)24 h，PBS洗滌3次，然后用含20 g/L DMSO、 200 μmol/L BHA的無血清DMEM/F12培養(yǎng)誘導(dǎo)6 h。對照組為不加誘導(dǎo)劑培養(yǎng)。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠BMSCs的培養(yǎng) 接種時BMSCs呈圓形，形態(tài)不一，細(xì)胞核不清晰，懸浮狀，混有較多血細(xì)胞(見圖1中圖A1)。接種后數(shù)小時開始有細(xì)胞貼壁生長，24 h首次換液，棄去大量漂浮的血細(xì)胞后，可觀察到大部分細(xì)胞貼壁，36 h即可見到少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)變化(見圖1中圖A2)。起初生長較慢，大小、形態(tài)不一，可成卵圓形、三角形、菱形，但以扁平梭形為主，胞核卵圓形，可見一些微克隆。5～7 d細(xì)胞生長較快，不斷分裂增殖出現(xiàn)集落樣細(xì)胞，隨著時間的增加，細(xì)胞突起變長，形態(tài)逐漸趨于一致，但仍可見較多非BMSCs的雜細(xì)胞混于其中(見圖1中圖A3、A4)。11 ～ 14 d細(xì)胞克隆減慢，出現(xiàn)70%～80%融合，在融合部位可見“漂浮團(tuán)”樣克隆的小圓形細(xì)胞。傳代細(xì)胞于接種后1 h已見部分細(xì)胞貼壁，6 h基本全部貼壁生長，形狀為扁平的長梭形，傳至P4代細(xì)胞，細(xì)胞純化度較高，可見細(xì)胞排列較有序，呈水紋狀分布，具有一定的極性(見圖1中圖B1～B4)。

2.2 小鼠BMSCs生長曲線 生長曲線結(jié)果顯示，小鼠BMSCs的生長存在潛伏期、生長對數(shù)期和平臺期，前3 d為潛伏期，第3天開始迅速增至，進(jìn)入生長對數(shù)期，第8天開始生長速度減慢進(jìn)入平臺期，且隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞增殖的速率有所下降(見圖2)。說明小鼠BMSCs具有一定的增生分裂能力。此外，隨著傳代次數(shù)的不斷增加，小鼠BMSCs的增殖能力逐漸發(fā)生退化。

2.3 小鼠BMSCs的細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá) 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，生長良好的P4代BMSCs細(xì)胞的粘附分子CD29和干細(xì)胞表面標(biāo)記Sca-1與陰性對照組相比表達(dá)明顯增加，為陽性表達(dá)(見圖3中圖A1、A2和圖B1、B2)；而血細(xì)胞表面標(biāo)記物CD11b為陰性表達(dá)(見圖3中圖C1、C2)。

2.4 小鼠BMSCs成骨、成脂誘導(dǎo)分化結(jié)果 成骨誘導(dǎo)：鏡下可見接種于六孔板中的BMSCs迅速增殖，約5 d即達(dá)到70%融合，形態(tài)以長梭形為主，緊密排列，具有一定的極性。開始成骨誘導(dǎo)后，細(xì)胞開始逐漸發(fā)生形態(tài)上的變化，由梭形變?yōu)椴灰?guī)則形，以多角形、類圓形、方形為主，無明顯排列規(guī)則，隨著誘導(dǎo)時間的增加逐漸形成群落生長，并出現(xiàn)多層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(見圖4中圖A1、A2)。誘導(dǎo)分化第21天，以茜素紅染色后可見成片橘紅色，局部顏色加深形成不透光的鈣結(jié)節(jié)(見圖4中圖A3)。成脂誘導(dǎo)：倒置顯微鏡可見六孔板中BMSCs約6 d達(dá)到過融合，以成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基A進(jìn)行誘導(dǎo)后，細(xì)胞由原來的長梭形逐漸變形為圓形或類圓形，排列緊密，A液和B液交替作用兩次后即可見少量細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)較多圓形、透光度高的脂滴，隨著誘導(dǎo)時間的延長，脂滴逐漸增多變大(見圖4中圖B1、B2)。于誘導(dǎo)第16天進(jìn)行油紅O染色，可見胞內(nèi)脂滴被染為紅色(見圖4中圖B3)。

2.5 小鼠BMSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞結(jié)果 共培養(yǎng)法：培養(yǎng)48 h后即可見BMSCs由長梭形逐漸收縮變小，出現(xiàn)圓形胞體和細(xì)長突起，并且發(fā)出分支。在培養(yǎng)4～5 d時，細(xì)胞形態(tài)變成星狀，呈放射狀生長，并且相互之間連接在一起，形成神經(jīng)細(xì)胞樣形態(tài)(見圖5A)?；瘜W(xué)誘導(dǎo)法：在培養(yǎng)3～4 d時BMSCs由長梭形逐漸收縮變小，變成圓形或多邊形。培養(yǎng)6～7 d細(xì)胞形成較長突起，相互延伸，形成神經(jīng)樣結(jié)構(gòu)(見圖5B)。

圖1 BMSCs原代培養(yǎng)第0天(A1)×250；BMSCs原代培養(yǎng)36 h(A2)×250；BMSCs原代培養(yǎng)第6天(A3)×250；BMSCs原代培養(yǎng)第6天(A4)×400；P4代BMSCs第0天(B1)×250；P4代BMSCs第2天(B2)×250；P4代BMSCs第8天(B3)×250；P4代BMSCs第8天(B4)×400

圖2 小鼠BMSCs P3、P5、P7傳代培養(yǎng)生長曲線

圖3 陰性對照組FITC anti-mouse/rat CD29表達(dá)流式結(jié)果(A1)；實驗組FITC anti-mouse/rat CD29表達(dá)流式結(jié)果(A2)；陰性對照組PE anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)表達(dá)流式結(jié)果(B1)；實驗組PE anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)表達(dá)流式結(jié)果(B2)；陰性對照組APC/Cy7 anti-mouse/human CD11b表達(dá)流式結(jié)果(C1)；實驗組APC/Cy7 anti-mouse/human CD11b表達(dá)流式結(jié)果(C2)

圖4 成骨誘導(dǎo)分化第11天(A1)×250；成骨誘導(dǎo)分化第21天(A2)×400；茜素紅染色(A3)×400；成脂誘導(dǎo)分化第8天(B1)×400；成脂誘導(dǎo)分化第15天(B2)×400；油紅O染色(B3)×400

圖5 共培養(yǎng)法誘導(dǎo)小鼠BMSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的形態(tài)觀察(A)；化學(xué)誘導(dǎo)法誘導(dǎo)小鼠BMSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的形態(tài)觀察(B)×250

3 討 論

隨著神經(jīng)元細(xì)胞的有效移植物-神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)的發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元細(xì)胞不可再生難題的解決開啟了一扇希望之門[9，10]。然而，由于神經(jīng)干細(xì)胞不易獲取，通過胚胎移植又涉及醫(yī)學(xué)倫理問題，導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞很難在臨床中開展應(yīng)用。BMSCs作為細(xì)胞替代治療中理想的種子細(xì)胞，具有多向分化潛能，近年來大量學(xué)者通過移植BMSCs分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞治療缺血性卒中大鼠，取得良好療效。Heo[11]成功將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成神經(jīng)干細(xì)胞，并將其用于治療缺血性卒中大鼠，結(jié)果顯示大鼠的神經(jīng)功能得到有效恢復(fù)。Tsai等[12]學(xué)者研究也證實骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過特定環(huán)境分化形成神經(jīng)元樣細(xì)胞，從而具有治療缺血性卒中的潛力。這些研究為BMSCs自體移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供強(qiáng)有力的理論支持，因此，有效分離BMSCs并將其分化為純度高且穩(wěn)定的神經(jīng)元樣細(xì)胞是目前研究的重點。

目前，分離BMSCs的方法有多種，本研究中采用全骨髓貼壁法對小鼠BMSCs進(jìn)行分離的方法是上世紀(jì)70年代由美國學(xué)者Friedenstein建立的。它利用BMSCs貼壁生長的特性，在培養(yǎng)過程中通過更換培養(yǎng)液除去其他未附壁的混雜細(xì)胞，最終獲得純度較高的BMSCs，與其他方法相比更簡單易行[13]。本次實驗中BMSCs貼壁效果良好，經(jīng)多次換液后有效擺脫了造血干細(xì)胞、紅細(xì)胞等的干擾，培養(yǎng)全程鏡下視野清晰，利于觀察細(xì)胞的形態(tài)變化和生長狀況。傳代細(xì)胞的增殖能力持續(xù)存在，具有較為穩(wěn)定的持續(xù)分化能力。細(xì)胞傳至P4代時，培養(yǎng)環(huán)境中的雜細(xì)胞量低，能看到穩(wěn)定分裂增殖的BMSCs形態(tài)逐漸趨于一致，排列較原代細(xì)胞更為緊密有序，且呈現(xiàn)出一定的漩渦形排列，已經(jīng)具有了一定的極性，細(xì)胞純度較理想。此外，生長曲線結(jié)果顯示BMSCs體外培養(yǎng)時存在潛伏期、生長對數(shù)期和平臺期，且隨著傳代次數(shù)的增加出現(xiàn)細(xì)胞生長速度緩慢、核固縮、脫離等衰老征象，這種現(xiàn)象與其他學(xué)者對BMSCs傳代培養(yǎng)的結(jié)局相似[14,15]。同時細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，P4代BMSCs的表面標(biāo)志物粘附分子CD29和干細(xì)胞表面標(biāo)志物Sca-1陽性表達(dá)，而血細(xì)胞表面標(biāo)志物CD11b陰性表達(dá)，這一檢測結(jié)果說明此法分離提取出的能夠穩(wěn)定自我增殖的細(xì)胞是具備有成體干細(xì)胞應(yīng)該具備的特性的。而經(jīng)成骨和成脂誘導(dǎo)鑒定均表現(xiàn)出良好的向骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化的能力，說明BMSCs具有一定多向分化的潛能。綜上，全骨髓貼壁法能夠成功分離提取出具有穩(wěn)定自我增殖能力和多項分化潛能的BMSCs，且在一定范圍內(nèi)隨著傳代次數(shù)的增加，能夠得到純度較高的BMSCs。

作為目前研究較為成熟的一類成體干細(xì)胞BMSCs來說，其多向分化的潛能已經(jīng)被用于臨床多鄰域疾病的治療當(dāng)中。其中也包括了脊髓損傷、腦卒中、外周神經(jīng)損傷等涉及到神經(jīng)功能修復(fù)與保護(hù)的相關(guān)疾病。關(guān)于BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化潛能的報導(dǎo)不在少數(shù)，方法也多種多樣。

化學(xué)誘導(dǎo)法的作用機(jī)制可能是由于化學(xué)試劑產(chǎn)生細(xì)胞毒性使細(xì)胞的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化，最終誘導(dǎo)BMSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，并且化學(xué)試劑有助于維持分化后神經(jīng)細(xì)胞的生存狀態(tài)[16,17]。本研究中，先采用β-巰基乙醇啟動BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，然后加入抗氧化劑-BHA使BMSCs從氧化狀態(tài)中釋放出來，加速分化的過程。最終可以利用化學(xué)誘導(dǎo)途徑得到在形態(tài)結(jié)構(gòu)上與神經(jīng)元類似的誘導(dǎo)細(xì)胞。而共培養(yǎng)法可能是通過共培養(yǎng)細(xì)胞特定的空間結(jié)構(gòu)和分泌細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)等調(diào)控促進(jìn)BMSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞[18,19]。單獨或聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)方法的作用機(jī)理有部分與之異曲同工。目前已報道的涉及此共培養(yǎng)實驗的細(xì)胞主要有嗅鞘細(xì)胞[20]和神經(jīng)細(xì)胞。本研究我們在共培養(yǎng)法中使BMSCs置于更貼近體內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)的微環(huán)境，并盡可能保持細(xì)胞間相互聯(lián)系，促進(jìn)BMSCs有效分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。最終實驗結(jié)果表明，兩種誘導(dǎo)方法均能成功促進(jìn)BMSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，且使用共培養(yǎng)法誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞所需的時間較化學(xué)誘導(dǎo)法更短、神經(jīng)突樣突起數(shù)量多且相互間形成一定連接，提示共培養(yǎng)法誘導(dǎo)BMSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的效果優(yōu)于化學(xué)誘導(dǎo)法。這一實驗結(jié)論與徐麗麗等[21]的研究結(jié)果相一致。然而誘導(dǎo)細(xì)胞是否具有真正的神經(jīng)細(xì)胞活性，還需進(jìn)行后續(xù)實驗，就神經(jīng)電生理活性、特異性蛋白表達(dá)情況、神經(jīng)功能等方面加以驗證。

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Mouse bone marrow mesenchymal stem cells expansion and differentiate into neuron-like cells in vitro

ZHU Xiaodie,YU Zijiang,SUN Baofei,et al.

(Human Anatomy Department of Basic Medical College,Guizhou Medical University,Guiyang 550025,China)

Objective To observe the mouse bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) expansion in vitro,and to find a suitable and practical method of inducing BMSCs into neuron-like cells in vitro by comparing chemical induction and co-culture.Methods BMSCs which that were isolated from mice by the all bone marrow adherence method were cultured in the optimum culture condition,and light microscopy and flow cytometry were used to study the morphology and biological characteristics of BMSCs.The potential to differentiate into osteoblasts and adipocytes was confirmed also.BMSCs were cultured by chemical induction and co-culture methods,respectively.Cell morphology were compared.Results The all bone marrow adherence method had effective separation of BMSCs,and they lost their differentiation ability gradually during successive generations.The flow cytometry showed that the CD29 and Sca-1 of the P4 BMSCs were positive expression,and CD11b were negative expression.The BMSCs did have the potential to differentiate into osteoblasts and adipocytes in vitro.Neuron-like cells with a larger number of processes were observed on the 5th day in co-culture group while cells with typical nerve cell structure and processes were found on the 7th day in chemical induction group.Conclusions The all bone marrow adherence method has effective separation of BMSCs.The differentiation effect is better in co-culture group compared with chemical induction group.

Mouse; Bone marrow mesenchymal stem cells; Expansion; Differentiate; Neuron-like cells

1003-2754(2016)10-0868-05

2016-04-16；

2016-09-29

國家自然基金(81060108)，貴州省科技廳2012年社會發(fā)展攻關(guān)項目[黔科合SY字(2012)3153號]

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室,貴州 貴陽 550025;2.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)實驗中心，貴州 貴陽 550025)

余資江,E-mail:yzj0112@126.com

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