制備脫細(xì)胞全喉-下咽-食管復(fù)合支架用于咽喉重建的實(shí)驗(yàn)研究

呂蝶，侯楠,徐小麗，盧彥青，李京芝，馬瑞娜，崔鵬程

(1.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科， 四川 成都 610599； 2.中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科， 陜西 西安 710038)

頭頸部腫瘤的發(fā)病率較高，約占腫瘤發(fā)病率的第6位。據(jù)報(bào)道每年世界范圍內(nèi)頭頸腫瘤的新增例數(shù)為686 000例，因頭頸腫瘤死亡的例數(shù)為376 000例[1-2]。頭頸腫瘤中部分類型的腫瘤由于其發(fā)病機(jī)制的不同，易并發(fā)多源性腫瘤，如食管癌的患者同時(shí)并發(fā)下咽癌或者喉癌。因而手術(shù)中同時(shí)切除下咽、部分喉或全喉及食管的案例并不少見。但大面積缺損后所面臨的器官修補(bǔ)及功能重建則是臨床醫(yī)生的一大挑戰(zhàn)。

隨著組織工程技術(shù)的快速發(fā)展，體外構(gòu)建具有功能的器官或組織為器官重建提供了新思路。常用的支架材料主要包括人工材料及天然材料。細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)作為天然架材料，由于具有細(xì)胞生長(zhǎng)的天然微觀結(jié)構(gòu)及生物微環(huán)境的優(yōu)點(diǎn)，成為目前組織工程研究的熱點(diǎn)。灌注法脫細(xì)胞技術(shù)可制備天然ECM支架，Ott團(tuán)隊(duì)首用灌注脫細(xì)胞的方法成功制備了保留天然結(jié)構(gòu)的三維的無(wú)細(xì)胞心臟ECM支架，并成功模擬出具有一定收縮功能的心臟組織[3]。后來(lái)有大量文獻(xiàn)報(bào)道用脫細(xì)胞的方法制備了腎、肝、胰腺、肺、食管、二尖瓣等脫細(xì)胞支架[4-10]。目前尚未有制備脫細(xì)胞全喉-下咽-食管復(fù)合支架用于下咽癌術(shù)中咽喉重建的文獻(xiàn)報(bào)道。前期我們已參考Ott灌注法技術(shù)制備了天然脫細(xì)胞食管支架及喉支架，支架保留了ECM的復(fù)雜結(jié)構(gòu)與成分，具有體外構(gòu)建具有工程的食管或喉支架的可行性[11-14]。本實(shí)驗(yàn)我們采用上述灌注法制備天然脫細(xì)胞全喉-下咽-食管復(fù)合支架，并復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchyml stem cells, BMSCs)，意在為下咽癌咽喉重建提供一種新型修補(bǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

3月齡新西蘭大白兔36只，體重約3.0 kg；4周齡10只，體重約0.5 kg；雌雄不限，均由成都醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。十二烷基硫酸鈉(SDS)、曲拉通(TritonX 100)、淋巴細(xì)胞分離液、L-DMEM 培養(yǎng)基、腺苷、肝素、水合氯醛及胰蛋白酶均為Sigma公司產(chǎn)品。胎牛血清購(gòu)于杭州四季青生物制品公司。青霉素、鏈霉素由哈爾濱制藥廠生產(chǎn)。掃描電鏡(Hitachi公司，日本)；倒置顯微鏡(Nikon 公司，日本)。

1.2 制備去細(xì)胞全喉-下咽-食管復(fù)合支架

3月齡新西蘭大白兔30只，用3.5 mL/kg 10%水合氯醛行腹腔麻醉，將大白兔仰臥固定于專用手術(shù)臺(tái)上，頸部備皮，手術(shù)在無(wú)菌條件下進(jìn)行。沿左側(cè)耳緣靜脈全身肝素化后常規(guī)消毒鋪巾，縱行切開頸前正中皮膚，逐層分離皮下組織、頸前帶狀肌致充分暴露喉、下咽、氣管及雙側(cè)頸總動(dòng)脈，保留咽升動(dòng)脈、甲狀腺上動(dòng)脈及喉上動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈其余分支及分支供應(yīng)的肌肉，游離出帶血管的完整喉體-下咽-食管復(fù)合體，用靜脈輸液針行頸總動(dòng)脈插管，采用輸液泵持續(xù)灌注脫細(xì)胞劑，灌注速度為50 mL/h。灌注順序參照Ott 等報(bào)道的方法：首先將含有肝素和腺苷的磷酸鹽緩沖生理鹽水液灌注15 min，然后用含有1%SDS的去離子水灌注16 h，去離子水灌注15 min，再用1%Triton X的去離子水灌注30 min，最后用含雙抗的磷酸鹽緩沖生理鹽水沖洗48 h。全喉-下咽-食管復(fù)合體離體后所有操作均在無(wú)菌操作臺(tái)中進(jìn)行。將制備的去細(xì)胞支架進(jìn)行大體觀察、HE染色[12]、免疫熒光染色[15]、CCK-8檢測(cè)[16]等檢測(cè)。

1.3 原代BMSCs的分離及提取

取4周齡新西蘭大白兔(10只)，體重約0.5 kg，10%水合氯醛3.5 mL/kg 經(jīng)腹腔注射麻醉后備皮，將兔側(cè)臥位置于無(wú)菌操作臺(tái)上，碘伏消毒后鋪洞巾，用16號(hào)骨髓穿刺針自股骨大轉(zhuǎn)子處穿刺抽取骨髓，注入離心管中，加入適量肝素并適當(dāng)振動(dòng)離心管，加入等體積L-DMEM培養(yǎng)液，輕輕吹打成細(xì)胞懸液。按2∶1的體積比將細(xì)胞懸液加入淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，在離心機(jī)中以1 500 r/min速度離心15 min，取出后液體分為4層，用移液槍吸取第2層移至無(wú)菌的離心管中，加入等體積的不完全L-DMEM培養(yǎng)液混勻后1 500 r/min離心10 min，棄上清液，重復(fù)此操作 2 遍。向離心管中加入10%胎牛血清吹打成細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)皿中，置于 5%CO237℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d后首次換液，以后每2天換1次液。細(xì)胞鋪滿瓶底約80%～90%時(shí)用0.2%胰蛋白酶(含0．02%ETA) 消化，以 1∶3 接種傳代。

1.4 再細(xì)胞化支架的制備、表征及體內(nèi)異位移植

將細(xì)胞計(jì)數(shù)為(7～9)×106個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液用顯微注射針多點(diǎn)注射脫細(xì)胞支架的ECM，每次每點(diǎn)注射200 μL，將再細(xì)胞化的復(fù)合體支架置于含血清的培養(yǎng)基中，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育1 d，SEM觀察體外再細(xì)胞化支架上細(xì)胞的粘附情況。按上述麻醉方式成功麻醉受體兔后將其固定于手術(shù)操作臺(tái)，手術(shù)在無(wú)菌條件下進(jìn)行。腹部脫毛后常規(guī)消毒鋪單，于劍突下約行長(zhǎng)約2 cm的縱行切口，逐層分離皮下組織至腹膜，打開腹膜暴露大網(wǎng)膜，將包裹于大網(wǎng)膜內(nèi)，可吸收線縫合固定，逐層縫合腹部。術(shù)后常規(guī)肌肉注射青霉素3 d，每天消毒傷口，預(yù)防感染。1周后取出細(xì)胞-支架復(fù)合物，HE染色觀察細(xì)胞在支架上的生長(zhǎng)情況。

1.5 去細(xì)胞全喉-下咽-食管復(fù)合支架的體內(nèi)異位移植

取3月齡新西蘭大白兔作為受體兔，隨機(jī)分為對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組(每組3只)，將去細(xì)胞全喉-下咽-食管復(fù)合支架及新鮮復(fù)合體支架按上述操作行異體異位移植，分別于埋植后 4、 8周及12周時(shí)處死受體兔，取出支架行HE染色，觀察周圍組織對(duì)支架的免疫反應(yīng)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 15.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 去細(xì)胞全喉-下咽-食管復(fù)合支架大體觀

脫細(xì)胞全喉-下咽-食管復(fù)合支架灌注后體積與新鮮支架無(wú)明顯差異，喉肌、食管、下咽組織保留完整，組織呈蒼白透明狀，新鮮組織呈鮮紅色。見圖1。

2.2 再細(xì)胞化的表征

去細(xì)胞支架具有良好的生物相容性，與對(duì)照組相比，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響無(wú)明顯差異(P>0.05)。見圖2。

細(xì)胞-支架復(fù)合物體外培養(yǎng)1 d后掃描電鏡(scanning electron microscope, SEM)顯示細(xì)胞成功粘附于去細(xì)胞支架上，細(xì)胞形態(tài)較大，呈梭形。見圖3A；HE染色顯示體內(nèi)移植1周后細(xì)胞在支架上粘附并增殖生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)呈梭形，體積較大。見圖3B。

2.3 去細(xì)胞化支架的表征

HE染色顯示除喉軟骨細(xì)胞保留外其余組織無(wú)細(xì)胞成分殘留，僅剩ECM，且ECM三維結(jié)構(gòu)保存完整，而新鮮組織內(nèi)細(xì)胞成分存在。見圖4。

SEM顯示去細(xì)胞喉肌及食管僅剩三維的、蜂窩狀的ECM，結(jié)構(gòu)完整、清晰，無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)殘留，而新鮮組織致密。見圖5。

免疫熒光染色顯示脫細(xì)胞支架中ECM無(wú)主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ(MHCⅡ)存在，ECM不具備免疫原性，軟骨組織表面MHCⅡ表達(dá)較弱，DAPI染色顯示脫細(xì)胞支架除軟骨組織外其余組織均無(wú)細(xì)胞核殘留。見圖6。體內(nèi)移植4周后支架被大網(wǎng)膜完全包裹，HE染色顯示去細(xì)胞支架周圍組織的免疫反應(yīng)明顯弱于對(duì)照組，脫細(xì)胞支架內(nèi)殘留細(xì)胞成分的喉肌炎癥反應(yīng)明顯重于其他無(wú)細(xì)胞殘留的ECM。8周后去細(xì)胞支架體積明顯縮小，周圍組織炎癥較4周時(shí)減輕，對(duì)照組受體兔均未活至第8周，12周時(shí)去細(xì)胞支架僅剩喉軟骨，ECM完全降解。見圖7。

3 討論

頭頸腫瘤由于其自身獨(dú)特性，常并發(fā)多源腫瘤，如食管癌并發(fā)下咽癌、喉癌。這類患者通常采用手術(shù)聯(lián)合放化療，但由于腫瘤浸潤(rùn)范圍廣，術(shù)中切除范圍大，咽喉解剖結(jié)構(gòu)及功能重建成一大難題。目前，臨床上大多采用自身異位組織瓣修補(bǔ)缺損，雖然這可避免免疫排斥反應(yīng)，但這類方式也有其自身缺陷。一方面，用自身皮瓣異位修補(bǔ)咽喉缺損會(huì)對(duì)患者造成二次傷害，且一旦皮瓣壞死，難以進(jìn)行多次修補(bǔ)，另一方面，咽喉部解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜、功能較多，這種方法不能完成功能的重建，無(wú)法避免對(duì)患者術(shù)后吞咽、發(fā)音等功能的損傷。本實(shí)驗(yàn)采用灌注法制備去細(xì)胞全喉-下咽-食管復(fù)合天然生物支架，保留天然咽喉-食管的解剖結(jié)構(gòu)及ECM成分，意在為下咽癌術(shù)中缺損提供一種新型修補(bǔ)材料。

ECM是由細(xì)胞合成、分泌的生物大分子，主要包括間質(zhì)和細(xì)胞周圍基質(zhì)。間質(zhì)主要是一種以Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白、纖連蛋白、彈性蛋白和多種蛋白聚糖為主要成分的松散的膠原纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。細(xì)胞周圍基質(zhì)是由IV型膠原蛋白、層粘連蛋白、巢蛋白以及硫酸乙酰肝素蛋白聚糖等構(gòu)成的蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[17]。他們共同為細(xì)胞提供生長(zhǎng)附著的三維空間結(jié)構(gòu)，同時(shí)影響著細(xì)胞的增殖、遷移、分化、凋亡等生理活動(dòng)[18-19]。組織工程技術(shù)的三大基本要素包括種子細(xì)胞、生長(zhǎng)因子和支架材料。種子細(xì)胞即具有干細(xì)胞潛能的細(xì)胞，通過(guò)遷移、增殖及分化參與組織工程的重建。三大要素缺一不可，而ECM同時(shí)具有生長(zhǎng)因子及支架材料兩重功能，所以構(gòu)建天然脫細(xì)胞全喉-下咽-食管復(fù)合支架可為下咽咽喉重建提供新材料。異體支架修補(bǔ)缺損可避免自身皮瓣修補(bǔ)造成二次傷害，且來(lái)源豐富，能滿足皮瓣壞死后的再次修補(bǔ)。但機(jī)體對(duì)異體材料的免疫排斥是其面臨的最大問(wèn)題。組織的主要組織相容性復(fù)合體為MHCI和MHCII，主要存在于細(xì)胞表面，而ECM無(wú)免疫原性[20]。本研究通過(guò)甲狀腺上動(dòng)脈灌注1%SDS及曲拉通去除全喉-下咽-食管的細(xì)胞結(jié)構(gòu)及成分，以此消除異體支架的免疫原性，同時(shí)保留天然ECM的結(jié)構(gòu)及成分。本實(shí)驗(yàn)對(duì)脫細(xì)胞全喉-下咽-食管復(fù)合支架進(jìn)行組織學(xué)分析證實(shí)脫細(xì)胞支架已完全去除除軟骨細(xì)胞外的所有細(xì)胞，僅剩ECM。且ECM保留了完整的呈蜂窩狀天然結(jié)構(gòu)，這與張建團(tuán)隊(duì)研究脫細(xì)胞肌肉支架的結(jié)果相同，且他們的研究結(jié)構(gòu)表示通過(guò)灌注法制備的脫細(xì)胞支架能保留微血管床，利于脫細(xì)胞支架體內(nèi)再血管化[21]。ECM是細(xì)胞進(jìn)行增殖、遷移、分化、凋亡等一系列生物活動(dòng)的場(chǎng)所，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，呈蜂窩狀，人工支架材料難以模擬。它由細(xì)胞合成、分泌的大分子組成，成分眾多，種類豐富，影響著細(xì)胞的生長(zhǎng)生理活動(dòng)，而人工材料成分較為單一，不具有天然ECM的成分復(fù)雜性[22]。

軟骨組織不具免疫原性或僅具低免疫原性[23]。Ma等[15]異體異位移植全喉3個(gè)月后發(fā)現(xiàn)去細(xì)胞喉支架ECM成分完全降解，喉軟骨未被破壞，且包裹去細(xì)胞喉支架的大網(wǎng)膜僅具弱炎癥反應(yīng)，證實(shí)了喉軟骨的低免疫原性，提示軟骨組織進(jìn)行異體修補(bǔ)具有可行性。本研究中我們將去細(xì)胞全喉-下咽-食管復(fù)合體異位種植于受體兔大網(wǎng)膜內(nèi)，1個(gè)月時(shí)去細(xì)胞復(fù)合體大體結(jié)構(gòu)尚完整存在，包裹處大網(wǎng)膜稍增厚，3個(gè)月后取出支架，發(fā)現(xiàn)喉軟骨仍存在，ECM完全降解。而對(duì)照組的受體兔大網(wǎng)膜放置新鮮全喉-下咽-食管復(fù)合體后均于術(shù)后1周內(nèi)死亡。支架周圍充滿膿性分泌物，組織結(jié)構(gòu)被破壞，且大網(wǎng)膜與周圍組織粘連嚴(yán)重，對(duì)照組受體兔死因考慮是機(jī)體的超急性免疫排斥反應(yīng)或腹腔嚴(yán)重粘連導(dǎo)致腸梗阻。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明本實(shí)驗(yàn)制備的去細(xì)胞復(fù)合體僅具低免疫原性，有作為異體材料進(jìn)行重建咽喉的潛力。Ott團(tuán)隊(duì)通過(guò)灌注法制備去細(xì)胞腎臟系統(tǒng)，且成功原位移植于異體兔內(nèi)，并產(chǎn)出原尿[8]。本實(shí)驗(yàn)未進(jìn)行原位移植的原因?yàn)榫S持動(dòng)物鼻飼腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)難以維持，動(dòng)物無(wú)法配合，腸外營(yíng)養(yǎng)操作困難、對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件要求高，故本實(shí)驗(yàn)采用異位移植。

通過(guò)CCK-8法檢測(cè)去細(xì)胞支架的細(xì)胞生物相容性，去細(xì)胞支架提取物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)抑制作用，體外將細(xì)胞種植于去細(xì)胞支架上，SEM證實(shí)細(xì)胞在支架上成功粘附，體內(nèi)種植1周后HE染色提示種子細(xì)胞在支架上粘附并生長(zhǎng)。且支架周圍僅有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，提示脫細(xì)胞支架具有良好的生物相容性及低免疫原性，且脫細(xì)胞全喉-下咽-食管支架復(fù)合種子細(xì)胞制備天然器官具有可行性。Citro等[10]團(tuán)隊(duì)用灌注法脫細(xì)胞技術(shù)獲得肺臟ECM，再?gòu)?fù)合種子細(xì)胞成功制備出具有一定分泌功能的胰島。咽喉部解構(gòu)機(jī)構(gòu)復(fù)雜，由多個(gè)喉軟骨、聲韌帶、喉肌、梨狀窩、環(huán)后隙等結(jié)構(gòu)組成，且食管為下咽向下延伸形成，組織結(jié)構(gòu)相同，下咽癌常侵及食管，人工材料支架及自體皮瓣難以模擬天然的咽喉解剖結(jié)構(gòu)。且咽喉部同時(shí)兼具吞咽、呼吸及發(fā)音的功能，術(shù)中構(gòu)建具有功能的咽喉顯得尤為重要。

本實(shí)驗(yàn)表明通過(guò)頸總動(dòng)脈灌注去離子劑制備脫細(xì)胞全喉-下咽-食管支架，且脫細(xì)胞復(fù)合支架保留了天然ECM的結(jié)構(gòu)及成分，支架幾乎無(wú)免疫原性，有作為異體移植修補(bǔ)材料的潛能，可避免自身組織瓣移植對(duì)患者造成的二次傷害，同時(shí)能解決自體皮瓣及人工材料均無(wú)法滿足細(xì)胞生長(zhǎng)天然環(huán)境的復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)及穩(wěn)態(tài)環(huán)境的問(wèn)題。但本實(shí)驗(yàn)?zāi)壳吧形赐瓿蓪?duì)脫細(xì)胞全喉-下咽-食管支架的體外功能重建，下一步我們將分化誘導(dǎo)后的干細(xì)胞復(fù)合于脫細(xì)胞支架，意在構(gòu)建出具有一定收縮功能的的食管及喉肌。

4 結(jié)論

下咽癌患者確診時(shí)多已進(jìn)入晚期，手術(shù)切除范圍大，術(shù)中咽喉重建是目前臨床上面臨的難題。我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了通過(guò)頸總動(dòng)脈灌注1%SDS及曲拉通制備的脫細(xì)胞全喉-下咽-食管支架，可天然ECM的結(jié)構(gòu)和成分，同時(shí)僅具低免疫原性，具有成為天然異體支架修補(bǔ)下咽癌缺損的前景。