歐芹根總黃酮對(duì)非酒精性脂肪性肝病大鼠的治療作用及機(jī)制研究*

謝婧雯，陳　妍，賈蔓菁，朱曼麗，雷林杰

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊　830063；　2.新疆醫(yī)科大學(xué)，新疆 烏魯木齊　830011）

歐芹根總黃酮對(duì)非酒精性脂肪性肝病大鼠的治療作用及機(jī)制研究*

謝婧雯1，陳妍1，賈蔓菁1，朱曼麗2，雷林杰1

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊830063；2.新疆醫(yī)科大學(xué)，新疆 烏魯木齊830011）

目的 探討歐芹根總黃酮對(duì)非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）大鼠模型的影響機(jī)制。方法 采用高脂飲食誘導(dǎo)NAFLD大鼠40例建模，隨機(jī)分為正常組、模型組、水飛薊素組和歐芹根總黃酮組，各10只，分別給予生理鹽水、生理鹽水、水飛薊素、歐芹根提取物，除正常組外，其他組均每日喂食高脂飼料。檢測各組大鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）水平，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Quantitative Real-time PCR）法檢測肝組織中環(huán)氧合酶-2（COX-2）的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 建模成功，模型組大鼠血清ALT，AST，TC，TG水平與正常組大鼠相比均明顯升高（P＜0.05）；水飛薊素和歐芹根總黃酮干預(yù)后能顯著降低NAFLD大鼠上述4項(xiàng)指標(biāo)水平，并抑制COX-2的mRNA表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；歐芹根總黃酮作用略強(qiáng)于水飛薊素，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 歐芹根總黃酮對(duì)NAFLD大鼠有一定的治療作用，其作用機(jī)制與抑制肝組織中COX-2的表達(dá)有關(guān)。

歐芹根總黃酮；非酒精性脂肪性肝??；環(huán)氧合酶-2

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是指除酒精及其他明確的肝損傷因素所致的，以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪病變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征［1-2］，包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎（NASH）、脂肪性肝纖維化和脂肪性肝硬化4個(gè)從輕到重的病理階段［3］。該病發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，且至今尚不完全清楚。其治療以西藥為主，以起到保護(hù)肝細(xì)胞、調(diào)節(jié)血脂及血糖等作用，但安全性有待進(jìn)一步驗(yàn)證［4］。與此同時(shí)，天然藥物以其作用溫和、毒副作用相對(duì)較小的優(yōu)勢逐漸受到關(guān)注。新疆維藥芹菜根為傘形科植物歐芹 Petroselinum crispum（Mill）Hill的干燥根［5］（與我們平時(shí)食用芹菜的根部不同），當(dāng)?shù)赜闷渲委煾闻K疾病。目前，除筆者前期所作研究外，關(guān)于該藥物活性成分和藥理機(jī)制的研究報(bào)道較少。因此，對(duì)該藥進(jìn)行系統(tǒng)地研究十分必要。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物、儀器與試藥

1.1.1動(dòng)物

SD大鼠40只，購自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)為SYXK＜滬＞2013-0034。體質(zhì)量（180±20）g，自由飲食，飼養(yǎng)溫度條件為（22±2）℃。

1.1.2儀器

LDZX-40BI型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；東勝EDC-810型基因擴(kuò)增儀（北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司）；ABM基因梯度擴(kuò)增儀（Applied Biosystems公司）；HITACHI CF 15R型高速冷凍離心機(jī)（Sigma公司）；VILBER LOURMAT vo3 7742型凝膠成像系統(tǒng)（Vilber Lourmat公司）；DK-S12型和DK-S16型電熱恒溫水浴鍋（常州潤華電器公司）；UV-1800型紫外可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；DYY-4C型電泳儀（美國Biorad公司）；Q／FY-LYY002型電泳槽（上海天能科技有限公司）；SHELLAB S16-2型搖床（上海智城分析儀器制造有限公司）等。

1.1.3試藥

水飛薊素（天津天士力圣特制藥有限公司，批號(hào)為201302090021）；歐芹根購自新疆烏魯木齊市二道橋市場洛克曼維吾爾醫(yī)藥行，經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所張彥福教授鑒定為傘形科植物歐芹 Petroselinum crispum（Mill）Hill的干燥根。歐芹根總黃酮采用6倍量70%乙醇提取歐芹根粗粉，提取2次，每次1 h，合并2次的濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，將提取物用蒸餾水溶解后通過聚酰胺柱，收集流出液，濃縮干燥后即得?？偰懝檀迹═C）、三酰甘油（TG）檢測試劑盒（南京建成生物工程公司）；RNA提取試劑盒（烏魯木齊歐易生物科技有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄酶為實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）的鼠白血病逆轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）第一鏈合成酶（Invitrogen公司，貨號(hào)為C28025-032）；實(shí)時(shí)熒光染料為SYBR Select Master Mix（ABI公司，貨號(hào)為4472920）。1.2大鼠NAFLD模型建立

取花生油50 g，加熱，加入膽固醇15 g融化，攪勻后加入吐溫80 3.5 mL，制成油相；使用水50 mL、全脂奶粉10 g、食鹽1 g、蔗糖20 g和丙二醇3.5 mL加熱后加入脫氧膽酸鈉1 g，制成水相；隨后將油相和水相充分混合為高脂乳劑，根據(jù)大鼠體重每周喂食2次，平時(shí)以高脂飼料維持，連續(xù)喂食12周。將40只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、水飛薊素組和歐芹根總黃酮組，各10只。正常組和模型組腹腔注射相同體積比例的生理鹽水，水飛薊素組腹腔注射水飛薊素（每100 g體質(zhì)量10 mg）、歐芹根總黃酮組腹腔注射歐芹根提取物（每100 g體質(zhì)量10 mg），每5天給藥1次。除正常組外，其他組均每日喂食高脂飼料。4組大鼠喂食12周后用檢測試劑盒測定大鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、TC及TG水平。同時(shí)，麻醉大鼠后取其肝組織提取RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行qRT-PCR。

1.3熒光定量PCR試驗(yàn)方法

采用 DanoDrop1000鑒定總 RNA的純度，以RNase-water對(duì)照液，DanoDrop1000測定總 RNA在260，280 nm波長處的吸光度，得到總RNA的濃度及OD260／OD280值（1.8＜OD260／OD280＜2.0）。取總 RNA和6×loading buffer電泳經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀照像，檢測總RNA的純度與完整性。完整的RNA應(yīng)是2條亮帶即2個(gè)主要的核糖體：18sRNA（相對(duì)分子質(zhì)量約為2.1 kb）和28sRNA（相對(duì)分子質(zhì)量約為4.5 kb）可作為相對(duì)分子質(zhì)量參照。質(zhì)檢合格的RNA樣本，使用qRT-PCR的M-MLV第一鏈合成系統(tǒng)得到cDNA，使用ABI公司的ABI7500熒光定量PCR系統(tǒng)二步法進(jìn)行。目的基因COX2和內(nèi)參基因β-Actin的引物序列見表1［6-7］。

表1　實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以X±s表示，行 t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率表示，行 χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1對(duì)NAFLD大鼠血清ALT和AST水平的影響

NAFLD大鼠血清中ALT和AST水平均顯著高于正常組（P＜0.05）；水飛薊素和歐芹根總黃酮均可明顯降低NAFLD大鼠血清中ALT和AST水平（P＜0.05），且后者的效果略優(yōu)于前者，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表2。

表2　各組NAFLD大鼠血清中ALT和AST水平比較（X±s，U／L，n=10）

2.2對(duì)NAFLD大鼠血清TC和TG水平的影響

NAFLD大鼠血清中TC和TG水平均顯著高于正常組（P＜0.05）；水飛薊素和歐芹根總黃酮可明顯降低NAFLD大鼠血清中TC和TG水平（P＜0.05），且后者效果略優(yōu)于前者，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表3。

2.3對(duì)NAFLD大鼠COX-2基因水平表達(dá)的影響

所有肝組織的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后使用普通PCR手段進(jìn)行瓊脂糖電泳分析，發(fā)現(xiàn)均能擴(kuò)增出目的基因COX2和內(nèi)參基因β-Actin，可用于后續(xù)試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

目的基因COX-2和內(nèi)參基因β-Actin的溶解曲線均符合試驗(yàn)需要，擴(kuò)增斜率均接近-3.34，可用于后續(xù)試驗(yàn)。見圖2。

表3　各組NAFLD大鼠血清中TC和TG水平比較（X±s，mmol／L，n=10）

圖1　基因片段電泳圖

圖2　基因溶解曲線圖

將4組大鼠的cDNA行qRT-PCR試驗(yàn)，結(jié)果歐芹根總黃酮及水飛薊素均可有效抑制COX2的表達(dá)，且前者抑制效果略好。見圖3。

圖3　不同組別COX-2相對(duì)表達(dá)量

3　討論

近年來，NAFLD發(fā)病率有明顯增加趨勢，已成為目前最常見的肝臟疾病［8］。營養(yǎng)過剩所致的體質(zhì)量增長過快、過重、肥胖、糖尿病、高脂血癥等代謝綜合征相關(guān)脂肪性肝病，以及隱源性脂肪性肝病均屬于原發(fā)性非酒精性脂肪性肝病范疇，主要表現(xiàn)為TC，TG，AST，ALT水平升高等。NAFLD較嚴(yán)重患者可出現(xiàn)肝纖維化，主要表現(xiàn)為AST／ALT升高等［9］。因此，本研究中采用長期高脂肪、高膽固醇飼料喂養(yǎng)誘發(fā)大鼠NAFLD形成，此模型發(fā)病病因及病癥等均更加接近臨床NAFLD病癥，同時(shí)也是目前國內(nèi)常用NAFLD模型［10］。通過檢測TC，TG，AST，ALT水平以研究歐芹根總黃酮對(duì)NAFLD的調(diào)脂、抗纖維化等作用。

此外，國內(nèi)外文獻(xiàn)也報(bào)道了COX-2的表達(dá)對(duì)NAFLD的影響。趙錦燕等［11］的研究通過檢測血清中ALT和AST水平變化，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）法和免疫組化法檢測COX-2基因和蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，抗氧化能力的提高有利于治療NAFLD。王雯等［12］的試驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠NAFLD的治療作用機(jī)制可能與抑制肝組織中COX-2的表達(dá)及活性有關(guān)。此外，唐彬等［13］研究發(fā)現(xiàn)，抑制COX-2的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)對(duì)高脂-脂肪肝大鼠療效明顯。因此，本研究中采用qRTPCR法測定COX-2 mRNA在肝組織中的表達(dá)，以此研究歐芹根總黃酮對(duì)NAFLD的抗氧化機(jī)制作用。

新疆維藥芹菜與我們平時(shí)食用的芹菜不同，主要為水芹和旱芹，廣泛分布于全國各地［14］。由于特殊的地理環(huán)境，歐芹根較水芹根粗，較旱芹根細(xì)，主要分布于新疆和田、阿克蘇一帶。維醫(yī)認(rèn)為，芹菜根有活血化瘀、健腦安神、祛風(fēng)除濕等功效，但對(duì)其活性成分及藥理機(jī)制未見詳細(xì)報(bào)道［15］。因此，有必要對(duì)歐芹根總黃酮進(jìn)行深入研究和探討。

本研究結(jié)果表明，歐芹根總黃酮干預(yù)NAFLD模型大鼠，可顯著降低其TC，TG，AST，ALT水平，明顯改善其肝功能。同時(shí)，其肝組織中COX-2 mRNA表達(dá)降低，表明歐芹根總黃酮對(duì)NAFLD的作用機(jī)制可能通過抑制COX-2的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。

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Curative Effect and Mechanism of Total Flavonoids in Roots of Petroselinum Crispum on Nonalcoholic Fatty Liver Rat Model

Xie Jingwen1，Chen Yan1，Jia Manjing1，Zhu Manli2，Lei Linjie1
（1.The Second Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Wulumuqi，Xinjiang，China830063；2.Xinjiang Medical University，Wulumuqi，Xinjiang，China830011）

ObjectiveTo explore the effect mechanism of total flavonoids in roots of petroselinum crispum on nonalcoholic fatty liver rat model.Methods40 cases of nonalcoholic fatty liver rat model were induced by high-fat diet and then randomly divided into the normal group，model group，silymarin group and total flavonoids in roots of petroselinum crispum group，10 rats in each group.All groupwere given the corresponding treatment.Except for the normal group，the other groups were fed with high-fat diet.The plasma level of ALT，AST，TG，TC were detected and the expression of COX-2 mRNA in liver was examined by Quantitative Real-time PCR.Results The model was made successfully，and the plasma level of ALT，AST，TG，TC in model groups were higher than that in normal group.After intervention，the NAFLD rats with silymarin and total flavonoids in roots of petroselinum crispum decresed the above-mentioned four indexes obviously，and the expression of COX-2 mRNA was inhibited（P＜0.05）.The effects of total flavonoids in roots of petroselinum crispum were stronger than silymarin，but the differences were not statistically significant（P＞0.05）.ConclusionThe total flavonoids in roots of petroselinum crispum has a specific curative effect on NAFLD rats.Its mechanism is related to the inhibition of COX-2 mRNA expression.

total flavonoids in roots of petroselinum crispum；nonalcoholic fatty liver disease；COX-2

R285.5；R282.71

A

1006-4931（2016）20-0029-04

*新疆醫(yī)科大學(xué)科研創(chuàng)新基金，項(xiàng)目編號(hào)：XJC201359。

（2016-06-13；

2016-08-11）