基于“有故無殞”思想的雷公藤腎毒性研究*

張　琴，歐陽林旗，胡煒航，左亞杰，李健和

（1.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院藥學(xué)部，湖南 長沙　410011；　2.湖南省中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心，湖南 長沙　410000）

基于“有故無殞”思想的雷公藤腎毒性研究*

張琴1，2，歐陽林旗2，胡煒航2，左亞杰2，李健和1

（1.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院藥學(xué)部，湖南 長沙410011；2.湖南省中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心，湖南 長沙410000）

目的 研究雷公藤對正常和腎小管S1段損傷急性腎功能衰竭模型大鼠腎毒性的差異。方法 觀察雷公藤提取物（TWHF）對生理和病理狀態(tài)大鼠的一般生長狀態(tài)、腎臟臟器指數(shù)、血清生化指標(biāo)的影響，并通過病理切片觀察大鼠腎臟組織損傷情況。結(jié)果 TWHF呈劑量依賴增高的正常大鼠血清尿素氮（BUN）、血清肌酐（CREA）、血清高K+和低Na+水平，與其一般生長狀態(tài)、臟器指數(shù)和腎功能損傷病理檢查結(jié)果相符；低劑量TWHF在模型大鼠上表現(xiàn)出改善BUN、CREA、血清高K+和低Na+水平的腎功能保護(hù)作用，病理損傷程度也有一定減輕，但高劑量時(shí)反而加重模型組大鼠腎功能損傷。結(jié)論 雷公藤對正常大鼠有劑量相關(guān)的腎毒性，但在一定劑量范圍內(nèi)對腎功能損傷病理狀態(tài)有保護(hù)作用，為雷公藤“有故無殞”的安全用藥提供了依據(jù)。

有故無殞；雷公藤；腎功能保護(hù)；腎臟毒性；毒性差異

雷公藤 Tripterygium wilfordii Hook.f.是衛(wèi)矛科雷公藤屬雷公藤的干燥根及根莖，具有祛風(fēng)除濕、活血化瘀、舒經(jīng)通絡(luò)、消腫止痛、殺蟲止血、清熱解毒等功效［1］，臨床常用于治療各種原發(fā)性和繼發(fā)性腎炎，包括慢性腎小球腎炎、腎病綜合征、過敏性紫癜腎炎、狼瘡性腎炎等疾病，療效顯著［2-4］。但其腎毒性也明顯，已引起國內(nèi)外研究者對其安全性的疑慮［1，5］。該藥的臨床應(yīng)用與中醫(yī)《內(nèi)經(jīng)》中的“有故無殞”思想相吻合。雷公藤的主要毒性成分也是其主要藥效成分［6］，需要正確理解雷公藤的這種保護(hù)和損傷的“雙向作用”，認(rèn)識其“量-效（毒）關(guān)系”，以指導(dǎo)臨床合理用藥。目前，對于雷公藤腎毒性的研究，多集中在其毒性成分、毒理機(jī)制及對以正常動物為研究對象的毒性評價(jià)［7］，未能較好地解釋其臨床應(yīng)用中體現(xiàn)的“有故無殞”思想內(nèi)涵。因此，雷公藤腎毒性評價(jià)不能僅限于在正常動物評價(jià)其毒性大小，更重要的是應(yīng)在疾病模型動物上模擬臨床實(shí)際情況研究其合理用藥減毒的途徑和機(jī)制［8］。本研究中擬基于“有故無殞”思想，以正常和急性腎小管損傷大鼠為研究對象，從腎功能和腎組織形態(tài)等方面探討雷公藤提取物（TWHF）對正常和腎小管損傷急性腎功能衰竭大鼠的效／毒作用差異，客觀評價(jià)雷公藤的腎毒性和腎保護(hù)“雙向作用”，為科學(xué)評價(jià)雷公藤對腎臟的量-效／毒關(guān)系和指導(dǎo)臨床合理、安全用藥提供依據(jù)。

1　資料與方法

1.1儀器、動物與試藥

儀器：BS-300型全自動生化分析儀（邁瑞公司）；TDZ4-WS型臺式低速離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；TP1020型自動脫水機(jī)，RM2135型石蠟切片機(jī)，DM1000型光學(xué)顯微鏡（德國Leica公司）；CS-VI型攤片烤片機(jī)（湖北孝感宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司）；Tissue-Tek TEL組織包埋機(jī)（日本Sakura公司）；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；微波爐（TCL有限公司）；MiniSee圖像采集系統(tǒng)。

動物：雄性SD大鼠80只，SPF級，6～8周齡，體質(zhì)量（180±30）g，購于長沙市天勤生物技術(shù)公司，動物合格證號為SCXK（湘）2015-0003。分籠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，自由進(jìn)食及飲水，實(shí)驗(yàn)室溫度（22±2）℃，相對濕度60%～80%，人工光照約12 h明暗周期，定期消毒。

試藥：雷公藤（湖南省松齡堂中藥飲片有限公司，批號為SL16041501），經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)張志國教授鑒定為衛(wèi)矛科雷公藤屬雷公藤 Tripterygium wilfordii Hook.f.的根及根莖。雷公藤提取物（取一定量雷公藤，加6倍量90%乙醇，加熱蒸餾提取3次，每次1 h；取醇提殘?jiān)?，?0倍量水，加熱提取1 h；合并濾液，冷凍干燥制成粉末，保存?zhèn)溆茫?。重鉻酸鉀（北京嘉世玉禾化工技術(shù)研究院，批號為S50744）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，上海山浦化工有限公司，批號為20121222）；水合氯醛（上海滬試化工有限公司，批號為20151217）。

1.2方法

分組：參考文獻(xiàn)和臨床常用劑量等比設(shè)定4個(gè)TWHF劑量組（每1 kg含3.13，6.25，13.5，27.0 g生藥）。大鼠預(yù)養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為10組，每組8只，即空白組（N），模型組（M），空白組+1倍劑量TWHF組（ND1），空白組+2倍劑量TWHF組（ND2），空白組+4倍劑量TWHF組（ND3），空白組+8倍劑量TWHF組（ND4），模型組+1倍劑量TWHF組（MD1），模型組+2倍劑量TWHF組（MD2），模型組+4倍劑量TWHF組（MD3），模型組+8倍劑量TWHF組（MD4）。

造模：重鉻酸鉀溶于去離子水中，造模劑量為20 mg／（kg·d），模型組于給藥第4天皮下注射1次，造腎小管S1段損傷的急性腎功能衰竭模型。

給藥：將TWHF溶于5%的CMC-Na溶液，按擬訂劑量灌胃給藥，空白組灌以同體積的5%CMC-Na溶液，每天給藥1次，持續(xù)7 d。

常規(guī)指標(biāo)觀察：給藥后，觀察大鼠毛色、飲食及行為活動等一般狀況，分別于給藥前及給藥后第1，3，5，7天稱大鼠體質(zhì)量，并在給藥前、造模后、處死前將大鼠放于代謝籠中，接取尿液，記錄24 h尿量。

腎組織器官臟器系數(shù)：記錄大鼠死亡數(shù)量，將大鼠解剖后，摘取兩腎，用濾紙吸干，稱取質(zhì)量。臟器系數(shù)=器官濕質(zhì)量／體質(zhì)量×100%。

生化指標(biāo)測定：試驗(yàn)第8天，取大鼠股動脈血，室溫放置2 h后離心（3 000 r／min）10 min，得血清樣本，進(jìn)行生化檢測，檢測內(nèi)容主要有血清尿素氮（BUN），血清肌酐（CREA），Ca2+，Na+，K+，Cl-。

腎臟病理組織形態(tài)學(xué)檢查：試驗(yàn)結(jié)束后處死動物，解剖后用冰生理鹽水洗血跡，濾紙吸盡表面水分，精確稱質(zhì)量，將摘取的一側(cè)腎臟立即固定于10%福爾馬林常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，HE常規(guī)染色，并于光鏡下觀察組織病理變化情況。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。各組定量檢測數(shù)據(jù)以X±s表示，兩組間比較采用 t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），多組間比較采用 LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1大鼠一般情況變化

各健康動物中，空白組大鼠精神狀態(tài)良好，行動靈活，毛發(fā)光澤，大小便正常；給予TWHF后，大鼠出現(xiàn)精神不振，被毛臟亂，偶見稀便。給藥期間，各組健康大鼠體質(zhì)量總體呈增長趨勢，但隨著給藥時(shí)間的延長，體質(zhì)量呈現(xiàn)較緩慢的增長狀態(tài)，高劑量（4倍、8倍劑量）組大鼠體質(zhì)量增長抑制趨勢高于低劑量組及空白組，詳見表1。隨著給藥時(shí)間的延長和劑量的增大，有不同程度的尿量減少，呈劑量相關(guān)性，高劑量組嚴(yán)重者尿液顏色加深，呈紅棕色。試驗(yàn)過程中，8倍劑量組大鼠死亡1只。詳見表2。

模型組大鼠以重鉻酸鉀造腎小管S1段損傷的急性腎功能衰竭模型，造模后大鼠表現(xiàn)出毛色無光澤，眼神黯淡，萎靡少動，飲食量減少。造模前，大鼠體質(zhì)量整體水平呈增長趨勢；造模后，體重增長緩慢甚至下降；與模型組比較，給藥1倍和2倍劑量TWHF后，大鼠體質(zhì)量稍有增長，而4倍和8倍劑量組體重增長抑制作用明顯，詳見表1。與空白組比較，模型組大鼠尿量減少明顯，1倍和2倍劑量組尿量減少較高劑量組緩慢，高劑量組隨著給藥時(shí)間的延長，其尿量進(jìn)一步下降，各組大鼠尿液出現(xiàn)紅棕色，甚至血尿，部分動物出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，尤以高劑量明顯，4倍和8倍劑量大鼠各死亡2只，詳見表2。

2.2大鼠腎臟臟器指數(shù)

正常大鼠給予不同劑量TWHF后，與空白組相比，給藥組腎臟臟器指數(shù)均有所增高，高劑量組（4倍和8倍劑量）的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。重鉻酸鉀造模后，與空白組大鼠相比，腎臟臟器指數(shù)顯著升高（P＜0.01）；給予不同劑量TWHF后，與模型組相比，1倍和2倍劑量組腎臟臟器指數(shù)有下降趨勢，但未達(dá)到顯著性，4倍和8倍劑量組腎臟臟器指數(shù)進(jìn)一步升高。

2.3大鼠腎臟功能生化指標(biāo)

表1　各組大鼠給藥前后體質(zhì)量變化情況（n=8）

表2　各組大鼠給藥后腎臟臟器指數(shù)與24 h尿量變化情況（n=8）

表3　TWHF對健康及腎損傷模型大鼠腎功能指標(biāo)的影響（X±s）

不同試驗(yàn)組大鼠腎臟生化指標(biāo)變化見表3。正常大鼠給予不同劑量TWHF后，與空白組相比，2，4，8倍劑量組大鼠BUN和CREA水平顯著增高，且呈一定的量-效關(guān)系；8倍劑量組大鼠K+濃度增高，4倍和8倍劑量組大鼠Na+濃度降低；Ca2+和Cl-濃度無明顯變化。重鉻酸鉀造模后，與空白組大鼠相比，模型組大鼠BUN，CREA水平和K+濃度顯著增高，Ca2+和Na+濃度明顯降低；模型組大鼠給予不同劑量TWHF后，1倍劑量組大鼠BUN，CREA水平和K+濃度降低，Na+濃度升高；2倍劑量組大鼠K+濃度降低，BUN和CREA水平顯著降低，Ca2+濃度顯著升高；4倍和8倍劑量組大鼠BUN，CREA水平和K+，Ca2+濃度進(jìn)一步增高，Na+濃度明顯降低。提示雷公藤在正常大鼠表現(xiàn)出劑量相關(guān)性的腎功能損傷，在腎小管S1段損傷的急性腎功能衰竭模型大鼠，低劑量表現(xiàn)出保護(hù)作用，高劑量表現(xiàn)出加重腎功能損傷作用。

2.4大鼠腎臟組織病理形態(tài)學(xué)

空白組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)基本正常，無明顯病理變化；重鉻酸鉀造模后，模型組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)鏡下可見腎小管細(xì)胞明顯水腫，細(xì)胞顆粒樣變性，腎小管壞死，腎小球囊性擴(kuò)張，部分系膜基質(zhì)增生，腎小管內(nèi)水腫，液體潴留，較多管型等病理改變。與空白組比較，不同TWHF劑量組腎組織有不同程度的腎小管細(xì)胞水腫，腎小管細(xì)胞顆粒樣變性，腎小球囊性擴(kuò)張、系膜基質(zhì)增生，嚴(yán)重者出現(xiàn)間質(zhì)改變和腎小管壞死，呈一定劑量相關(guān)性。與模型組比較，1倍和2倍劑量組腎臟組織損傷有一定程度減輕，4倍和8倍劑量組腎功能損傷進(jìn)一步加重，嚴(yán)重者腎間質(zhì)少量鈣化，皮質(zhì)區(qū)腎小球壞死、鈣化，近皮質(zhì)區(qū)域腎小球、腎小管壞死嚴(yán)重，髓質(zhì)水腫。詳見圖1。可見，雷公藤對正常大鼠表現(xiàn)出腎功能損傷，低劑量在模型大鼠表現(xiàn)出保護(hù)作用，高劑量表現(xiàn)出損傷作用。

圖1　TWHF對健康和腎功能損傷模型大鼠腎臟組織HE染色結(jié)果的影響（×200）

3　?　討論

雷公藤并非傳統(tǒng)劇毒藥物，其不同部位短期給藥產(chǎn)生的腎臟毒性不明顯，但長期使用雷公藤治療慢性疾病，特別是在長期或大量用于腎臟相關(guān)疾病治療時(shí)，其潛在腎毒性不容忽視［9］。本研究中在較大劑量范圍考察了雷公藤毒效關(guān)系，從大鼠給藥后的一般狀況、臟器指數(shù)、血液生化指標(biāo)和腎臟病理組織改變結(jié)果可以看出，在正常生理狀態(tài)下與腎功能損傷病理狀態(tài)下的大鼠，給予不同劑量TWHF所表現(xiàn)出來的毒性結(jié)果存在差異。正常大鼠給予TWHF后，隨著劑量的增加，大鼠體質(zhì)量增長抑制，高劑量組腎臟臟器指數(shù)增加，與腎功能損傷有關(guān)的BUN，CREA，血清高K+和低Na+狀態(tài)呈劑量相關(guān)的增高趨勢，腎臟病理切片顯示最高劑量組MD4大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的腎小球、腎間質(zhì)改變和腎小管壞死。模型組大鼠體質(zhì)量增長明顯抑制，甚至出現(xiàn)體質(zhì)量減輕，腎臟臟器指數(shù)顯著增加，而雷公藤作用于模型組大鼠，在較低劑量（1倍和2倍劑量TWHF）表現(xiàn)出改善BUN，CREA水平和血清高K+、低Na+狀態(tài)的保護(hù)作用，腎臟組織病理損傷程度也有一定減輕，但高劑量時(shí)反而加重了模型組大鼠的腎功能損傷。提示在使用對癥、劑量恰當(dāng)?shù)那闆r下，雷公藤可安全用于腎臟相關(guān)疾病的治療。

很多研究證實(shí)，中藥“有故無殞”的現(xiàn)象是客觀存在的，其思想的實(shí)質(zhì)是研究中藥與特定證候或機(jī)體狀態(tài)之間的對應(yīng)關(guān)系及其內(nèi)在的變化規(guī)律［8，10-11］?，F(xiàn)代研究對雷公藤腎毒性的研究多關(guān)注其物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制對毒效關(guān)系的影響，而忽略了藥物對不同狀態(tài)機(jī)體產(chǎn)生的毒性差異。雷公藤多苷對正常和關(guān)節(jié)炎模型大鼠的肝功能生化指標(biāo)的影響也存在差異，研究結(jié)果顯示，對模型大鼠的影響小于正常大鼠［12］。本研究結(jié)果證實(shí)，雷公藤腎毒性的量-效／毒關(guān)系具有類似規(guī)律，體現(xiàn)了“有故無殞”的思想。雷公藤引起腎毒性的成分為雷公藤多苷、雷公藤甲素［13］，而腎臟具有保護(hù)作用的成分主要為雷公藤多苷、雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯醇［14-15］。這種腎臟保護(hù)活性成分與腎毒性成分的重疊，是腎毒性差異的物質(zhì)基礎(chǔ)，提示雷公藤存在明顯的藥效與毒性“雙向”作用，在臨床應(yīng)用時(shí)劑量范圍的重要性不容忽視。

綜上所述，雷公藤對于腎臟組織損傷病理狀態(tài)有比正常生理狀態(tài)下較低的腎毒性，在一定劑量范圍內(nèi)表現(xiàn)“有故無殞”，安全用于臨床治療的前提是“對癥”，把握不同病理狀態(tài)的量-效／毒差異。后續(xù)試驗(yàn)將研究不同腎功能損傷病理狀態(tài)下的量-效／毒差異與特點(diǎn)，為雷公藤的安全、有效應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

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Study on the Renal Toxicity ofTripterygium Wilfordii Hook.f.on the Basis of Symptom-Based Prescription Theory

Zhang Qin1，2，Ouyang Linqi2，Hu Weihang2，Zuo Yajie2，Li Jianhe1
（1.Department of Pharmacy，The Second Xiangya Hospital of Central South University，Changsha，Hunan，China410011；2.Preparation Center，The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan，China410000）

ObjectiveTo study the differences in the renal toxicity of Tripterygium wilfordii Hook.f.（TWHF）on normal and acute renal failure model rats with tubular S1 damaged.MethodsThe general growth status，organ／body coefficients and serum biochemical indexes were used to investigate the influence of the TWHF on physiological and pathological state.Pathological sections were prepared to observe the damage in renal tissue.ResultsTWHF increased BUN，CREA，and serum high K+and low Na+levels of normal rats in a dose dependent，which was consistent with its general growth state，organ／body coefficients，and kidney damage pathological examination results.Low doses of TWHF improved the state of BUN，CREA，serum high K+and low Na+levels，and reduced the renal pathological damage in a certain degree，which showed protection effect in model rats.However，high doses of TWHF aggravated kidney injury of model rats.ConclusionAlthough TWHF has dose related renal toxicity to normal rats，it also has a protective effect on kidney injury pathological status in certain dose range，which provided a basis for clinical safe application of TWHF based on symptom-based prescription theory.

symptom-based prescription theory；Tripterygium wilfordii Hook.f.；renal protection；renal toxicity；differences in toxicity

R285.5；R282.71

A

1006-4931（2016）20-0025-05

*湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目優(yōu)秀青年基金項(xiàng)目，項(xiàng)目編號：14B132。

張琴（1981-），女，漢族，湖南長沙人，大學(xué)本科，主管藥師，研究方向?yàn)橹兴幹苿?、中藥藥理學(xué)，（電話）0731-85600466（電子信箱）dboyzq1＠163.com；李健和，男，漢族，碩士研究生，副主任藥師，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樾滤庨_發(fā)，本文通訊作者，（電話）0731-85292093（電子信箱）lijianhexy＠126.com。

（2016-06-13；

2016-06-30）