豬流行性腹瀉病毒變異毒株、經(jīng)典毒株及弱毒疫苗株多重RT-PCR鑒別檢測方法的建立及應(yīng)用

秦毅斌，盧冰霞，段群棚，何 穎，李 斌，梁家幸，蘇乾蓮，周英寧，蔣冬福，盧敬專，趙 武

(廣西獸醫(yī)研究所，廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點實驗室，廣西 南寧 530001)

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豬流行性腹瀉病毒變異毒株、經(jīng)典毒株及弱毒疫苗株多重RT-PCR鑒別檢測方法的建立及應(yīng)用

秦毅斌，盧冰霞，段群棚，何 穎，李 斌，梁家幸，蘇乾蓮，周英寧，蔣冬福，盧敬專，趙 武*

(廣西獸醫(yī)研究所，廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點實驗室，廣西 南寧 530001)

為建立豬流行性腹瀉病毒(PEDV)變異毒株、經(jīng)典毒株及弱毒疫苗株快速鑒別檢測方法，根據(jù)GenBank中公布的PEDV變異毒株、經(jīng)典毒株及弱毒疫苗株的S基因和ORF3基因，設(shè)計合成2對特異性擴(kuò)增引物，用以擴(kuò)增PEDV S基因和ORF3基因，通過目的片段的數(shù)量和片段大小來判斷PEDV的毒株類型；通過對退火溫度等反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了檢測不同PEDV毒株類型的多重RT-PCR鑒別檢測方法。結(jié)果顯示，所建立的多重RT-PCR鑒別檢測方法能特異性區(qū)分PEDV變異毒株、經(jīng)典毒株和弱毒疫苗株；PEDV變異毒株擴(kuò)增出2條目的條帶，分別為234 bp的ORF3基因片段和826 bp的S基因片段；PEDV經(jīng)典毒株擴(kuò)增出1條目的條帶，片段大小為234 bp的ORF3基因片段；而弱毒疫苗株擴(kuò)增出1條目的條帶，片段大小為185 bp的ORF3基因片段；與豬傳染性胃腸炎病毒、A群豬輪狀病毒、豬嵴病毒、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒、豬偽狂犬病毒、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬乙型腦炎病毒、豬細(xì)環(huán)病毒及豬細(xì)小病毒均無交叉反應(yīng)；敏感性試驗顯示，該方法能檢測到的最低核酸濃度為2.3×10-4ng/μl；且該方法具有良好的重復(fù)性。利用該方法對采集自廣西部分地區(qū)的91份臨床腹瀉樣品進(jìn)行檢測，樣品中PEDV陽性樣品有64份，其中變異毒株占89.06 %(57/64)，經(jīng)典毒株占4.69 %(3/64)，弱毒疫苗株占6.25 %(4/64)。結(jié)果表明，該多重RT-PCR鑒別檢測方法特異性強、靈敏度高、操作簡單，為豬流行性腹瀉的流行病學(xué)及病原的鑒別診斷研究提供了可供借鑒的技術(shù)手段。

豬流行性腹瀉病毒；變異毒株；經(jīng)典毒株；弱毒疫苗株；RT-PCR；鑒別診斷

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的豬的一種高度接觸性腸道傳染病，該病的主要特征是急性水樣腹瀉、嘔吐和脫水死亡；各種年齡階段的豬只均易感，對1～2周齡哺乳仔豬危害最為嚴(yán)重，病死率可高達(dá)90 %～100 %，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的危害和經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。20世紀(jì)70年代，英國和比利時各自報道了該病的發(fā)生[3-4]，隨后該病在世界上多個主要養(yǎng)豬國家相繼暴發(fā)和流行[5]，近年來亞洲一些國家如泰國、韓國、越南和中國多次報道了PED[6-8]。

PEDV是套式病毒目(Nidovirales)冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒亞科(Coronavirinae)甲型冠狀病毒屬(Alphacoronavirus)的成員，為有囊膜的單股正鏈RNA病毒。PEDV基因組全長約28 Kb，包括5’端非編碼區(qū)、3’端非編碼區(qū)以及至少7個開放閱讀框(ORF1a, ORF1b, ORF2～6)，分別編碼主要結(jié)構(gòu)蛋白：纖突蛋白(S)、膜蛋白(M)、核衣殼蛋白(N)、小包膜蛋白(E)和非結(jié)構(gòu)蛋白(復(fù)制酶1a、1b、ORF3蛋白)[9]。S蛋白為Ⅰ型跨膜蛋白，位于病毒粒子的表面，它在誘導(dǎo)感染宿主中和抗體的產(chǎn)生、與特異性受體的結(jié)合及細(xì)胞膜融合方面發(fā)揮著十分重要的作用[10-11]。此外，冠狀病毒S基因的變異可以引起病毒組織嗜性的改變和病毒毒力的變化[12-13]。ORF3基因是PEDV的一個附屬基因，編碼一種離子通道蛋白，可調(diào)節(jié)病毒產(chǎn)量，可能與病毒的毒力相關(guān)[14]。PEDV弱毒疫苗株的ORF3基因在245～294 bp存在49或51個核苷酸的缺失，是弱毒株重要的分子標(biāo)記[15]。

2010年底開始，PED在我國大范圍暴發(fā)流行，臨床上主要表現(xiàn)為高發(fā)病率和高死亡率的哺乳仔豬腹瀉(病死率達(dá)80 %～100 %)，造成了大量的哺乳仔豬死亡。當(dāng)前，我國流行PEDV毒株主要存在2種類型，即PEDV經(jīng)典毒株和PEDV變異毒株，并且以變異毒株為優(yōu)勢流行毒株[16-17]。PEDV基因組中變異最大的區(qū)域位于S基因，且大多數(shù)的變異都聚集在S基因的N端。與早期流行的經(jīng)典毒株(PEDV CV777)相比，PEDV變異毒株的S基因在N端存在15個堿基的插入和6個堿基的缺失，從而導(dǎo)致流行毒株S蛋白的抗原位點、糖基化位點和跨膜螺旋均有明顯變化[18]。此外，研究顯示在采集的臨床樣品中還存在與弱毒疫苗株高度同源的毒株[16]。

當(dāng)前我國廣泛流行的PEDV有變異毒株為優(yōu)勢毒株、經(jīng)典毒株并存的特點，再加上弱毒株的廣泛使用，使得臨床上的PEDV毒株錯綜復(fù)雜。常規(guī)檢測方法如病毒分離、免疫組化、免疫熒光試驗及常規(guī)RT-PCR等并不能區(qū)分PEDV毒株類型；基因測序是鑒定毒株類型的有效方式，但該方法操作復(fù)雜、消耗時間長、費用成本高。我國目前尚無鑒別診斷豬流行性腹瀉病毒變異株、經(jīng)典毒株和弱毒疫苗株的多重RT-PCR方法。因此，有必要建立一種快速簡便有效的豬流行性腹瀉病毒變異株、經(jīng)典毒株和弱毒疫苗株的多重RT-PCR鑒別檢測方法。

基于以上的研究和當(dāng)前的需求，本研究根據(jù)PEDV弱毒疫苗株ORF3基因缺失49個核苷酸以及變異毒株S基因連續(xù)的核苷酸插入的特征，設(shè)計并合成了2 對檢測豬流行性腹瀉病毒的引物，采用多重RT-PCR方法擴(kuò)增ORF3基因和S基因片段，通過擴(kuò)增片段的數(shù)量和分子量大小，判斷是PEDV變異毒株、經(jīng)典毒株還是弱毒疫苗株，從而特異、敏感、快速簡便、低成本、有效地鑒別診斷豬流行性腹瀉病毒的毒株類型。

1 材料與方法

1.1 毒株

豬流行性腹瀉病毒弱毒疫苗株(PEDV attenuated strain CV777)、豬流行性腹瀉病毒經(jīng)典毒株(PEDV classical strain)、豬流行性腹瀉病毒變異毒株(PEDV variant strain)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、A群豬輪狀病毒(PRoVA)、豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、偽狂犬病病毒(PRV)、豬嵴病毒(PKV)、豬乙型腦炎病毒(JEV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)、豬細(xì)環(huán)病毒(TTV)均由本實驗室保存提供。

1.2 臨床樣品

腹瀉糞便及拉稀仔豬腸道樣品采自廣西壯族自治區(qū)南寧、柳州、桂林、貴港、玉林、崇左等地養(yǎng)豬場發(fā)生腹瀉的仔豬。

1.3 主要試劑

病毒基因組DNA/RNA快速抽提試劑盒為Axygen生物科技有限公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT reagent Kit)均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品；DL 500 DNA Marker、2×TaqPCR Master Mix購自北京天根生化科技有限公司。

1.4 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank上登錄的豬流行性腹瀉病毒弱毒疫苗株CV777、經(jīng)典毒株及近些年的變異毒株的ORF3基因、S基因序列，利用Meg Align(DNA Star)和Primer Premier 7.0 軟件在ORF3基因缺失片段的兩端及S基因變異性最大的區(qū)域設(shè)計兩對特異性引物，分別命名為ORF3-F、ORF3-R和S-P1、S-P2，引物序列詳見表1。引物ORF3-F、ORF3-R擴(kuò)增PEDV的ORF3基因片段，變異毒株和經(jīng)典毒株預(yù)期目的片段大小為234 bp，弱毒疫苗株預(yù)期目的片段大小為185 bp；引物S-P1、S-P2僅能擴(kuò)增變異毒株，產(chǎn)生預(yù)期目的片段大小為826 bp。上述引物由大連寶生物工程有限公司合成。

表1 用于擴(kuò)增ORF3基因和S基因片段的引物序列

1.5 糞便樣品的處理及病毒RNA的提取

將采集的糞便樣品、腸道內(nèi)容物用PBS(0.01 mol/L，pH 7.2)制成10 %的懸液，渦旋震蕩后，4 ℃條件下10 000 r/min離心10 min后收集上清，進(jìn)行RNA抽提或于-20 ℃儲存?zhèn)溆?。按照AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit使用說明書對PEDV變異毒株、經(jīng)典毒株、弱毒疫苗株細(xì)胞毒病毒液及糞便樣品、腸道內(nèi)容物上清進(jìn)行RNA提取，所提取RNA直接進(jìn)行RT-PCR或置于-20 ℃保存。

1.6 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)

反轉(zhuǎn)錄合成cDNA：按照RT(反轉(zhuǎn)錄)試劑盒說明，采用20 μl體系：RNA 模板14 μl，5×PrimeScript TM緩沖液4 μl，RT Enzyme Mix 1.0 μl，反轉(zhuǎn)錄引物Oligo18T 1.0 μl，按以下程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：37 ℃ 20 min，85 ℃ 30 s，12 ℃保存。PCR反應(yīng)體系25 μl，滅菌水7.5 μl，2×TaqPCR Master Mix 12.5 μl，引物ORF3-F、ORF3-R和S-P1、S-P2各0.5 μl，模板3.0 μl。按照下列條件進(jìn)行擴(kuò)增：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性40 s，52 ℃復(fù)性40 s，72 ℃延伸50 s，40個循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，并觀察結(jié)果。

1.7 特異性試驗

分別取豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)、豬嵴病毒(PKV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、A群豬輪狀病毒(PRoVA)、豬瘟病毒(CSFV)、豬乙型腦炎病毒(JEV)的RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以及豬細(xì)小病毒(PPV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)、豬細(xì)環(huán)病毒(TTV)的DNA為模板，用所建立的方法進(jìn)行擴(kuò)增，以驗證該方法的特異性。

1.8 敏感性試驗

分別提取PEDV變異毒株、經(jīng)典毒株、弱毒疫苗株細(xì)胞毒病毒液的RNA，用紫外分析儀測定其濃度并將不同毒株的RNA調(diào)整為相同濃度，然后用RNA-Free Water連續(xù)10倍倍比稀釋成9個稀釋度，取各個稀釋度作為模板按上述體系及最適反應(yīng)條件進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，以確定該方法的敏感性。

1.9 重復(fù)性及穩(wěn)定性試驗

用所建立的多重RT-PCR鑒別檢測方法分別對PEDV變異毒株、經(jīng)典毒株和弱毒疫苗株混合物，以及單純的變異毒株、經(jīng)典毒株和弱毒疫苗株，PEDV陽性病料和陰性病料的各5份重復(fù)檢測3次，以驗證本方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.10 臨床樣品的檢測

利用本研究建立的多重RT-PCR鑒別檢測方法對來自廣西南寧、柳州、桂林、貴港、玉林、崇左等地養(yǎng)豬場發(fā)生腹瀉的仔豬糞便樣品(91份)進(jìn)行PEDV檢測，統(tǒng)計當(dāng)前腹瀉病例中PEDV變異毒株、經(jīng)典毒株、弱毒疫苗株所占比例。

M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：PEDV變異毒株、經(jīng)典毒株、弱毒疫苗株混合物；2：PEDV變異毒株；3：PEDV經(jīng)典毒株；4：PEDV弱毒疫苗株；5：陰性對照M：DL500 DNA Marker; 1：PEDV mixture of variant, classical and attenuated strains; 2：PEDV variant strain; 3：PEDV classical strain; 4：PEDV attenuated strain CV777; 5：Negative control圖1 目的基因的RT-PCR擴(kuò)增Fig.1 RT-PCR amplification of target gene

2 結(jié)果與分析

2.1 多重RT-PCR 結(jié)果

所建立的多重RT-PCR方法擴(kuò)增PEDV變異毒株、經(jīng)典毒株和弱毒疫苗株混合物獲得3條目的片段，分別為826、234和185 bp；擴(kuò)增PEDV變異毒株獲得2條目的片段，分別為片段826和234 bp；擴(kuò)增PEDV經(jīng)典毒株獲得1條目的片段，為234 bp；擴(kuò)增PEDV弱毒疫苗株獲得1條目的片段，為185 bp；均與預(yù)期的目的條帶數(shù)量和片段大小相符，電泳結(jié)果詳見圖1。

2.2 多重RT-PCR 最佳退火溫度

為獲得該反應(yīng)最佳擴(kuò)增效果，對多重PCR擴(kuò)增的條件進(jìn)行了摸索和調(diào)整。梯度性地改變多重PCR反應(yīng)的退火溫度，以確定最佳的退火溫度。結(jié)果顯示，退火溫度在49.0-52.5 ℃均可以擴(kuò)增出預(yù)期的目的片段(圖2)，且以50.4 ℃為最佳。最終確定多重PCR的最佳擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性，3 min；94 ℃變性40 s，50.4 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，40個循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min。

M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：49.0 ℃；2：49.6 ℃；3：50.4 ℃；4：51.6 ℃；5：52.5 ℃；6：53.4 ℃；7：54.3 ℃；8：陰性對照M：DL500 DNA Marker；1：49.0 ℃；2：49.6 ℃；3：50.4 ℃；4：51.6 ℃；5：52.5 ℃；6：53.4 ℃；7：54.3 ℃；8：Negative control圖2 多重RT-PCR的不同退火溫度Fig.2 Multi-PCR at different annealing temperature

M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：2.3 ng/μl；2：2.3×10-1 ng/μl；3：2.3×10-2 ng/μl；4：2.3×10-3 ng/μl；5：2.3×10-4 ng/μl；6：2.3×10-5 ng/μl；7：2.3×10-6 ng/μl；8：2.3×10-7 ng/μl；9：2.3×10-8 ng/μl；10：H2OM：DL500 DNA Marker; 1：2.3 ng/μl; 2：2.3×10-1 ng/μl; 3：2.3×10-2 ng/μl; 4：2.3×10-3 ng/μl; 5：2.3×10-4 ng/μl; 6：2.3×10-5 ng/μl; 7：2.3×10-6 ng/μl; 8：2.3×10-7 ng/μl; 9：2.3×10-8 ng/μl; 10：H2O圖3 多重RT-PCR的敏感性試驗Fig.3 The sensitivity test of multi-RT-PCR

2.3 敏感性試驗

3種不同毒株的PEDV病毒液的RNA提取物，經(jīng)濃度測定后調(diào)整為相同的濃度，再將相同的濃度3種RNA等量混合，每種毒株RNA的濃度均為2.3 ng/μl，然后取RNA-Free Water 10倍倍比稀釋物為模板，用所建立多重RT-PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，并以ddH2O作陰性對照。結(jié)果表明，該方法可以同時檢測出最低濃度為2.3×10-4ng/μl的3種毒株的豬流行性腹瀉病毒的RNA(圖3)。

2.4 特異性試驗

試驗結(jié)果(圖4)顯示，本研究建立的RT-PCR方法能特異地檢測出PEDV變異毒株、經(jīng)典毒株、弱毒疫苗株混合物及單純的豬流行性腹瀉病毒變異毒株、經(jīng)典毒株、弱毒疫苗株，而對豬傳染性胃腸炎病毒、A群豬輪狀病毒、豬嵴病毒、豬偽狂犬病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒、豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬乙型腦炎病毒、豬細(xì)環(huán)病毒的檢測結(jié)果均無條帶，表明所建立的方法具有較好的特異性。

2.5 重復(fù)性試驗

用本研究建立的多重RT-PCR鑒別檢測方法對PEDV豬流行性腹瀉病毒變異毒株、經(jīng)典毒株和弱毒疫苗株混合物，以及單純的變異毒株、經(jīng)典毒株和弱毒疫苗株，PEDV陽性病料和陰性病料各5份重復(fù)檢測3次，結(jié)果所有樣品3次檢測結(jié)果均一致，表明該方法穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好。

M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：PEDV變異毒株、經(jīng)典毒株、弱毒疫苗株混合物；2：PEDV變異毒株；3：PEDV經(jīng)典毒株；4：PEDV弱毒疫苗株；5：豬傳染性胃腸炎病毒；6：A群豬輪狀病毒；7：豬嵴病毒；8：豬偽狂犬病毒；9：豬瘟病毒；10：豬細(xì)小病毒；11：豬繁殖與呼吸綜合癥病毒；12：豬圓環(huán)病毒2型；13：豬乙型腦炎病毒；14：豬細(xì)環(huán)病毒；15：陰性對照M：DL500 DNA Marker; 1：PEDV mixture of variant, classical and attenuated strains; 2：PEDV variant strain; 3：PEDV classical strain; 4：PEDV attenuated strain CV777; 5：TGEV; 6：PRoVA; 7：PKV; 8：PRV; 9：CSFV; 10：PPV; 11：PRRSV; 12：PCV-2; 13：JEV; 14：TTV; 15：Negative control圖4 多重RT-PCR的特異性試驗Fig.4 The specificity test of multi-RT-PCR for PEDV

M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～14：臨床樣品 ;15：陽性對照(PEDV變異毒株)；16：陰性對照M：DL500 DNA Marker; 1-14：Clinical samples; 15：Positive control(PEDV variant strain); 16：Negative control圖5 臨床樣品檢測Fig.5 The test of RT-PCR for PEDV clinical samples

2.6 臨床樣品的檢測

對采集的91份糞便樣品，用本研究建立的鑒別診斷RT-PCR方法進(jìn)行PEDV檢測(圖5)。結(jié)果顯示，其中57份樣品為PEDV變異毒株陽性，有3份樣品為PEDV經(jīng)典毒株陽性，此外有4份樣品為PEDV弱毒疫苗株陽性；PEDV陽性樣品共64份。PEDV變異毒株占總PEDV毒株的89.06 %(57/64)，經(jīng)典毒株占總PEDV毒株的4.69 %(3/64)，弱毒疫苗株占總PEDV毒株的6.25 %(4/64)，變異毒株是當(dāng)前豬流行性腹瀉的優(yōu)勢毒株。

3 討 論

早在1973年我國就出現(xiàn)了PEDV的病例，隨后研制了油佐劑滅活疫苗并在全國范圍的養(yǎng)豬場中應(yīng)用，在預(yù)防和控制PED中起到了積極的作用。2010年以前，我國豬群PEDV感染率相對較低，僅是散在發(fā)生。2010年底以來，PED在我國主要養(yǎng)豬地區(qū)持續(xù)暴發(fā)。當(dāng)前，我國流行的PEDV主要有經(jīng)典毒株和變異毒株兩種類型，且以變異毒株為優(yōu)勢流行毒株，致病力較經(jīng)典毒株更強[16-17,19]?；赟基因的遺傳進(jìn)化分析顯示，經(jīng)典毒株與我國早期的毒株親緣關(guān)系密切；變異毒株與2009年前后韓國流行毒株的分子特征較為接近，據(jù)此推測我國PEDV變異毒株可能來源于韓國[16]。2013年5月以來美國豬群暴發(fā)PED疫情，豬群中也存在兩種毒株類型，高毒力(highly virulent)PEDV毒株和致病力較低的PEDV變異(variant)毒株，并以高毒力毒株為優(yōu)勢毒株[20-21]。美國流行的高毒力PEDV毒株與中國PEDV流行的變異毒株(AH2012株)有密切的親緣關(guān)系，它們很可能源自中國[22]。美國流行的PEDV變異毒株與該國最先出現(xiàn)的高毒力PEDV毒株相比，在S基因的N端有核苷酸插入和缺失且致病力較低，所以稱為S基因插入缺失(S INDEL)毒株或者變異毒株[20]；其S基因的分子特征與我國流行的經(jīng)典毒株(CH/HBQX/10)相近，遺傳關(guān)系較為接近[23]。PEDV通過何種途徑從亞洲大陸傳播到北美大陸仍然是個謎。最近的研究發(fā)現(xiàn)，實驗豬只在急性感染PEDV后欄舍內(nèi)空氣顆粒物中可以檢測到較高濃度的PEDV RNA，這提示了PEDV可以通過氣溶膠傳播[24]。

PED對亞洲國家的養(yǎng)豬業(yè)造成了一定的危害，韓國、日本及中國均培育開發(fā)了弱毒疫苗用于PED的防控。弱毒疫苗的廣泛使用，可能引起PEDV疫苗毒在免疫豬場的循環(huán)存在。Li等人研究顯示在我國發(fā)生PED的部分豬場PEDV毒株的S基因與DR13弱毒疫苗株高度同源[16]。Chen等人針對我國福建地區(qū)PEDV的分子流行病學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)P55株與弱毒疫苗株在ORF3基因有一致的長片段核苷酸缺失，與弱毒疫苗株的親緣關(guān)系最為接近[25]。這些與弱毒疫苗株高度親近的類弱毒株，究竟是殘留的弱毒疫苗毒還是重組演化的病毒需要全基因序列的測定及動物致病性試驗來進(jìn)行證實。

PEDV ORF3基因缺失49個核苷酸的是弱毒疫苗株區(qū)分于野毒株的重要分子標(biāo)記，根據(jù)這一特征可以用RT-PCR方法對PEDV弱毒疫苗株和野毒株進(jìn)行鑒別診斷[26]。S基因N端15個核苷酸的插入和6個核苷酸的缺失是區(qū)分PEDV變異毒株與經(jīng)典毒株的主要分子特征，秦毅斌等基于S基因的差異建立了檢測PEDV變異毒株與經(jīng)典毒株的RT-PCR鑒別檢測方法[27]。本研究在此前的基礎(chǔ)上，建立了可以檢測并鑒別3種PEDV毒株類型的多重RT-PCR方法，在一個反應(yīng)管中同時擴(kuò)增ORF3基因和S基因片段，通過電泳條帶的數(shù)量和片段大小，即可判斷所檢測到的PEDV是變異毒株、經(jīng)典毒株還是弱毒疫苗株。該方法有良好的特異性，可以擴(kuò)增出PEDV不同毒株或者混合物的預(yù)期片段；而對本試驗中其他的幾種病毒無交叉反應(yīng)。此外，該試驗有高度的敏感性，可以檢測到低至2.3×10-4ng/μl的PEDV RNA。

利用所建立的PEDV鑒別診斷RT-PCR方法對臨床腹瀉糞便樣品檢測結(jié)果顯示，變異毒株占總PEDV毒株的89.06 %，是當(dāng)前豬流行性腹瀉的優(yōu)勢毒株。這一結(jié)果和國內(nèi)外其他研究團(tuán)隊所獲得的數(shù)據(jù)是相似的。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)Zhao等人根據(jù)S基因的差異建立了區(qū)別PEDV變異毒株和經(jīng)典毒株的多重TaqMan實時熒光定量RT-PCR檢測方法，并對42份腹瀉仔豬的腸道內(nèi)容物進(jìn)行檢測，從其中的36份樣品當(dāng)中檢測到PEDV變異毒株，另外有3份樣品PEDV經(jīng)典毒株為陽性[19]。美國俄亥俄州農(nóng)業(yè)部門動物疫病診斷實驗室Wang等人也建立了針對美國PEDV高毒力毒株和變異毒株的二重實時熒光定量RT-PCR方法，對295份基于M基因的實時熒光RT-PCR檢測為陽性的樣品進(jìn)行了進(jìn)一步的鑒別診斷，其中250份為PEDV高毒力毒株，45份為變異毒株，并且對檢測為變異毒株的樣品還通過S基因N端約1100 bp的序列測定再一次的認(rèn)證[21]。本試驗在4份臨床樣本中檢測到ORF3基因存在缺失的PEDV弱毒株，這些樣本來自有豬流行性腹瀉弱毒疫苗免疫史的2個豬場；使用疫苗前腹瀉發(fā)病率在80 %以上，免疫之后哺乳仔豬腹瀉發(fā)病率約為40 %，死亡率有所降低。使用PEDV弱毒疫苗后可能造成疫苗毒的殘留或引起疫苗毒株與野毒株的重組，從而加劇病毒變異，應(yīng)該引起關(guān)注。

綜上所述，本研究建立了一種可以檢測和區(qū)分PEDV變異毒株、經(jīng)典毒株和弱毒疫苗株的多重RT-PCR方法，為PEDV的流行病學(xué)及鑒別診斷研究提供了一種特異的、敏感的、快速高效的檢測手段。

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(責(zé)任編輯 溫國泉)

Development and Application of Multiplex RT-PCR Method for Differentiation of Variant, Classical and Attenuated Vaccine Strains of Porcine Epidemic Diarrhea Viruses

QIN Yi-bin, LU Bing-xia, DUAN Qun-peng, HE Ying, LI Bin, LIANG Jia-xing, SU Qian-lian,ZHOU Ying-ning, JIANG Dong-fu, LU Jing-zhuan, ZHAO Wu*

(Guangxi Veterinary Research Institute, Guangxi Key Laboratory of Animal Vaccines and New Technology, Guangxi Nanning 530001, China)

In order to establish a rapid multiplex RT-PCR assay for detection and differentiation of variant, classical and attenuated vaccine strains of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV). Two pairs of specific primers were designed based on S gene sequences and ORF3 gene sequences of variant, classical and attenuated vaccine strains PEDV published in GenBank, to amplify the partial S gene fragment and ORF3 gene fragment of different PEDV strains, the type of PEDV strain could be differentiated according to the number of the fragment and the size of the fragment. Results showed that the multiplex RT-PCR could detect and differentiate variant, classical and attenuated vaccine strains PEDV. Variant PEDV strain generated two fragments, they were 826 bp of the S gene and 234 bp of the ORF3 gene, respectively. Classical PEDV strain only amplified 234 bp of the ORF3 gene, while attenuated vaccine strain produced 185 bp of the ORF3 gene. The multiplex RT-PCR did not cross-react with TGEV, PRoVA, PKV, PRRSV, PRV, CSFV, PCV-2, JEV, TTV and PPV used in the study. Testing of the sensitivity of RT-PCR indicated as low as 2.3×10-4ng/μl nuclear acids could be detected accurately and rapidly. Ninety-one stool specimens collected from different farms in Guangxi Province were detected by the established multiplex RT-PCR, 64 samples were positive for PEDV, of which 89.06 %(57/64) was variant PEDV strains, 4.69 %(3/64) was classical PEDV strain and 6.25 %(4/64) was attenuated vaccine PEDV strain. Therefore the multiplex RT-PCR could be used as an effective tool for differentiating diagnosis of PEDV in epidemiological investigations.

PEDV; Variant strain; Classical strain; Attenuated vaccine strain; RT-PCR; Differential diagnosis

1001-4829(2016)11-2746-06

10.16213/j.cnki.scjas.2016.11.043

2016-06-23

廣西水產(chǎn)畜牧科技推廣應(yīng)用項目(桂漁牧科201633 044，201633041，201633034)；南寧市西鄉(xiāng)塘區(qū)科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目(2014304)

秦毅斌(1983-)，男，廣西臨桂人，碩士，助理研究員，主要從事動物傳染病病原與分子生物學(xué)研究，E-mail：qinyibin5188@163.com,*為通訊作者，E-mail：zhaowu168866@163.com。

S858.28

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