芥菜型油菜多室基因Bjmc2的精細定位

王 剛 張向向 徐 平 呂澤文 文 靜 易 斌 馬朝芝涂金星 傅廷棟 沈金雄

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點實驗室 / 國家油菜工程技術(shù)研究中心, 湖北武漢430070

芥菜型油菜多室基因Bjmc2的精細定位

王 剛 張向向 徐 平 呂澤文 文 靜 易 斌 馬朝芝涂金星 傅廷棟 沈金雄*

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點實驗室 / 國家油菜工程技術(shù)研究中心, 湖北武漢430070

芥菜型多室油菜的產(chǎn)量比普通兩室油菜更高, 定位乃至克隆多室基因可為油菜遺傳改良及解釋多室角果形成機制創(chuàng)造條件。本研究通過驗證JD11-2家系衍生群體僅在BjMc2位點上存在差異, 可用于BjMc2的定位。采用AFLP結(jié)合BSA法分析BC5和BC6群體, 篩選到1個與BjMc2連鎖的AFLP標(biāo)記并轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記SC1?；谠揂FLP標(biāo)記序列信息, 利用白菜同源序列設(shè)計SSR引物和SCAR引物, 獲得11對SSR標(biāo)記和1對SCAR標(biāo)記。通過在芥菜型油菜BAC文庫中的挑選, 獲得2個覆蓋目標(biāo)區(qū)域的單克隆, 由此開發(fā)1個SSR標(biāo)記。將獲得的SCAR和SSR標(biāo)記掃描BC7群體, 構(gòu)建了兩室性狀基因BjMc2的遺傳連鎖圖, 兩側(cè)最近標(biāo)記ZX17和BACsr96與目標(biāo)基因之間的遺傳距離分別為0.048 cM和0.340 cM, 并定位到白菜A7 Scaffold 000019的946～1014 kb之間, 約68 kb物理距離。

芥菜型油菜; 多室角果; BjMc2; 分子標(biāo)記

油菜是重要的油料作物, 高產(chǎn)是油菜遺傳育種的首要目標(biāo)。油菜單株產(chǎn)量構(gòu)成因素主要包括全株角果數(shù)、每角粒數(shù)和千粒重。宋稀等[1]和 Zhu等[2]認(rèn)為今后一段時間增加每角粒數(shù)是油菜改良重點之一。普通油菜角果由兩心皮發(fā)育成兩室, 中間為假隔膜, 每角粒數(shù)一般 15～20粒, 極少數(shù)品種超過 30粒。而多室油菜角果由 3個以上心皮發(fā)育而成, 中間至少存在 2個假隔膜將果室分隔為三室、四室或五室, 每角粒數(shù)多在30粒左右, 最多可達40余粒[3-6]。顯然, 多室材料的顯著特征是角果粒數(shù)多于兩室材料。Katiyar等[3]、趙洪朝等[4]和呂澤文等[7]研究表明,盡管多室油菜的千粒重和單株有效角果數(shù)均低于普通兩室油菜, 但因多室油菜每角粒數(shù)更多, 結(jié)果多室材料的單株或小區(qū)產(chǎn)量均顯著高于兩室材料(一般高10%～40%, 最高達70%)。因此, 研究和利用多室性狀對提高油菜產(chǎn)量具有重要意義。

定位甚至克隆多室基因是研究和利用多室性狀的重要基礎(chǔ)。分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛用于油菜重要農(nóng)藝性狀相關(guān)基因的圖譜定位與克隆。由于油菜屬于異源四倍體作物, 基因組比較復(fù)雜, 開發(fā)連鎖標(biāo)記較困難, 目前油菜中僅有少數(shù)幾個多室基因被定位甚至克隆。Paritosh等[8]以白菜型多室材料黃籽沙遜Tetra及其與Chiifu雜交后代衍生的RIL群體為材料,利用 RNA-seq開發(fā)了大量 SNP標(biāo)記, 將多室基因tet-o定位到A04染色體, 兩側(cè)最近的SNP標(biāo)記分別為0.1 cM和0.3 cM。Fan等[9]證實位于A04染色體上的BrCLV3是控制白菜型油菜黃籽沙遜ml4突變體多室表型的關(guān)鍵基因, 由于BrCLV3的第3個外顯子區(qū)單堿基突變, 致使CLV-WUS負調(diào)控途徑異常,最終導(dǎo)致多室角果的形成。Xiao等[10]認(rèn)為芥菜型油菜duoshi的多室性狀遺傳受兩對獨立遺傳的隱性核基因控制, 并將多室基因Bjln1定位到A7染色體的208 kb區(qū)段內(nèi)。呂澤文[11]研究認(rèn)為芥菜型油菜J163-4多室性狀受2對隱形核基因(Bjmc1和Bjmc2)控制, 無細胞質(zhì)效應(yīng), 且開發(fā)了與 Bjmc1基因連鎖的SSR、SCAR標(biāo)記, 分別距目標(biāo)基因11.5 cM和14.9 cM。Xu等[12]在呂澤文研究基礎(chǔ)上擴大群體將Bjmc1定位在A7的一個區(qū)段內(nèi), 其兩側(cè)最近的標(biāo)記距離分別為 1.1 cM 和 1.6 cM, 而對于多室基因Bjmc2還未開發(fā)連鎖標(biāo)記。近幾年, 多種蕓薹屬作物的全基因組測序相繼完成, 并建有相應(yīng)數(shù)據(jù)庫, 為開發(fā)與Bjmc2連鎖的分子標(biāo)記提供了捷徑。

本研究通過構(gòu)建 BjMc2位點回交群體, 擬利用AFLP標(biāo)記技術(shù)及BSA法、蕓薹屬數(shù)據(jù)庫, 結(jié)合田間表型數(shù)據(jù)計算標(biāo)記遺傳距離, 旨在構(gòu)建 BjMc2位點的遺傳連鎖圖; 從而為 Bjmc2的克隆和分子標(biāo)記輔助選育多室品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

親本材料是芥菜型油菜兩室材料J248-2和多室材料 J163-4, 均由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜研究室雜優(yōu)組提供, 均經(jīng)多代連續(xù)自交, 遺傳穩(wěn)定。Bjmc2位點的定位群體的構(gòu)建方法如圖1, 由J248-2與J163-4雜交得 F1, F1與 J163-4回交兩代, 選擇 BC2世代中JD11-2家系(其兩室單株與多室單株比例為 1∶1),其后選擇兩室單株與多室單株進行多代兄妹交保存該家系。

圖1 芥菜型油菜多室位點Bjmc2群體的構(gòu)建Fig. 1 Construction of populations with polycyetic trait gene Bjmc2 in Brassica juncea

1.2 BjMc1和BjMc2等位性分析

種植由JD11-2家系兩室單株與多室單株多代兄妹交繁衍的 BC5(JH)世代, 然后用與 BjMc1連鎖的分子標(biāo)記(SR02, 340 bp[12])驗證該群體, 并且選擇兩室單株套袋自交, 另外還與構(gòu)建的 BjMc1位點回交分離群體中兩室單株雜交。在其后代家系中, 選兩室單株自交且同時與多室單株兄妹交。角果表型分離的均用χ2測驗, 以檢驗其分離比適合性。

1.3 基因組DNA提取和基因Bulk池構(gòu)建(BSA)

在芥菜型油菜苗期選取新鮮嫩葉, 采用 CTAB小樣法提取基因組DNA[13]。用分光光度計測定DNA溶液濃度, 用超純水將濃度稀釋到50 ng μL-1。根據(jù)BSA法, 將BC5(JH)世代等量的18株兩室單株和18株多室單株的DNA溶液分別混成3個兩室Bulk池和3個多室Bulk池(6株為一池)用于AFLP和SSR標(biāo)記的篩選[14]。

1.4 AFLP標(biāo)記的篩選

采用 Negi等[15]方法并略有改動篩選 AFLP標(biāo)記。采用EcoR I/Mse I、Pst I/Mse I兩種組合, 充分酶切后, 加入接頭和連接緩沖液, 4℃過夜, 將連接產(chǎn)物稀釋 10倍后作為預(yù)擴模板, 采用 EA/MC、EA/MG、EC/MA、EC/MG、P0/MC和P0/MG組合預(yù)擴, 將預(yù)擴產(chǎn)物稀釋20倍作為選擇性擴增模板。用選擴引物擴增后的樣品100℃水浴變性后采用6%聚丙烯酰氨凝膠電泳分離檢測。

1.5 差異片段的克隆測序及SCAR標(biāo)記的轉(zhuǎn)化

參考Yi等[16]方法將篩選的AFLP標(biāo)記差異片段挖膠回收并測序, 用 Lasergene軟件將序列去載體,和對應(yīng)選擴引物比對得到差異片段序列, 利用Primer5軟件設(shè)計引物, 檢測兩室基因池和多室基因池是否存在差異。

1.6 SSR標(biāo)記的開發(fā)與篩選

將差異 AFLP標(biāo)記序列在 Brassica Database (BRAD)數(shù)據(jù)庫中進行 Blast比對分析, 根據(jù)序列信息篩選白菜 scaffolds, 并由此利用 http：//wsmartins. net/websat/網(wǎng)站設(shè)計 SSR引物, 用兩室和多室基因池進行篩選, 參照呂澤文[11]碩士論文的PCR反應(yīng)體系和參數(shù)。

1.7 芥菜型油菜BAC文庫篩選以及單克隆測序

用與BjMc2緊密連鎖的標(biāo)記篩選湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)構(gòu)建的芥菜型油菜ZBjH BAC文庫[17]。由上海生工釆用 Sanger方法進行 BAC末端測序, 測序引物為M13R和S1。在Brassica Database (BRAD)數(shù)據(jù)庫中以Blast比對分析獲得的BAC 末端序列。 釆用二代Illumina測序平臺進行 BAC全長測序, 并進行Denovo組裝全長。得到目標(biāo)序列后再利用 http：// wsmartins.net/websat/網(wǎng)站設(shè)計 SSR引物, 用兩室和多室Bulk池進行篩選, 以獲得多態(tài)性標(biāo)記。

1.8 連鎖遺傳圖構(gòu)建

利用BC5(JH)世代301單株、BC6世代252單株和 BC7世代 6207單株檢測所有與 BjMc2連鎖的SCAR、SSR標(biāo)記, 根據(jù)田間角果表型計算連鎖標(biāo)記與目標(biāo)基因的遺傳距離, 用MapDraw軟件作遺傳連鎖圖[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 BjMc1和BjMc2等位性

由表1和表2可見, BC5(JH)世代群體中兩室單株自交, 第 1代兩室和多室單株數(shù)比例接近 3∶1;第 2代中, 兩室自交的后代中兩室和多室單株數(shù)比例為3∶1或全是兩室單株, 未出現(xiàn)兩室和多室單株數(shù)比例為 15∶1; 與多室兄妹交的后代中兩室和多室單株數(shù)比例為 1∶1或全是兩室單株。同樣, BC5(JH)世代中兩室單株與 BjMc1位點的回交分離群體中兩室單株雜交, 第 1代兩室和多室單株數(shù)比例接近 3∶1; 第 2代中, 兩室自交后代中兩室和多室單株數(shù)比例為15∶1或3∶1; 與多室兄妹交后代中兩室和多室單株數(shù)比例為3∶1或1∶1。另外, 如圖2用BjMc1基因連鎖標(biāo)記SR02鑒定BC5(JH)回交群體, 兩室和多室單株未出現(xiàn)差異。以上結(jié)果進一步驗證芥菜型油菜J163-4多室性狀由兩對基因控制,兩室相對多室為顯性; 還證實由JD11-2家系衍生的BC5(JH)回交群體中兩室和多室單株僅在 BjMc2位點上存在差異, 可用于構(gòu)建群體定位BjMc2。

2.2 AFLP標(biāo)記的開發(fā)與SCAR標(biāo)記的轉(zhuǎn)化

通過篩選1536對AFLP引物組合, 獲得1個與BjMc2連鎖的AFLP標(biāo)記(P10MC4)(圖3)。進行差異片段回收測序, 在Brassica Database (BRAD)數(shù)據(jù)庫中Blast比對分析序列, 結(jié)果與白菜A7同源性很高,比對在白菜Scaffold 000019的1435 kb位置上, 根據(jù)序列設(shè)計引物成功轉(zhuǎn)化成SCAR標(biāo)記(SC1) (圖4)。

2.3 SSR標(biāo)記開發(fā)

由AFLP標(biāo)記(P10MC4)的差異片段回收測序所得序列, 根據(jù)比對結(jié)果在Scaffold 000019的1435 kb位置左右每約 100 kb設(shè)計 1對 SSR引物, 且在Brassica Database (BRAD)數(shù)據(jù)庫下載白菜A7同源

區(qū)段的已有SCAR標(biāo)記。用3個兩室Bulk池和3個多室Bulk池去驗證這些引物, 獲得11對SSR標(biāo)記和1對SCAR標(biāo)記(SC8)與BjMc2連鎖(表3)。

表1 BjMc1與BjMc2間的等位性分析(自交或雜交第1代分離表現(xiàn))Table 1 Allelic analysis between BjMc1 gene and BjMc2 gene (segregation in selfing or hybrid first generations)

表2 BjMc1與BjMc2間的等位性分析(自交或雜交第2代分離表現(xiàn))Table 2 Allelic analysis between BjMc1 gene and BjMc2 gene (segregation in selfing or hybrid second generations)

圖2 與BjMc1連鎖標(biāo)記SR02在不同基因型單株中的擴增Fig. 2 Amplification in diverse genotypes using marker SR02 linked to BjMc11～2： BjMc2位點定位群體中兩室單株和多室單株; 3～4： BjMc1位點定位群體中兩室單株和多室單株。1-2： bilocular and polycyetic plants in population with BjMc2; 3-4：bilocular and polycyetic plants in population with BjMc1.

圖3 AFLP引物組合P10MC4在12個兩室單株和12個多室單株中的擴增情況Fig. 3 AFLP primer pair P10MC4 profiles from 12 biloculars and 12 triloculars1～2： 兩室單株和多室單株, *為交換單株。1-2： bilocular and polycyetic plants, * recombinant type.

圖4 標(biāo)記SC1在bulk池和單株的擴增結(jié)果Fig. 4 Amplification results of SC1 on bulk pools and individuals plants1～2： 兩室bulk池和多室bulk池。1-2： bilocular bulk pools and polycyetic bulk pools.

表3 與BjMc2連鎖的SSR標(biāo)記和SCAR標(biāo)記的特征Table 3 Characterization of SSR and SCAR markers linked to BjMc2

2.4 BAC單克隆測序結(jié)果

用 3個 BjMc2兩端較近的連鎖標(biāo)記(ZX4、SSR344和ZX10)在芥菜型油菜ZBjH BAC文庫中,篩選到2個BAC單克隆(002-O-21和009-M-2)能夠覆蓋目標(biāo)基因區(qū)域。BAC末端測序結(jié)果都能比對到Scaffold 000019上, 002-O-21兩端分別比對在832 kb和979 kb; 009-M-2兩端分別比對在1104 kb和941 kb。推測002-O-21 BAC單克隆約150 kb, 009-M-2 BAC單克隆約 160 kb, 與該文庫平均長度插入相符。由BAC全長測序結(jié)果開發(fā)更近的SSR標(biāo)記, 成功得到BACsr96標(biāo)記與BjMc2連鎖。

2.5 構(gòu)建BjMc2位點遺傳連鎖圖

用BC5(JH)世代301個單株、BC6世代252個單株和BC7世代6207個單株檢測所有SCAR、SSR標(biāo)記與BjMc2的遺傳距離, 由構(gòu)建的遺傳連鎖圖可知,所有連鎖標(biāo)記覆蓋在BjMc2周圍27.196 cM區(qū)域內(nèi),包括12個SSR標(biāo)記和2個SCAR標(biāo)記。在所有連鎖標(biāo)記中, ZX17和BACsr96與BjMc2遺傳距離最近,分別為0.048 cM和0.340 cM, 其中SSR344與目標(biāo)基因共分離(圖5-A)。

圖5 芥菜型油菜兩室基因BjMc2的遺傳連鎖圖和白菜A7同源Scaffold物理圖譜Fig. 5 Genetic linkage map of bilocular gene BjMc2 in B .junce and physical map of homologous Scaffolds of A7 in B. rapaA是BjMc2的遺傳連鎖圖; B是白菜A7同源Scaffold物理圖譜,黑色代表Scaffold 000101, 灰色代表Scaffold 000019。A is the genetic linkage map of the bilocular gene BjMc2; B is physical map of homologous Scaffolds of A7 in B. rapa, black represent Scaffold 000101, gray represent Scaffold 000019.

3 討論

因多室油菜能提高產(chǎn)量, 故越來越受到研究者關(guān)注[4-10,12,19-20]。目前報道的幾個油菜多室材料, 其表型及穩(wěn)定性都不盡相同。何余堂等[5]發(fā)現(xiàn)白菜型多室油菜有多種表型(三室和四室), 且同一單株有兩室、三室和四室并存現(xiàn)象(嵌合現(xiàn)象), 早期子房由4個心皮組成, 子房橫切面假隔膜呈“+”型, 將子房分隔成大小均勻的 4個腔室, 但在后期發(fā)育過程中假隔膜退化, 有的退化為三室, 橫切面呈“Y”型; 有的直接退化為兩室。Paritosh等[8]、Fan等[9]研究材料同樣存在嵌合現(xiàn)象。朱彥濤等[6,19]發(fā)現(xiàn)甘藍型多室油菜三棱角果橫截面為三角形, 假隔膜呈現(xiàn)“Y”型, 但該材料也存在三棱角果與正常兩室角果同時存在的嵌合現(xiàn)象。趙洪朝等[4,20]、Xiao等[10]報道的芥菜型油菜多室材料duoshi其角果橫切面的假隔膜呈“+”型,且其表型不穩(wěn)定, 存在兩室和多室嵌合現(xiàn)象。而本研究利用的芥菜型油菜多室材料J163-4, 其子房橫切面的假隔膜呈“II”型, 與上述白菜型油菜、芥菜型油菜及甘藍型油菜多室材料的橫切面的假隔膜形態(tài)均不同且表型穩(wěn)定, 未發(fā)現(xiàn)有兩室和多室角果并存的嵌合現(xiàn)象[7,12]。J163-4的表型和穩(wěn)定性不同于其他油菜多室材料可能與其受控基因的不同/或基因結(jié)構(gòu)變異有關(guān)。

本研究開發(fā)的所有標(biāo)記都與白菜 A7同源, 且將J163-4多室性狀基因Bjmc2定位到2個最近連鎖標(biāo)記ZX17和BACsr96之間, 遺傳距離分別為0.048 cM和0.340 cM。這2個標(biāo)記在白菜Scaffold 000019同源位置是946 kb和1014 kb (～68 kb) (圖5-B)。此前Xu等[12]報道BjMc1定位區(qū)段也與A7同源, 但等位性分析和SR02標(biāo)記檢測結(jié)果表明BjMc1和BjMc2是2個獨立分離的位點。2個位點區(qū)域都與A7同源可能是由于A、B和C基因組本身有同源關(guān)系或同一個基因在不同基因組有不同拷貝。Truco等[21]對3個二倍體物種的連鎖圖比較發(fā)現(xiàn), 3個基因組間有著廣泛的相同保守區(qū)域, 但伴隨著大量的序列重排現(xiàn)象, 也廣泛存在A、B、C基因組內(nèi)部的同源保守區(qū)段, 由此推測出 3個基因組的形成可能是由一個基因組較小的祖先物種經(jīng)過多次重復(fù)和重排形成的?，F(xiàn)已完成甘藍型油菜全基因測序[22], 借助與親本種甘藍和白菜基因組的比較, 發(fā)現(xiàn)該基因組進化的突出特點是2個亞基因組(A和C)存在著廣泛的相互基因或DNA序列置換, 這從序列上解釋了甘藍型油菜異源四倍體進化關(guān)系。另外, Xiao等[10]報道的芥菜型油菜duoshi的多室基因Bjln1定位區(qū)段也與白菜A7 Scaffold 000019同源。但是, 由于多室材料J163-4和duoshi的角果表型不同, 且J163-4的多室表型穩(wěn)定, 均為三室, 不存在嵌合現(xiàn)象, 因此 Bjmc2與 Bjln1盡管定位在同一區(qū)段, 可能為同一位點/等位基因, 但其基因結(jié)構(gòu)不同, 基因表達效應(yīng)不同,最終導(dǎo)致表型和穩(wěn)定性明顯差異。再者, 本研究把BjMc2定位在Scaffold 000019的946～1014 kb區(qū)段,該區(qū)段可能含有參與擬南芥頂端分生組織發(fā)育反饋調(diào)控途徑(CLV-WUS)關(guān)鍵基因 CLV1的同源基因Bra015812 [Brassica Database (BRAD)數(shù)據(jù)庫]。關(guān)于clv1, 在擬南芥中已有大量研究和報道, 其突變能夠?qū)е伦臃砍霈F(xiàn)多心皮, 從而出現(xiàn)角果多室性狀[23-24]。在擬南芥中 clv1的 clv1-1[23]、clv1-2至 clv1-3[24]、clv1-4至 clv1-7[23]、clv1-8至 clv1-9[24]和clv1-10至clv1-13[25]的不同突變體的表型均不同, 心皮數(shù)為3～9個。在芥菜型油菜中, CLV1同源拷貝數(shù)及突變類型可能會更多, 故在異源四倍體的芥菜型油菜中,該反饋調(diào)控途徑會更復(fù)雜, 不同的材料可能是不同的拷貝或突變類型。因此, 只有克隆多室基因, 分析基因結(jié)構(gòu)和表達模式才能更好地研究和利用多室性狀。另外, 通過已有優(yōu)良芥菜型油菜或甘藍型油菜品種與J163-4雜交, 再利用本文已開發(fā)與BjMc2緊密連鎖的分子標(biāo)記檢測后代單株, 可以輔助選育含有多室基因的家系, 從而加快選育芥菜型油菜或甘藍型油菜多室品種。

4 結(jié)論

通過JD11-2衍生的回交定位群體, 將BjMc2錨定到遺傳距離分別為0.048 cM和0.340 cM的ZX17和BACsr96標(biāo)記內(nèi), 與白菜Scaffold 000019的同源位置是68 kb物理距離。

致謝: 本研究所用芥菜型油菜BAC文庫得到湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉忠松教授的幫助, 在此謹(jǐn)表謝意。

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Fine Mapping of Polycyetic Gene (Bjmc2) in Brassica juncea L.

WANG Gang, ZHANG Xiang-Xiang, XU Ping, LYU Ze-Wen, WEN Jing, YI Bin, MA Chao-Zhi, TU Jin-Xing, FU Ting-Dong, and SHEN Jin-Xiong*

National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement / National Research Center of Rapeseed Engineering and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China

Multilocular plants have a higher seed yield than bilocular plants in B. juncea, mapping and cloning the multilocular gene(s) might be helpful for rapeseed genetic improvement and explanation of the multilocular trait development mechanism. This study verified backcross populations derived from JD11-2 family different at BjMc2 locus only can be used for BjMc2 mapping. Using AFLP assay and BSA method in BC5and BC6generations, one AFLP marker linked to the target gene was obtained and converted to SCAR marker (SC1). On the basis of homologous sequences of the AFLP maker in B. rapa, 11 SSR markers and one SCAR marker were identified. Through the screening in the ZBjH BAC library of Brassica juncea, two BACs covered the target area were selected and one SSR marker was developed. All the developed SCAR and SSR markers were then used to detect the BC7population, and a linkage map for the bilocular gene BjMc2 was built. ZX17 and BACsr96, the closest flanking markers, were mapped at 0.048 cM and 0.340 cM distant from the BjMc2 gene, respectively. Bjmc2 is positioned of 68 kb between 946 kb and 1014 kb in the Scaffold 000019 physical map of A7 in B. rapa. This result would lay a foundation for cloning polycyetic gene Bjmc2 and selecting polycyetic lines by marker-assisted selection.

Brassica juncea; Polycyetic silique; BjMc2; Molecular marker

本研究由國家自然科學(xué)基金項目(31571698)資助。

This study was supported by the National Science Foundation of China (31571698).

*通訊作者(Corresponding author)： 沈金雄, E-mail： jxshen@mail.hzau.edu.cn,Tel： 13667227126

聯(lián)系方式： E-mail： wanggang2014@webmail.hzau.edu.cn, Tel： 18963949812

稿日期)： 2016-04-01; Accepted(接受日期)： 2016-06-20; Published online(

日期)： 2016-07-04.

URL： http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160704.0826.004.html