云南漢族γ-干擾素受體基因多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的相關(guān)性

楊天睿，撒亞蓮

(云南省第一人民醫(yī)院：1.內(nèi)干科；2.基研室，昆明 650032)

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云南漢族γ-干擾素受體基因多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的相關(guān)性

楊天睿1，撒亞蓮2

(云南省第一人民醫(yī)院：1.內(nèi)干科；2.基研室，昆明 650032)

目的 探討云南漢族γ-干擾素受體(IFNGR)的兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)Val14Met和GIn64Arg多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化(AS)斑塊穩(wěn)定性的相關(guān)性。方法 收集該院2014年3月至2015年3月收治的AS斑塊不穩(wěn)定的患者作為觀察組，而同期入院的AS斑塊穩(wěn)定/無(wú)斑塊的患者為對(duì)照組。采集患者外周靜脈血，提取基因組DNA，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)物直接測(cè)序法檢測(cè)IFNGR1 Vall4Met和IFNGR2 Gln64Arg位點(diǎn)的基因型，采用DNAStar、GeneTool軟件分析測(cè)序結(jié)果，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)患者血漿細(xì)胞因子[γ-干擾素(IFN-γ)]的水平。結(jié)果 204例當(dāng)?shù)貪h族患者列入研究，其中觀察組109例，年齡(76.89±12.08)歲；對(duì)照組95例，年齡(65.99±16.32)歲。IFNGR1 Vall4Met 位點(diǎn)在觀察組和對(duì)照組中均未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性改變。IFNGR2 Gln64Arg在觀察組AA基因型頻率為51.95%(40/77)，AG基因型頻率為53.06%(52/98)，GG基因型頻率為58.62%(17/29)；對(duì)照組AA基因型頻率為48.05%(37/77)，AG基因型頻率為46.94%(46/98)，GG基因型頻率為41.38%(12/29)，卡方檢驗(yàn)P=0.824，IFNGR2基因型AA、AG和GG與AS斑塊穩(wěn)定性沒(méi)有關(guān)系；觀察組IFNGR2 A等位基因頻率為52.38%(132/252)，G等位基因頻率為55.13%(86/156)，對(duì)照組A等位基因頻率為47.62%(120/252)，G等位基因頻率為44.87%(70/156)，卡方檢驗(yàn)校正P=0.661，IFNGR2等位基因A和G與AS斑塊穩(wěn)定性沒(méi)有關(guān)系。經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，該樣本人群該基因頻率符合遺傳平衡法則。觀察組血漿中IFN-γ水平為(4.60±1.91)ng/mL，對(duì)照組為(4.88±2.10)ng/mL，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.318)；血漿IFN-γ水平與AS斑塊穩(wěn)定性無(wú)相關(guān)性(P=0.308)。結(jié)論 IFNGR基因多態(tài)性不能作為AS斑塊穩(wěn)定性的預(yù)警指標(biāo)。

動(dòng)脈粥樣硬化；γ-干擾素受體；基因；多態(tài)性

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是一種常見(jiàn)多發(fā)疾病，其斑塊的不穩(wěn)定導(dǎo)致斑塊破裂、血栓形成及血管阻塞，是急性心、腦血管事件的主要原因，極大的威脅著人民群眾的生命健康，防治AS已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)科學(xué)研究的重大課題。γ-干擾素(IFN-γ)是多功能細(xì)胞因子，是巨噬細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的活化劑，且具有阻止膠原蛋白合成，抗纖維化的作用。某些基因位點(diǎn)上的多態(tài)性會(huì)影響基因的轉(zhuǎn)錄效率和/或表達(dá)產(chǎn)物的功能，不同細(xì)胞因子發(fā)揮生物學(xué)功能均是通過(guò)與細(xì)胞膜表面受體相互作用最終促進(jìn)靶基因的表達(dá)[1]，γ-干擾素表面受體復(fù)合物(IFNGR)基因多態(tài)性是否影響AS的發(fā)生及其斑塊穩(wěn)定性尚不十分清楚，目前已發(fā)現(xiàn)的IFNGR多態(tài)性位點(diǎn)有IFNGR1 Vall4Met、IFNGR2 Gln64Arg，本研究針對(duì)本地區(qū)廣大漢族人群，通過(guò)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)物直接測(cè)序檢測(cè)以上位點(diǎn)基因型，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血漿Th1型、Th2型細(xì)胞因子，探討炎癥介質(zhì)在AS斑塊穩(wěn)定性中的作用，為明確云南漢族IFNGR基因多態(tài)性是否影響AS斑塊穩(wěn)定性提供理論依據(jù)，為早期、有效評(píng)估斑塊穩(wěn)定性和預(yù)警急性心腦血管事件提供有效方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取云南省第一人民醫(yī)院內(nèi)干科2014年3月至2015年3月收治的漢族患者204例，經(jīng)頸動(dòng)脈超聲檢查和相關(guān)臨床癥狀分為AS斑塊不穩(wěn)定組(觀察組)和無(wú)斑塊/AS斑塊穩(wěn)定組(對(duì)照組)。其中觀察組111例，男65例，女46例，年齡(76.89±12.08)歲；對(duì)照組97例，男57例，女40例，年齡(65.99±16.32)歲。

診斷標(biāo)準(zhǔn)為研究對(duì)象經(jīng)頸動(dòng)脈超聲檢查，發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜-中膜厚度(IMT)≥1.3 mm者即可做出頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的診斷。根據(jù)斑塊病理類(lèi)型及超聲特點(diǎn)，將斑塊分為4型，即硬斑、軟斑、扁平斑和潰瘍斑。硬斑和扁平斑因表面有鈣鹽沉積，富含纖維組織屬穩(wěn)定斑塊，而軟斑與潰瘍斑富含脂質(zhì)及大量的炎性細(xì)胞，易脫落出血，屬不穩(wěn)定斑塊?；颊呷☆^后仰臥位，檢查一側(cè)頸動(dòng)脈時(shí)頭偏向?qū)?cè)約45°，分別檢查左右頸動(dòng)脈。探頭沿頸動(dòng)脈走向，自下向上作連續(xù)縱、橫切面掃查。檢測(cè)部位包括:頸總動(dòng)脈(CCA)的遠(yuǎn)端(頸內(nèi)、外動(dòng)脈分叉水平連線下方1.0～1.5 cm),頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)起始部(分叉水平上方1.0～1.5 cm)和頸總動(dòng)脈分叉(BIF)，頸外動(dòng)脈(ECA)。觀察頸動(dòng)脈IMT，有無(wú)斑塊，斑塊的形態(tài)、大小及性質(zhì)，彩色血流顯像觀察血流是否通暢，色彩明暗程度，有無(wú)彩色血流充盈缺損。臨床表現(xiàn)中存在冠心病心絞痛、急性腦卒中患者為AS斑塊不穩(wěn)定組(觀察組)。冠心病心絞痛診斷符合2012年中國(guó)《非ST段抬高型急性冠脈綜合征診斷和治療指南》，具有心絞痛典型癥狀。腦卒中患者具有明確的腦梗死影像學(xué)依據(jù)。

1.2 儀器與試劑 運(yùn)用Philips-iu 22彩色超聲診斷儀進(jìn)行頸動(dòng)脈超聲檢查。全血基因組DNA提取試劑盒、PCR擴(kuò)增和電泳所需試劑購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)公司；細(xì)胞因子微球?yàn)锽D公司TH1/TH2 cytokine kitⅡ試劑盒。Chemidoc XRS化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)自Bio-RAD，Nano Drop2000(ND2000)超微量分光光度計(jì)購(gòu)自Thermo公司，PCR儀為Gene Amp PCR Systeerm 9700，高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自日本Hitachi-CR22G，BG-sub MIDI水平電泳儀購(gòu)自Baygene公司；測(cè)序由碩陽(yáng)科技生物技術(shù)公司完成。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 基因組的DNA提取及質(zhì)量鑒定 依照全血基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)逐步抽提基因組DNA。取2 μL用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量，其余分裝凍存于-60 ℃冰箱備用。用1.2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)外周血DNA的質(zhì)量，上樣2 μL，Marker為DL2000。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)與合成 從Genebank下載序列，用GeneTool軟件設(shè)計(jì)引物。IFNGR1 Vall4Met引物為，F(xiàn):5′-CAG CGA CCG TCG GTA GCA GC-3′，R:5′-GCC ACG AAC TGA GAC CAC GAT G-3′；擴(kuò)增片段為722 bp。IFNGR2 Gln64Arg引物為，F(xiàn):5′-ACC AGT AGG GCC ATC TTT GTA GC-3′,R:5′-TGC CAG TGT AGT TTA AGC CTT CAG-3′；擴(kuò)增片段為531 bp。內(nèi)參引物為，F(xiàn):5′-GCC TTC CCA ACC ATT CCC TTA-3′；R:5′-TCA CGG ATT TCT GTT GTG TTT C-3′；擴(kuò)增片段為426 bp。

1.3.3 目的片段的PCR擴(kuò)增及其產(chǎn)物檢測(cè)分析 PCR擴(kuò)增體系為20 μL，含2×Taq PCR Master Mix 10 μL，25 μmol/L上游、下游引物各0.25 μL，模板DNA 1 μL，IFNGR1 Vall4Met的擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，63 ℃退火45 s,72 ℃延伸60 s,32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。擴(kuò)增IFNGR2 Gln64Arg的退火溫度為60 ℃；擴(kuò)增IFN-γ+2 109的退火溫度為52 ℃。取2 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。其余PCR產(chǎn)物送公司測(cè)序檢測(cè)目的片段序列。

1.3.4 PCR產(chǎn)物直接測(cè)序 測(cè)序引物與PCR擴(kuò)增引物相同。對(duì)PCR產(chǎn)物用乙醇沉淀法純化，經(jīng)Bigdye測(cè)序反應(yīng)，用ABI 3730XL測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。 測(cè)序結(jié)果采用DNAStar、GeneTool軟件分析基因型。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血漿細(xì)胞因子濃度 按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行流式細(xì)胞儀方案設(shè)計(jì)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管收集患者外周靜脈血1～2 mL，3 000 r/min離心10 min，取0.5～1.0 mL血漿凍存?zhèn)溆谩?0 μL血漿和50 μL微球混合液混合，1.5 h后加入T1染色液，孵育1.5 h后，加入Buffer，1 500 r/min離心10 min，去除上清液后加入Buffer,上流式細(xì)胞儀，根據(jù)分析軟件系統(tǒng)測(cè)定血漿中IFN-γ水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和分析，計(jì)算各組的等位基因和基因型頻率。對(duì)樣本及基因型分布頻率 用Hardy - Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料的組間比較使用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料的組間比較使用t檢驗(yàn)，與AS斑塊穩(wěn)定性的相關(guān)性用相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Hardy - Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn) 為了確保資料的可靠性，對(duì)等位基因頻率進(jìn)行了Hardy-Weinberg平衡定律檢驗(yàn)(表1)。

2.2 目的片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及測(cè)序分析 對(duì)204例患者的外周血DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均擴(kuò)增到特異性條帶，其片段大小與預(yù)期結(jié)果相符合(圖1、2)。

2.3 IFNGR1 Vall4Met、IFNGR2 Gln64Ar基因型頻率及等位基因頻率的比較 觀察組和對(duì)照組IFNGR1 Vall4Met均為野生型，位點(diǎn)未見(jiàn)突變。

2.3.1 IFNGR2 Gln64Arg AA、AG和GG 基因型與AS斑塊穩(wěn)定性分析 觀察組IFNGR2 Gln64Arg的AA、AG、GG基因型的頻率分別為51.95%、 53.06%、58.62%，對(duì)照組AA、AG、GG基因型的頻率分別為48.05%、46.94%、41.38%，觀察組IFNGR2 Gln64Arg的AA、AG、GG基因型頻率與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.824)，見(jiàn)表2。

表1 IFNGR2 A/G等位基因頻率Hardy-Weinberg平衡定律檢驗(yàn)

A:電泳檢測(cè)IFNGR1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；B:IFNGR1 Vall4Met的反向測(cè)序圖 (CC基因型，野生型)。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序檢測(cè)IFNGR1 Vall4Met

A：電泳檢測(cè)IFNGR2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；B:IFNGR2 Gln64Arg的正向測(cè)序圖 (AA基因型，野生型)；C：IFNGR2 Gln64Arg的正向測(cè)序圖 (AG基因型，雜合子);D：IFNGR2 Gln64Arg的正向測(cè)序圖(GG基因型，純合子)。

圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序檢測(cè)IFNGR2 Gln64Arg

2.3.3 IFNGR2 Gln64Arg 等位基因A和G與AS斑塊穩(wěn)定性的關(guān)系分析 觀察組IFNGR2 Gln64Arg的A、G等位基因頻率分別為52.38%和55.13%，對(duì)照組A、G等位基因頻率分別為47.62%和44.87%，觀察組IFNGR2 Gln64Arg的A、G等位基因頻率與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.589),見(jiàn)表3。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血漿IFN-γ的水平 觀察組血漿中IFN-γ水平為(4.60±1.91)ng/mL，對(duì)照組血漿中IFN-γ水平為(4.88±2.10)ng/mL，觀察組與對(duì)照組血漿IFN-γ水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.318)。

表3 IFNGR2 A、G等位基因與AS斑塊穩(wěn)定性(n)

2.5 血漿IFN-γ水平與AS斑塊穩(wěn)定性的關(guān)系 Pearson相關(guān)分析顯示，血漿IFN-γ水平與AS斑塊穩(wěn)定性無(wú)相關(guān)性(P=0.308)。

3 討 論

目前心血管疾病已經(jīng)成為威脅人類(lèi)健康的一大殺手，有研究顯示，心血管病的發(fā)病率和病死率已經(jīng)超過(guò)了惡性腫瘤，每年全國(guó)有超過(guò)300萬(wàn)人死于心血管疾病，且發(fā)病年齡呈現(xiàn)低齡化的趨勢(shì)。AS是冠狀動(dòng)脈疾病、腦梗死等血管性疾病的病理基礎(chǔ)，因此，防治AS已成為防治心腦血管病的根本性戰(zhàn)略措施之一。AS的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，有血栓形成學(xué)說(shuō)、脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說(shuō)、細(xì)胞因子學(xué)說(shuō)、炎癥-損傷反應(yīng)學(xué)說(shuō)、病毒學(xué)說(shuō)、受體缺失學(xué)說(shuō)和癌基因?qū)W說(shuō)等，但近年來(lái)大量的基礎(chǔ)和臨床研究支持AS是一種慢性炎癥和自身免疫性疾病這一新看法[2-3]。IFN-γ是由免疫細(xì)胞分泌的多功能細(xì)胞因子，能增強(qiáng)抗原提呈、活化T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞并促進(jìn)其釋放炎性因子，協(xié)同其他致炎因子促進(jìn)粥樣病灶處的炎性反應(yīng)，加速病變進(jìn)展[4]。另外，IFN-γ尚有阻止膠原蛋白合成的抗纖維化的作用[5]，這些是通過(guò)與特異的細(xì)胞表面受體復(fù)合物(IFNGR)結(jié)合而發(fā)揮作用。

人類(lèi)DNA序列的變異以單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)為最常見(jiàn)的遺傳變異類(lèi)型。某些位點(diǎn)上的基因多態(tài)性會(huì)影響基因的轉(zhuǎn)錄效率和/或表達(dá)產(chǎn)物的功能，并成為不同人群中一些疾病存在不同發(fā)病率或不同臨床表現(xiàn)、治療反應(yīng)及預(yù)后的內(nèi)在機(jī)制[6]。IFNGR是由配體結(jié)合鏈(IFNGR1)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(IFNGR2)兩個(gè)亞單位組成的異源二聚體，IFNGR1和IFNGR2存在Val14Met和Gln64Arg氨基酸多態(tài)性，并發(fā)現(xiàn)它們的基因型與某些疾病(主要為傳染性、免疫學(xué)疾病)的易感性有關(guān)，但目前研究?jī)H限于IFN-γ與AS的相關(guān)性研究，IFN-γ多態(tài)性及其受體基因多態(tài)性與AS及其斑塊穩(wěn)定性研究甚少，本研究旨在明確本地區(qū)特定人群血IFN-γ水平及IFNGR多態(tài)性與AS斑塊穩(wěn)定性間是否存在相互關(guān)系。經(jīng)檢測(cè)，研究并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)血漿IFN-γ水平及IFNGR多態(tài)性位點(diǎn)與AS斑塊穩(wěn)定性有相互關(guān)系，血漿IFN-γ及IFNGR基因多態(tài)性尚不能作為云南漢族人群AS易損斑塊的預(yù)警指標(biāo)。

[1]Gattoni A,Parlato A,Vangieri B,et al Interferon-gamma:biologic functions and HCV therapy(type Ⅰ/Ⅱ)[J].Clin Ter，2006,157(4):377-386.

[2]Virella G,Lopes-Virella MF.Atherogenesis and the humoral immune response to modified lipoproteins[J].Atherosclerosis,2008,200(2):239-246.

[3]Getz GS.Thematic review series:the immune system and atherogenesis[J].J Lipid Res,2005,46(1):1-10.

[4]Whitman SC,Ravisankar P,Daugherty A.IFN-gamma deficiency exerts gender-specific effects on atherogenesis in apolipoprotein E-/-mice[J].J Interferon Cytokine Res,2002,22(6):661-670.

[5]Daugherty A,Webb NR,Rateri DL,et al.Thematic review series:The immune system and atherogenesis[J].J Lipid Res,2005,46(9):1812-1822.

[6]Chevillard C,Henri S,Stefani F,et al.Two new polymorphisms in the human interferon gamma(IFN-gamma)promoter[J].Eur J Immunogenet,2002,29(1):53-56.

Correlation between IFNGR gene polymorphism and atherosclerotic plaque stability in Yunnan Han nationality

YangTianrui1，SaYalian2

(1.DepartmentofGeriatrics;2.BasicResearchRoom,YunnanProvincialFirstPeople′sHospital,Kunming,Yunnan650032,China)

Objective to explore the correlation between interferon-γ receptor(IFNGR)2 amino acid sites Val14Met and GIn64Arg polymorphism and atherosclerosis plaque stability in Yunnan Han nationality.Methods The patients with unstable atherosclerotic plaque in our hospital from March 2014 to March 2015 were collected as the observation group and contemporaneous patients with stable atherosclerotic plaque/ non- plaque as the control group.The peripheral venous blood was collected for extracting genomic DNA.IFNGR Val14Met and GIn64Arg loci genotype was detected by the PCR product direct sequencing method.The sequencing results were analyzed by adopting the DNAStar and GeneTool software.The levels of plasma cytokines(IFN-γ)was detected by the flow cytometry.Results Two hundreds and four native Han patients were included in this study,including the observation group,109 cases,age(76.89±12.08)years old;the control group,95 cases,age(65.99±16.32)years old.The polymorphism change of IFNGR1 Vall4Met loci was not found in the two groups.In the observation group,the frequency of IFNGR2 Gln64Arg genotype AA was 51.95%(40/77)，which of AG was 53.06%(52/98)and which of GG was 58.62%(17/29);in the control group,the frequencies were 48.05%(37/77),46.94%(46/98)and 41.38%(12/29),chi-square test,P=0.824.The IFNGR2 Gln64Arg genotypes AA,AG and GG had no relation with atherosclerotic plaque stability.The A and G allele frequencies in the observation group were 52.38%(132/252)and 55.13%(86/156)respectively,which of the control group were 47.62%(120/252)and 44.87%(70/156),chi-square test′sP=0.661.The IFNGR2 Gln64Arg A/G allele had no relation with atherosclerotic plaque stability.By Hardy-Weinberg genetic balance test,the gene frequency in this sample population was in accordance with the genetic equilibrium law.The plasma IFN-γ level in the observation group was(4.60±1.91)ng/mL,which in the control group was(4.88±2.10)ng/mL,the difference was not statistically significant(P=0.318);the plasma IFN-γ content had no relation with atherosclerotic plaque stability(P=0.308).Conclusion The genetic polymorphisms of IFNGR can not serve as a warning indicator of atherosclerotic plaque stability.

atherosclerosis;IFNGR;gene;polymorphism

楊天睿(1972-),碩士，主治醫(yī)師，主要從事老年病及心血管內(nèi)科的研究。

??·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.33.011

R543.5

A

1671-8348(2016)33-4643-03

2016-03-11

2016-06-25)