CRMP2衍生的ST2-104多肽對阿爾茨海默病大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的保護(hù)作用

孟盼盼， 張雨晴， 高媛媛， 孫 莉， 李 琦

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CRMP2衍生的ST2-104多肽對阿爾茨海默病大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的保護(hù)作用

孟盼盼1， 張雨晴1， 高媛媛1， 孫 莉2， 李 琦1

目的 研究ST2-104肽對阿爾茨海默病(AD)大鼠腦皮質(zhì)內(nèi)NMDAR1、NMDAR2B、CRMP2、P-CRMP2的表達(dá)影響，進(jìn)而改善大鼠的認(rèn)知功能，對神經(jīng)元發(fā)揮保護(hù)作用。方法 采用單次單側(cè)腦室微量注射Aβ25-35片段制備AD大鼠模型，具有相同遺傳背景的Wistar大鼠作為假手術(shù)對照組，分別給予不同劑量的ST2-104多肽和鹽酸美金剛治療。Aβ注射2 d后給藥10 d，HE染色法觀察腦皮質(zhì)部分形態(tài)變化，甲醇剛果紅染色法觀察淀粉樣物質(zhì)沉積情況，WB及免疫組化法檢測大鼠腦皮質(zhì)組織NMDAR1、NMDAR2B、CRMP2、P-CRMP2的表達(dá)。結(jié)果 與假手術(shù)組相比，模型組淀粉樣物質(zhì)沉積明顯增多，腦皮質(zhì)部分NMDAR2B表達(dá)顯著增多(P<0.01)，NMDAR1表達(dá)相對減少，P-CRMP2與CRMP2表達(dá)量均無明顯差異；ST2-104多肽可以逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象，降低NMDAR2B表達(dá)(與模型組相比，高劑量組P<0.05)，增加NMDAR1表達(dá)(與模型組相比，高、低劑量均為P<0.05)。結(jié)論 (1)ST2-104可能通過減少NMDAR2B表達(dá)降低其活性來發(fā)揮對AD大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的保護(hù)作用。

阿爾茨海默??； ST2-104； Aβ25-35； NMDAR； CRMP2

阿爾茨海默病(AD)是一種與年齡相關(guān)的起病隱匿的漸進(jìn)性神經(jīng)退行性疾病，早期神經(jīng)損傷癥狀是學(xué)習(xí)和記憶空間認(rèn)知能力的缺陷[1]。其主要病理學(xué)改變是中樞大腦皮質(zhì)神經(jīng)元及其突觸減少，Aβ淀粉樣蛋白沉積和神經(jīng)原纖維纏結(jié)形成[2]。目前的治療仍不能有效改善和阻滯AD疾病進(jìn)展，其發(fā)病機(jī)制尚不明確。ST2-104多肽是帶有穿膜結(jié)構(gòu)的腦衰蛋白反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白2(CRMP2)衍生肽，可通過血腦屏障到達(dá)腦組織拮抗CRMP2與相關(guān)蛋白結(jié)合而發(fā)揮作用，在腦創(chuàng)傷及腦缺血相關(guān)疾病中發(fā)揮積極保護(hù)作用[3，4]。本實(shí)驗(yàn)探討ST2-104對Aβ25-35肽致AD大鼠神經(jīng)元的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性Wistar大鼠50只，體重180～250 g，吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 試劑與儀器 ST2-104純度98%，由耀強(qiáng)生物科技有限公司合成；Aβ25-35(A4559-1MG)購于SIGMA；鹽酸美金剛購于丹麥靈北藥廠；NMDAR1(ab52177)、NMDAR2B(ab28373)、CRMP2(ab129082)、P-CRMP2(Ser522)(ab193226)抗體購于abcam；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗IgG(111-035-003)購于Jackson ImmunoResearch；甲醇剛果紅染色試劑盒購于南京森貝咖生物科技有限公司，大鼠腦立體定位儀購于深圳瑞沃德生命科技有限公司；顯微鏡為蔡司1×71。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 50只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機(jī)分為假手術(shù)組、AD模型組、ST2-104高劑量組、ST2-104低劑量組、鹽酸美金剛陽性對照組，每組10只。

1.4 動物模型制備及給藥 采用單次單側(cè)腦室微量注射Aβ25-35肽法制備阿爾茨海默病大鼠模型。大鼠術(shù)前12 h禁食不禁水。腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，俯臥位固定于大鼠腦立體定位儀上，頭局部去毛，消毒，正中矢狀位切口，剝離骨膜及周邊結(jié)蹄組織，定位使前囟點(diǎn)、后囟點(diǎn)、人中縫處在同一水平線上，根據(jù)《大鼠腦立體定位圖譜》定位，以前囟點(diǎn)為原點(diǎn)，旁開1.8 mm，后開1.08 mm，牙科鉆顱骨鉆孔，深3.8mm處注射Aβ25-35老化液8 μl(16 μg)，20 min注完，留針10 min，出針5 min，消毒，縫合切口。假手術(shù)組注射等體積的生理鹽水。

造模術(shù)后2～12 d ST2-104高劑量組(15 mg/kg·d)、ST2-104低劑量組(3 mg/kg·d)大鼠尾靜脈給藥，鹽酸美金剛陽性對照組(3 mg/kg·d)灌胃給藥，模型組與假手術(shù)組分別給予等體積的生理鹽水。每2 d稱量大鼠體重調(diào)整給藥。

1.5 腦組織病理學(xué)及分子生物學(xué)檢測

1.5.1 取材 給藥結(jié)束后，禁食不禁水12 h處死實(shí)驗(yàn)大鼠。10%水合氯醛麻醉，迅速暴露胸腔，自心尖插入灌流針至主動脈，剪除右心耳，灌注生理鹽水至肺部和肝臟發(fā)白，留出液體澄清，4%多聚甲醛灌注至大鼠軀體僵硬。斷頭取腦，固定于4%多聚甲醛溶液24 h以上，石蠟包埋切片。冠狀位連續(xù)切片，每片約4 μm。麻醉后的大鼠迅速處死斷頭取腦，剝離海馬、皮質(zhì)，錫紙包裹凍存于液氮中。

1.5.2 HE染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟：二甲苯(Ⅰ)、二甲苯(Ⅱ)各15 min，100%乙醇(Ⅰ)、100%乙醇(Ⅱ)、95%乙醇各10min，90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各5min，蒸餾水2 min。蘇木精染色10 min，自來水反藍(lán)10 min，伊紅10 s，上行脫水，中性樹膠封片，鏡下觀察。

1.5.3 甲醇剛果紅染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟，入改良Highman染色液浸染10 min，棄余液；Highman分化夜分化2～5 s，立即入水終止分化，水洗2次；自來水沖洗5 min；入蘇木精1～2 min，自來水洗10 min；上行脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察。

1.5.4 免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟。PBS洗3次，5 min/次；室溫，3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶10 min，PBS洗3次，5 min/次；1%胰酶修復(fù)抗原，濕盒37 ℃孵育25～30 min，PBS洗3次，5 min/次；5%牛血清白蛋白封閉非特異性抗體，濕盒37 ℃孵育25 min；滴加PBS稀釋的一抗，分別為NMDAR2B(1∶500)、P-CRMP2(1∶200)，4 ℃過夜；回收一抗，PBS洗3次，5 min/次；滴加對應(yīng)二抗(1∶1000)，濕盒37 ℃孵育45 min，PBS洗3次，5 min/次；DAB避光顯色10～30 min，蒸餾水終止顯色并沖洗；蘇木精復(fù)染數(shù)秒，上行脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察。PBS代替一抗為對照組，其余均相同。

1.5.5 Western Blot 勻漿皮質(zhì)部分，RIPA裂解液裂解組織提取蛋白，BCA試劑盒蛋白定量，各組處理后蛋白加入Loading buffer，100 ℃煮沸10 min。配膠，WB上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵一抗(NMDAR1 1∶1000，CRMP2 1∶10000)、孵二抗(1∶1000)、ECL顯影。

2 結(jié) 果

2.1 ST2-104肽對AD大鼠腦皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元的影響 與假手術(shù)組相比，模型組皮質(zhì)錐體細(xì)胞出現(xiàn)壞死脫落，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清晰，核固縮碎裂現(xiàn)象。ST2-104肽給藥組及鹽酸美金剛組大鼠皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞形態(tài)、核染色等與模型組相比均有明顯改善(見圖1)。

2.2 ST2-104肽對AD大鼠皮質(zhì)區(qū)淀粉樣物質(zhì)的影響 甲醇剛果紅染色法可以特異性的將淀粉樣物質(zhì)染成深橘紅色。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠皮質(zhì)區(qū)橘紅色明顯增多且顏色比較深，而ST2-104肽給藥組及鹽酸美金剛組較模型組均有明顯改善且3組間無明顯差別(見圖2)。

2.3 免疫組化結(jié)果

2.3.1 ST2-104肽對AD大鼠腦皮質(zhì)區(qū)NMDAR2B表達(dá)的影響 結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組NMDAR2B表達(dá)明顯增加(P<0.01)，ST2-104高低劑量組表達(dá)NMDAR2B量也明顯增加(分別為P<0.05，P<0.01)。與模型組相比，低劑量組沒有改善NMDAR2B的表達(dá)，ST2-104高劑量組NMDAR2B表達(dá)量明顯下降(P<0.05)，陽性組表達(dá)也存在明顯差異(P<0.01)，高劑量組與陽性組間比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖3，見表1)。

2.3.2 ST2-104肽對AD大鼠腦皮質(zhì)區(qū)P-CRMP2表達(dá)的影響 結(jié)果顯示，假手術(shù)組、模型組、高低劑量組和陽性對照組五組間P-CRMP2表達(dá)量均沒有明顯差異(見圖4，見表1)。

2.4 Western Blot結(jié)果

2.4.1 ST2-104肽對AD大鼠腦皮質(zhì)區(qū)NMDAR1表達(dá)的影響 結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組NMDAR1的表達(dá)量有所下降，ST2-104肽給藥組逆轉(zhuǎn)上述結(jié)果，表達(dá)NMDAR1明顯增加，并與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖5)。

2.4.2 ST2-104肽對AD大鼠腦皮質(zhì)區(qū)CRMP2表達(dá)的影響 結(jié)果顯示，假手術(shù)組、模型組、高低劑量組和陽性對照組五組間CRMP2表達(dá)量均沒有明顯差異(見圖5)。

圖1 ST2-104肽對AD大鼠皮質(zhì)區(qū)病理形態(tài)的影響(HE染色 200×)

圖2 ST2-104肽對AD大鼠皮質(zhì)區(qū)淀粉樣物質(zhì)沉積的影響(甲醇剛果紅染色 200×)

圖3 ST2-104肽對AD大鼠腦皮質(zhì)區(qū)NMDAR2B表達(dá)的影響

圖4 ST2-104肽對AD大鼠腦皮質(zhì)區(qū)P-CRMP2表達(dá)的影響

圖5 ST2-104肽對AD大鼠皮質(zhì)區(qū)NMDAR1、CRMP2表達(dá)的影響

組別劑量(mg/kg)nNMDAR2B(OD×10-6)P?CRMP2(OD×10-6)假手術(shù)組模型組ST2?104低劑量組ST2?104高劑量組鹽酸美金剛陽性對照組00315310101010104．17±1．009．47±0．57##16．29±1．75##??7．30±1．13#?5．22±0．97??7．07±2．027．21±1．236．66±3．088．00±1．826．41±0．78

與模型組相比*P<0.05，**P<0.01；與假手術(shù)組相比#P<0.05，##P<0.01

3 討 論

阿爾茨海默病是一個與年齡有關(guān)的漸進(jìn)性神經(jīng)變性疾病。早期神經(jīng)損傷癥狀是學(xué)習(xí)和記憶認(rèn)知能力的缺陷，并逐漸進(jìn)展[2]。以神經(jīng)元死亡和突觸聯(lián)系減少，Aβ蛋白沉積和神經(jīng)原纖維纏結(jié)為主要病理改變[5]。不同形式的Aβ多肽已經(jīng)被廣泛用于體內(nèi)外研究，應(yīng)用Aβ1-40，1-42或25-35多肽于體外培養(yǎng)的神經(jīng)元或動物側(cè)腦室注射都能模仿出AD模型，結(jié)果的可靠性得到公認(rèn)[6]。Aβ沉積在腦神經(jīng)元周圍形成AD特有的老年斑，繼而引起興奮性突觸傳遞的軸突和樹突棘密度減少和突觸可塑性降低，LTP(學(xué)習(xí)與記憶的物質(zhì)基礎(chǔ))損害，神經(jīng)元細(xì)胞死亡。本實(shí)驗(yàn)采用單次單側(cè)腦室微量注射Aβ25-35多肽制備大鼠阿爾茨海默病模型。術(shù)后所有組別大鼠均出現(xiàn)精神不振、行動遲鈍、食量減少等現(xiàn)象，隨著時間延長，假手術(shù)組及給藥組大鼠逐漸恢復(fù)，無1例死亡；模型組大鼠呆滯萎靡，食欲不振，出現(xiàn)傷亡。HE染色及甲醇剛果紅染色結(jié)果表明，ST2-104對AD大鼠皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)結(jié)構(gòu)破壞具有保護(hù)作用，可減少淀粉樣物質(zhì)沉積。

谷氨酸幾乎涉及所有的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能，是一種快速性興奮性神經(jīng)遞質(zhì)；中樞神經(jīng)系統(tǒng)中70%的興奮性突觸利用谷氨酸作為神經(jīng)遞質(zhì)[1，7]。腦組織具有豐富的谷氨酸受體，特別是NMDAR受體，對學(xué)習(xí)和記憶功能和突觸的可塑性極為重要，通過該受體本身、其共軛離子通道及調(diào)節(jié)部位形成的復(fù)合體而發(fā)揮功能，對Ca2+高度通透。文獻(xiàn)報道，Aβ的沉積可直接作用于NMDAR，導(dǎo)致緩慢持續(xù)地NMDAR激活，Ca2+通過NMDAR內(nèi)流進(jìn)入突觸后神經(jīng)元，造成細(xì)胞內(nèi)Ca2+過載，引起突觸功能抑制和LTP異常，造成細(xì)胞慢性興奮毒性[8，9]和突觸毒性，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，神經(jīng)功能障礙[10，11]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腦組織中NMDAR2B表達(dá)量增加，ST2-104肽給藥后可以逆轉(zhuǎn)NMDAR2B的增加，高劑量組與模型組具有顯著差異(P<0.05)，可被激活的受體量減少，活性降低，從本質(zhì)基礎(chǔ)上降低Aβ對神經(jīng)元的損害。ST2-104可能通過減少皮質(zhì)區(qū)NMDAR2B的表達(dá)發(fā)揮對皮質(zhì)神經(jīng)元的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)中還出現(xiàn)模型組大鼠皮質(zhì)區(qū)NMDAR1表達(dá)量稍微減少，而給藥組的表達(dá)明顯抬高現(xiàn)象，相關(guān)情況報道并不多見，其相關(guān)機(jī)制需要進(jìn)一步探索。

CRMP2即塌陷反應(yīng)介導(dǎo)蛋白，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)特別是海馬區(qū)廣泛表達(dá)。對于神經(jīng)的生長發(fā)育十分重要，具有促進(jìn)神經(jīng)元纖維生長，指導(dǎo)軸突延長，調(diào)節(jié)生長錐生長和微管的集裝，細(xì)胞膜受體內(nèi)質(zhì)化等廣泛的生物學(xué)調(diào)節(jié)作用[12]。研究顯示磷酸化的CRMP2可與NMDAR2B結(jié)合，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[13，14]。ST2-104肽為CRMP2的衍生肽，可通過血腦屏障，Tatiana等研究表明ST2-104促進(jìn)CRMP2與NMDAR2B解離使CRMP2內(nèi)質(zhì)化降低NMDAR2B的活性而不改變其分布[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)AD腦皮質(zhì)區(qū)CRMP2表達(dá)量各組間無明顯變化，ST2-104作用機(jī)制可能與上述途徑相似，有待進(jìn)一步探究。ST2-104肽對AD大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元具有保護(hù)作用，可能通過減少NMDAR2B表達(dá)，降低其活性來發(fā)揮作用的。

[1]盧 貞，萬莉紅，金少舉，等. 復(fù)方丹參片對Aβ25-35所致老年癡呆小鼠的行為學(xué)改善作用及對RACK1的影響[J]. 中國藥理與臨床，2012，28(6)：105-108.

[2]Hort J，Laczo J，Vyhnalek M，et al. Spatial navigation defecit in amnestic mild cognitive impairment[J]. PNAS，2007，104(10)：4042-4047.

[3]Brittain JM，Pan R，You R，et al. Disruption of NMDAR-CRMP2 signalling protects against focal cerebral ischemic damage in the rat middle cerebral artery occlusion model[J]. Channels，2012，6(1)：53-59.

[4]Brittain JM，Chen L，Wilson SM，et al. Neuroprotction against traumatic brain injury by a peptide derived from the collapsin response mediator protein2(CRMP2)[J]. The Journal of Biological Chemistry，2011，286(43)：37778-37792.

[5]Dennis J. Selkoe . Azheimer’s disease is a synaptic failure[J]. Science，2002，298(25)：789-791.

[6]李令文，陳明蒼，季宇彬. 老年癡呆癥模型研究進(jìn)展[J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2014，10(5)：43-45.

[7]Danysz W，Parsons C G. Alzheimer’s disease，β-amyloid，glutamate，NMDA receptors，and memantine-searching for the connections[J]. British J Pharmacology，2012，167：324-352.

[8]Wenk GL，Persons CG，Parsons P，et al. Potential role of N-methyl-D-aspartate receptor as executors of neurodegeneation resulting from diverse insults：focus on memantine[J]. Behavioural Pharmacology，2006，17：411-424.

[9]牟靜靜，孟 星，孟盼盼，等. 腦脈泰對慢性腦缺血大鼠認(rèn)知功能的保護(hù)作用及其機(jī)制研究[J]. 中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2015，32(1)：21-24.

[10]Butterfield DA，Pocernich CB. The glutamatergic system and Alzheimer’s disease：Therapeutic implication[J]. CNS Drug，2003，17：641-652.

[11]Berridge MJ. Calcium signalling and Alzheimer’s disease[J]. Neurochem Res，2011，36：1149-1156.

[12]Khanna R，Wilson SM，Brittain JM，et al. Opening Pandora’s jar：a primer on the putative roles of CRMP2 in a panoply of neurodegenerative，sensory and motor neuron，and central disorders[J]. Future Neurol，2012，7(6)：749-771.

[13]Mileusnie R and Rose SPR. The memory enhancing effect of the APP-derived tripeptide Ac-rER is mediated through CRMP2[J]. Journal of Neurochemistry，2011，118：616-625.

[14]Cole AR，Noble W，van Aalten L，et al. Collapsin response mediator protein 2 hyperphosphorylation is an early event in alzheimer’s disease progression[J]. Journal of Neurochemistry，2007，103：1132-1144.

[15]Brustovetsky T，Pellman JJ，Yang XF，et al. Collapsin Response Mediator Protein2(CRMP2) Interacts with N-Methyl-D-aspartate(NMDA)Receptor and Na+/Ca+Exchanger and Regulates Their Functional Activity[J]. The Journal of Biological Chemistry，2014，289(11)：7470-7482.

The protective effects of ST2-104 peptide derived from CRMP2 on cortical neurons in Alzheimer rats

MENG Panpan，ZHANG Yuqing，GAO Yuanyuan，et al.

(Department of Pharmacology，Basic Medical College of Jinlin University，Changchun 130021，China)

Objective To explore the effect of ST2-104 peptide on the expression of NMDAR1，NMDAR2B，CRMP2 and P-CRMP2 in pallium，to elucidate mechanism of ST2-104 on improving the cognitive function following Alzheimer rats. Methods Single single intracerebroventricular microinjection of Aβ25-35 was used to establish the model of Alzheimer and Wistar rats were used as the sham group. Then they were given different dose of ST2-104 or memantine. Administration for 10 days after 2 days injection. The change of pallium cells in cortex region was observed by HE staining. Amyloid deposition was observed by ameliorated Highman Congo red staining. Relative NMDAR1，NMDAR2B，CRMP2，P-CRMP2’s expression were performed by immunohistochemistry and western blot. Results TThere were more amyloid deposition，more NMDAR2B expression(P<0.01)，less NMDAR1 expression in the model group compared with sham group，but there was no markedly differences between P-CRMP2 and CRMP2’s expression. ST2-104 peptide could reverse this phenomenon by decreasing the expression of NMDAR2B(high-dose group，P<0.05)and increasing the expression of NMDAR1 expression(low-dose group and high-dose group，P<0.05)compared with the model group. Conclusion ST2-104 peptide might protect neurons from A-beta toxicity by inhibiting the expression of NMDAR2B and decreasing its activity.

AD； ST2-104； Aβ25-35； NMDAR； CRMP2

1003-2754(2016)03-0203-04

2016-01-05；

2016-03-06

吉林省人才開發(fā)資金資助項(xiàng)目(No. 802150021426)，國家自然科學(xué)基金(No. 81571231)

(1.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130021；2.吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長春 130021)

李 琦，E-mail：youjun08@hotmail.com

R749.1+6

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