油茶根際土壤解磷菌的篩選、鑒定及培養(yǎng)條件

劉小玉，付登強，賈效成，陳良秋

(中國熱帶農業(yè)科學院椰子研究所，海南 文昌 571339)

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油茶根際土壤解磷菌的篩選、鑒定及培養(yǎng)條件

劉小玉，付登強，賈效成，陳良秋

(中國熱帶農業(yè)科學院椰子研究所，海南 文昌 571339)

從油茶根際土壤中分離篩選出7株溶磷細菌，根據透明圈法和鉬銻抗比色法綜合分析，最終得出菌株4-Y-06溶磷活性最強。通過菌落形態(tài)特征、生理生化特征、16S rDNA序列和系統(tǒng)發(fā)育分析等研究，初步鑒定菌株 4-Y-06為嗜氣芽孢桿菌。同時，研究了不同碳源、氮源、C/N、pH、以及溫度等不同培養(yǎng)條件對菌株4-Y-06溶磷效果的影響。結果表明：解磷菌4-Y-06 在碳源為蔗糖、氮源為硫酸銨、C/N為40:1、pH 7.0～7.5、30 ℃條件下解磷效果最好。

解磷菌；碳源；氮源；培養(yǎng)條件

油茶是我國南方特有的木本油料作物，與油棕、油橄欖、椰子并稱為世界四大木本油料作物。近年來，我國食用植物油消費量持續(xù)增長，需求缺口不斷擴大，食用植物油安全問題日益突出。油茶作為我國種植面積最大、產油量最高的木本油料作物，是健康優(yōu)質食用油的重要來源。因此努力發(fā)展油茶產業(yè)提升我國食用油自給率，保障國家食用油安全具有重要意義。磷是是影響作物產量的重要限制因子之一，土壤缺磷直接影響農作物的生長。我國缺磷耕地面積占74 %，且土壤中95 %以上的磷為無效態(tài)，很難被植物直接吸收利用[1]。但是土壤與植物根際中存在大量解磷菌，能夠將植物難以吸收利用的磷轉化為易被植物吸收利用的磷[2]。有研究表明海南油茶在低磷條件下可正常生長，未表現(xiàn)出明顯的缺磷癥狀[3]。此外，也有研究表明油茶根際土壤中存在溶磷菌[4]，油茶根際溶磷菌的高效溶磷作用可能是油茶適應低磷脅迫的重要機理之一。

施用解磷微生物能夠溶解土壤中難溶性磷，提高土壤有效磷含量，促進作物生長[5-7]。但不同種類的解磷菌，不僅解磷能力存在巨大的差異，而且解磷機理也可能不一樣。另外，培養(yǎng)基中碳源[8]、氮源、磷源和無機鹽[9]等也會影響解磷菌生長或改變其生理代謝途徑，從而影響其解磷效果。也有學者認為微生物的解磷能力可能與它分泌有機酸類物質有關，也可能存在多個解磷機理[10]。本實驗通過研究不同碳源、氮源、C/N、pH值及溫度對菌株4-Y-06溶磷效果的影響，建立菌株4-Y-06的擴繁技術體系，可為生產上研制油茶專用溶磷菌肥提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

供試土壤采自五指山南圣、水滿等地油茶林的油茶根際土壤。

1.2 溶磷細菌的篩選與鑒定

1.2.1 溶磷細菌的分離與篩選 采用稀釋平板法進行溶磷菌的分離，溶磷圈法定性分析菌株的溶磷能力，鉬銻抗比色法定量測定溶磷菌的溶磷能力，具體方法詳見參考文獻[11]。菌株溶磷能力的計算公式如下：

P=K×V/V1

其中：P為有效磷增量；K為從標準曲線查得顯色液的磷含量(mg/L)；V為顯色時溶液定容的體積(mL)；V1為顯色時吸取上清液的體積(mL)。

1.2.2 溶磷細菌的鑒定 參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對菌株4-Y-06的菌落形態(tài)特征及主要生理生化特征進行試驗和觀察記錄。采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株4-Y-06的DNA。PCR 擴增選用通用引物27 F 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492 R 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。反應體系50 μl (1μl模板、1 μl 1492 R、1 μl 27 F、25 μl PCR mastermix、22 μl ddH2O)。將PCR 產物送至華大基因科技股份有限公司進行測序。經測序獲得溶磷菌株4-Y-06的16S rDNA序列，將該序列通過Blast程序與GenBank中核酸數據進行比對分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi),采用BioEdit、Mega5.0等軟件對菌株進行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰接法(Neighbour-joining,NJ法)構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 不同培養(yǎng)條件對菌株菌株4-Y-06溶磷能力的影響

1.3.1 不同碳源對菌株4-Y-06溶磷能力的影響 以有機磷培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，分別設葡萄糖、果糖、可溶性淀粉、蔗糖、麥芽糖、乳糖等為碳源，均以等量碳量加入培養(yǎng)基中。于28 ℃、200 r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)7 d后測定菌株4-Y-06數量、菌液pH和水溶性磷含量。

1.3.2 不同氮源對菌株4-Y-06溶磷能力的影響 以有機磷培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，分別設硝酸鉀、硫酸銨、尿素、硝酸銨等為氮源，均以等量氮量加入培養(yǎng)基中。于28 ℃、200 r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)7 d后測定菌株4-Y-06數量、菌液pH和水溶性磷含量。

1.3.3 不同C/N對菌株4-Y-06溶磷能力的影響 以有機磷培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，分別以葡萄糖和硫酸銨為碳源和氮源，設C/N為40∶1、20∶1、8∶1等3種處理。于28 ℃、200 r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)7 d后測定菌株4-Y-06數量、菌液pH和水溶性磷含量。

1.3.4 不同pH對菌株4-Y-06溶磷能力的影響 以有機磷培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，將基礎培養(yǎng)基的pH值分別設為5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，于28 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)7 d后測定菌株4-Y-06數量、菌液pH和水溶性磷含量。

1.3.5 不同溫度對菌株4-Y-06溶磷能力的影響 以有機磷培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，將培養(yǎng)溫度設為24、26、28、30、32、34、36 ℃，然后置于200 r/min搖床培養(yǎng)7 d后測定菌株4-Y-06數量、菌液pH和水溶性磷含量。

1.3.6 菌體數量、pH和水溶性磷含量的測定 將培養(yǎng)7 d后的菌液低速(1500 r/min)離心3 min，然后取4 mL 菌液用等體積1 mol/L HCl稀釋，目的是除去上清液中殘留的碳酸鈣顆粒，采用平板計數法計算菌株的數量。剩余的菌液再經10 000 r/min離心10 min后用pH計測定上清液pH值，最后用鉬銻抗比色法測定上清液中水溶性磷含量。

1.4 數據處理

數據采用Excel和SAS軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 溶磷細菌的分離純化

共分離篩選出7株能產生明顯溶磷圈的細菌，對7株細菌的形態(tài)進行觀察，用溶磷圈法對各菌株的D/d值進行測定(表1)。另外，菌株4-Y-06在有機磷培養(yǎng)基上出現(xiàn)的透明圈如圖1。

2.2 溶磷細菌的溶磷能力

各菌株發(fā)酵培養(yǎng)7 d后測定其有效磷含量，結果(表2)發(fā)現(xiàn)7株溶磷菌溶解有機磷能力差異顯著，有效磷含量在 34.76～168.74 mg/L，與不接菌對照(23.99 mg/L)相比，有效磷增量在10.77～144.75 mg/L，增幅在44.8 %～603.4 %。菌株4-Y-06的溶磷量為168.74 mg/L，比CK增加了7倍，溶磷效果顯著高于其他菌株。

2.3 菌株鑒定

2.3.1 菌株4-Y-06的形態(tài)特征 菌株4-Y-06在LB培養(yǎng)基上生長較好，速度快，培養(yǎng)48 h后，菌落為圓形，乳白色，不透明，濕潤，扁平，無色素產生，菌落小。

表1 溶磷菌培養(yǎng)7 d的菌落特征

注：1)快-12 h后可觀察到生長，中等-24 h可觀察到生長，慢—48 h后可觀察到生長 ；2)+生長較差，++生長一般，+++生長良好。

Note:1)Fast-growth is observed after 12 hours, medium-growth is observed after 24 hours, slow-growth is observed after 48 hours;

2)+ poor growth, ++ growth generally,+++ good growth.

圖1 菌株4-Y-06在有機磷培養(yǎng)基上的溶磷圈Fig.1 Phosphate dissolving circle of strain 4-Y-06 in medium

2.3.2 菌株4-Y-06的生理生化特征 菌株淀粉水解試驗、吲哚試驗、V-P試驗、明膠液化試驗、H2S試驗呈陰性；過氧化氯酶試驗、硝酸鹽還原試驗、氧化酶試驗呈陽性；能利用葡萄糖。

2.3.3 16S rDNA序列測定及其系統(tǒng)發(fā)育分析 將菌株4-Y-06的16S rDNA進行PCR擴增得到一條1500 bp左右的條帶，經序列測定，其大小為1351 bp。經BLAST相似性分析，發(fā)現(xiàn)菌株 4-Y-06與GenBank中的AJ831844(Bacillusaerophilus28KT)同源性最高，相似性達100%。根據同源性從高到低的院長，挑取7株菌株的16S rDNA序列，運用BioEdit、Mega5.0等軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)

表2 有機磷液體培養(yǎng)基中接種7 d的溶磷量

注：同列數據后不同小寫字母表示0.05水平上的差異顯著性，下同。 Note:Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level. The same as below.

2.4 不同培養(yǎng)條件對菌株4-Y-06溶磷能力的影響

2.4.1 不同碳源對菌株4-Y-06溶磷能力的影響 從表3可見，不同碳源顯著影響解磷菌的溶磷能力。當以蔗糖為唯一碳源時，菌株4-Y-06表現(xiàn)出最強的解磷能力，溶磷量可達179.75 mg/L。供試的6 種碳源對菌株4-Y-06解磷效果的高低順序為：蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖、可溶性淀粉、乳糖。菌體生長量變化趨勢與溶磷量相似，蔗糖為唯一碳源時解磷菌的生長量顯著高于其他碳源。綜合溶磷量和菌株數量可以看出，蔗糖為碳源時菌株4-Y-06溶磷能力最強。另外，各處理培養(yǎng)7 d后發(fā)酵液的pH值均下降，以蔗糖處理的降幅最大，pH 5.82，這有可能是菌株4-Y-06在發(fā)酵過程中不斷產生有機酸，從而引起發(fā)酵液的pH下降。

2.4.2 不同氮源對菌株4-Y-06溶磷能力的影響 從表4可以看出，不同氮源顯著影響解磷菌的溶磷能力，其中以硫酸銨為唯一氮源時，菌株4-Y-06的溶磷量達到最高(168.43 mg/L)，同時培養(yǎng)介質pH值的降幅和發(fā)酵液中菌株4-Y-06的數量也分別達到最大?？赡苁遣煌从绊懥司?-Y-06的代謝途徑，從而改變其分泌的次生代謝產物組分，最終表現(xiàn)出不同的解磷能力。

圖2 菌株4-Y-06的同源性分析Fig.2 Homology analysis of strain 4-Y-06

碳源Carbonsources溶磷量(mg/L)Phosphatesolubilizationcapacity菌株數量(cfu/mL)NumberofstrainspH葡萄糖167.51b2.3×1010a6.12±0.06果糖115.48c5.7×109b6.30±0.12可溶性淀粉52.53c3.2×107d6.12±0.09蔗糖179.75a4.6×1010a5.82±0.08麥芽糖68.68d2.9×108c6.19±0.18乳糖34.62f4.6×106e6.03±0.06

2.4.3 不同C/N對菌株4-Y-06溶磷能力的影響 表5表明，菌株4-Y-06溶磷能力隨著C/N的減小而顯著減少，當C/N為40∶1時，其溶磷量最高，達到184.35 mg/L，是C/N為20∶1處理的1.13倍，C/N為8∶1處理的2.21倍，但是從培養(yǎng)介質的pH變化來看，3個處理之間相差不大。菌體數量在C/N為40∶1時達到最大，8∶1時較少。

2.4.4 不同pH對菌株4-Y-06溶磷能力的影響 表6表明，不同pH顯著影響菌株4-Y-06的溶磷能力，其中pH為7.0時，溶磷量達到最大(171.43 mg/L)，pH為7.5時次之(162.78 mg/L)。pH為7.0和7.5時菌株數量顯著大于其他處理，綜合溶磷量及菌株數量可以看出，菌株4-Y-06最適pH為7.0～7.5。此外，各處理的終pH值均比初始pH小，有可能是菌株4-Y-06在發(fā)酵過程中產生有機酸，導致pH值降低。

2.4.5 不同溫度對菌株4-Y-06溶磷能力的影響 表7表明，不同溫度顯著影響菌株4-Y-06的溶磷能力，當溫度為30 ℃時，其溶磷量達到最大(183.78 mg/L)，菌株數量也達到最高(4.3×1010cfu/mL)，說明菌株4-Y-06最適溫度為30 ℃。各處理后發(fā)酵液的pH值差異不顯著，但均比初始pH值小，可能是發(fā)酵過程中產有機酸的原因。

3 討 論

郝晶等[12]認為菌株的D值，D/d和溶磷量之間并不總是呈正相關關系。本研究結合溶磷圈法和鉬銻抗比色法綜合分析，最終篩選出一株解磷效果最強的菌株4-Y-06。然而，解磷微生物的解磷作用并不是一成不變的，隨著外界環(huán)境或是營養(yǎng)物質的變化，會改變解磷菌的生長代謝途徑，甚至影響解磷菌的生長和繁殖，從而導致解磷效果的不穩(wěn)定。有關研究表明，溶磷能力的大小主要是由菌株的特性所決定的，在不同的條件下，菌株的解磷能力有很大差異[13]。此外，虞偉斌等[14]報道同一株磷細菌在不同的碳氮源或C/N時表現(xiàn)的解磷能力并不一致，解磷菌表現(xiàn)出的解磷能力與其所處環(huán)境有很大關系。趙小蓉等[13]研究表明，菌體的生長量與溶磷量間并不是總成正相關關系，有時有機酸的作用更大。不同的碳源會改變菌株分泌有機酸種類，Patel等[15]發(fā)現(xiàn)Citrobactersp. DHRSS解磷菌以蔗糖和果糖為碳源時主要分泌乙酸，當以葡萄糖和麥芽糖為碳源時主要分泌葡萄糖酸。劉曉芳等[16]報道，兩株黑曲霉ML2、ML4隨著C/N的增加，菌體生長量隨之增大，菌株的溶磷量先是隨C/N的升高而升高，后又降低，在C/N為35∶1時達到最大。本研究發(fā)現(xiàn)菌株4-Y-06在碳源為蔗糖、氮源為硫酸銨、C/N為20∶1的培養(yǎng)條件下更適合發(fā)揮其解磷作用，說明不同的菌株都有自身最適合的培養(yǎng)條件。此外，經研究發(fā)現(xiàn)，各處理經發(fā)酵7 d后，上清液pH值均比初始pH值低，這有可能是菌株4-Y-06在發(fā)酵過程中不斷產生有機酸，有機酸不斷溶解培養(yǎng)基中的不溶性卵磷脂，致使發(fā)酵液中的可溶性磷含量不斷增加，有機酸的不斷產生同時引起發(fā)酵液的pH值下降，這與賀夢醒[17]的研究結果基本一致。

表4 不同氮源對菌株4-Y-06溶磷效果的影響

表5 不同C/N對菌株4-Y-06溶磷效果的影響

表6 不同pH對菌株4-Y-06溶磷效果的影響

表7 不同溫度對菌株4-Y-06溶磷效果的影響

4 結 論

采用溶磷圈法和鉬銻抗比色法綜合分析，最終得出菌株4-Y-06溶磷活性最強。結合菌株4-Y-06的菌落形態(tài)特征、生理生化試驗、16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析等研究，初步鑒定菌株4-Y-06為嗜氣芽孢桿菌(Bacillusaerophilus)。且經研究表明菌株4-Y-06在碳源為蔗糖、氮源為硫酸銨、C/N為40∶1、pH 7.0～7.5、30 ℃條件下解磷效果最好。

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(責任編輯 李 潔)

Isolation, Identification and Culture Condition of Phosphate-solubilizing Bacteria Derived from Camellia Rhizosphere Soil

LIU Xiao-yu，F(xiàn)U Deng-qiang，JIA Xiao-cheng, CHEN Liang-qiu

(Coconut Research Institute, CATAS, Hainan Wenchang 571339，China)

Seven strains phosphate solubilizing bacteria were screened from the rhizosphere of camellia , and strain 4-Y-06 with the highest capacity of solubilizing phosphate was gained, by utilizing the method of transparent zone and molybdenum-antimony anti-spectrophotometric. According to morphology of the colony , physiological and biochemical properties, 16S rDNA and phylogenetic analysis, Strain 4-Y-06 was identified asBacillusaerophilus. In addition, the ability of phosphate solubilization by strain 4-Y-06 was studied with different cultivation conditions including differenr carbon sources,nitrogen forms,C/N,pH,temperatures. The results showed that strain 4-Y-06 had the highest capacity of phosphate solubilization when sucrose was used as carbon source,ammonium sulfate was used as nitrogen form,C/N was 40∶1，pH was 7.0-7.5 and the temperature was 30 ℃.

Phosphate solubilizing bacteria；Carbon source；Nitrogen form；Cultivation condition

1001-4829(2016)11-2637-06

10.16213/j.cnki.scjas.2016.11.023

2015-12-28

海南省產學研一體化專項項目(cxy20150020)

劉小玉(1986-),女,江西九江人，碩士研究生,研究實習員,主要從事土壤微生物與油茶豐產栽培技術研究，E-mail:liuxiaoyu06120210@163.com。

S714.4

A