HPLC法測定姜黃根莖及姜黃素飲料中姜黃素類化合物的含量

孫鵬堯,李丹丹,牟德華

(河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,河北石家莊 050018)

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HPLC法測定姜黃根莖及姜黃素飲料中姜黃素類化合物的含量

孫鵬堯,李丹丹,牟德華*

(河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,河北石家莊 050018)

建立高效液相色譜(HPLC)測定姜黃根莖以及姜黃素飲料中姜黃素類化合物的含量。樣品用乙醇輔助超聲波提取,以DIKMA Platisil ODS(4.6 mm×250 mm,5 μm)柱為分析柱,乙腈和水(磷酸調(diào)pH為3.0)為流動相進行梯度洗脫,流速:1.0 mL/min,檢測波長:425 nm,柱溫:30 ℃。姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素分別在1.00～200.00,0.96～192.00,0.96～192.00 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)R2>0.999。平均回收率分別為106.87%(RSD=1.24%)、105.28%(RSD=0.48%)、96.86%(RSD=0.26%)。本方法操作簡單、快速、重復(fù)性好,可用于姜黃根莖及飲料中的姜黃素類化合物的檢測。

HPLC,姜黃,飲料,姜黃素類化合物,含量測定

姜黃,為姜科姜黃屬植物(CurcumalongaL.)的根莖,是多年生草本植物,主要分布在中國、印度、緬甸及其他熱帶、亞熱帶地區(qū)。姜黃素類化合物為它的主要生物活性成分,具有抗炎抑菌[1-2]、抗氧化[3]、抗腫瘤[4]、抗癌[4-5]、抗病毒[5]、抗動脈粥樣硬化[6]、保肝護肝[7]等多種藥理功效。姜黃素類化合物多用于醫(yī)藥、食品著色劑以及化妝品上[8],它作為藥物中的有效成分和重要的天然色素染料幾乎沒有任何副作用[9],應(yīng)用日益廣泛,并逐漸被應(yīng)用到保健食品和飲料上。目前對于保健食品和飲料中的姜黃素的測定還沒有相應(yīng)的國標方法。因此,建立簡便可行的HPLC檢測方法極為重要。

姜黃素類化合物的檢測方法主要有分光光度計法、薄層色譜法、毛細管電泳法、HPLC法等[10-13]。其中,分光光度計法適用于姜黃素的初級定量,測定的是總姜黃素類化合物的含量[14];薄層色譜法通常用來做半定量或限定實驗,由于姜黃素類化合物不穩(wěn)定,在薄層上分離時容易受光及其他因素影響,導(dǎo)致目標檢測物測定結(jié)果不夠精確[14];毛細管電泳法相對于其他分析方法來說重現(xiàn)性較差;HPLC法因其分離效果好、選擇性好、靈敏度高等特點成為目前測定姜黃素類化合物的常用方法[15-18]。本文建立了一種測定姜黃根莖和姜黃素飲料中的姜黃素類化合物的方法,并進行了方法學(xué)的研究。該方法簡便、快捷、重現(xiàn)性好,可用于測定姜黃及其同屬植物以及飲料中姜黃素類化合物的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干燥姜黃根莖 河北食品添加劑有限公司提供,分別購自緬甸、印度、四川犍為縣;市售姜黃飲料 日本市場(品牌);自制姜黃飲料;復(fù)合穩(wěn)定劑(黃原膠∶CMC∶果膠∶β-環(huán)糊精=3∶3∶1∶2),本實驗室調(diào)配。

姜黃素對照品(Ⅰ)、去甲氧基姜黃素對照品(Ⅱ)、雙去甲氧基姜黃素對照品(Ⅲ)成都艾科達試劑有限公司,純度均≥98%;乙醇 石家莊新宇三陽實業(yè)有限公司,分析純;乙腈 湖北杜文化工科技有限公司公司,色譜純;實驗用水為高純水,其他試劑均為分析純。

LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司;Platisil ODS柱(4.6 mm×250 mm,5 μm) 北京迪馬歐泰科技發(fā)展中心;756P型紫外分光光度計 上海光譜儀器有限公司;DELTA 320型pH計 梅特勒-托利多儀器有限公司;ARI 140型電子分析天平 美國雙杰兄弟集團有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 姜黃素飲料的制備加工工藝 參照文獻[19]的工藝,在高速攪拌下將復(fù)合穩(wěn)定劑加到60～70 ℃水中,完全溶解后加入姜黃素及其他輔料(檸檬酸、阿斯巴甜、果葡糖漿),然后經(jīng)過均質(zhì)、灌裝、殺菌、冷卻,得到成品。其中,姜黃素原料加入量為0.30%,復(fù)合穩(wěn)定劑加入量為0.3%,檸檬酸加入量為0.18%,阿斯巴甜加入量為0.02%,果葡糖漿加入量為4.00%[19]。

1.2.2 對照品溶液的配制 準確稱取姜黃素對照品Ⅰ 0.0250、Ⅱ 0.0240、Ⅲ 0.0240 g分別置于25 mL的容量瓶中,用甲醇溶解稀釋至刻度,搖勻,配制成濃度為1 mg/mL的對照品儲備液。分別吸取上述對照品儲備溶液各5 mL,加甲醇定容至25 mL,作為姜黃素類化合物對照品溶液。

1.2.3 樣品處理 姜黃根莖:將干燥的姜黃根莖用粉碎機粉碎,過40目篩得姜黃粉末,放真空干燥器中備用。稱取1.0 g姜黃粉末于150 mL錐形瓶中,加入20 mL 90%乙醇超聲提取(功率為100 W,40 ℃)30 min,4500 r/min離心15 min,提取3次,合并上清液于100 mL容量瓶中,用90%乙醇定容至刻度[20]。

姜黃素飲料:取5 mL樣品于50 mL離心管中,加入25 mL 90%乙醇超聲波提取(功率為100 W,室溫)15 min,4500 r/min離心15 min,取上清液于50 mL容量瓶中,用90%乙醇定容至刻度[21]。

所有樣品過0.45 μm的濾膜,待分析。

1.2.4 HPLC檢測姜黃素類化合物的色譜條件

1.2.4.1 檢測波長的確定 用紫外-可見分光光度計對姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素標品溶液進行全波長掃描,根據(jù)姜黃素類化合物在紫外波長范圍內(nèi)的最大吸收峰確定實驗用紫外吸收的波長。

1.2.4.2 流動相、流速及其pH的確定 HPLC檢測姜黃素類化合物含量,選用C18柱時,流動相一般為乙腈和水。本實驗在相同色譜條件下,分別用冰乙酸、甲酸、磷酸、三氟乙酸調(diào)節(jié)水溶液的pH(pH=3.0)。比較不同酸性試劑調(diào)節(jié)水相pH時對姜黃素類化合物分離效果的影響,根據(jù)分離效果確定流動相。流動相的pH、流速根據(jù)單因素實驗設(shè)計進行優(yōu)選,流動相pH為2.5、2.8、3.0、3.5、4.0,流速為0.3、0.5、0.8、1.0 mL/min。

1.2.4.3 柱溫的確定 本研究采用迪馬Platisil ODS C18色譜分離柱,柱溫分別選擇25、30、35 ℃下進行檢測,優(yōu)化各參數(shù)。

1.2.5 姜黃素類化合物標準曲線的建立和方法學(xué)的考察

1.2.5.1 姜黃素類化合物標準曲線的建立 精密吸取姜黃素類化合物對照品溶液,將其配制成1、2、20、40、100、200 mg/L的對照品溶液,在最優(yōu)的色譜條件下檢測。以不同濃度的姜黃素類化合物為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制標準曲線并得出線性回歸方程。檢出限以3倍的信噪比(S/N)計算得出[18]。

1.2.5.2 方法學(xué)考察實驗 精密度實驗:精密吸取姜黃素類化合物對照品溶液,取20 μL連續(xù)進樣6次,測定其峰面積積分值,考察精密度。

穩(wěn)定性實驗:精密吸取姜黃素類化合物對照品溶液20 μL,分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h測定其峰面積,考察其穩(wěn)定性。

樣品重復(fù)性實驗:取同批姜黃粉末和飲料樣品各5份,分別按照1.2.3樣品處理的方法處理后進樣分析,以色譜峰峰面積為指標計算RSD,考察方法的重復(fù)性。

加標回收率實驗:精密稱取已知含量的同批姜黃粉末和飲料各9份,分別加入樣品中各成分含有量的80%、100%、120%的對照品,按照1.2.3樣品處理的方法制備所需溶液并進行分析,以色譜峰峰面積為指標計算各種姜黃素類化合物的回收率[18]。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC檢測姜黃素類化合物色譜條件的確定

2.1.1 檢測波長的選擇 在190～800 nm波長下分別對姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素標品溶液進行掃描,發(fā)現(xiàn)姜黃素類化合物在254 nm左右和425 nm左右均有較大吸收峰,但是根據(jù)文獻[22-24]報道,在254 nm左右波長下有雜質(zhì)干擾,并且靈敏度較低,需要進樣量大,因此本法選用425 nm為檢測波長。

2.1.2 流動相的選擇及其流速、pH的確定 本實驗選擇流動相為乙腈和水,并分別選用冰乙酸、甲酸、磷酸、三氟乙酸調(diào)節(jié)水溶液的pH。實驗結(jié)果證明采用這四種酸性試劑調(diào)節(jié)水溶液pH在2.5～4.0范圍內(nèi)對于姜黃素類化合物的分離效果沒有顯著差異?？紤]到冰乙酸、甲酸以及三氟乙酸都屬于揮發(fā)酸,調(diào)節(jié)后pH不穩(wěn)定,并且三氟乙酸屬于強酸,有強烈腐蝕性,所以選擇乙腈-磷酸水溶液作為流動相。

隨著流動相流速的提高,姜黃素類化合物的出峰時間明顯提前,并且峰底變窄,當流動相流速為1.0 mL/min時具有較好的峰形。隨著流動相pH的降低,分離度增大,當pH3.0時分離度趨于平緩,但是較低的pH對色譜柱會造成破壞,所以選擇流動相pH3.0,此時分離效果較好。

表3 姜黃素類化合物的回歸方程、線性范圍及檢出限Table 3 Regression equation,linear range and limit of quantification of curcuminoids

2.1.3 柱溫的確定 色譜柱的溫度影響流動相的傳質(zhì)速率。隨著柱溫的升高,傳質(zhì)速率提高,但是柱溫的選擇還要考慮到被檢測物質(zhì)的性質(zhì)等。在溫度梯度實驗中,姜黃類化合物的分離效果差別不大,綜合考慮柱溫選擇為30 ℃。

2.1.4 姜黃素類化合物分離的色譜條件的確定 姜黃素類化合物分離的最優(yōu)色譜條件和梯度洗脫程序分別見表1和表2。

表1 姜黃素類化合物分離的色譜條件Table 1 Chromatographic separation conditions of curcuminoids compounds

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution programs

按照表1和表2所示條件對姜黃素類化合物對照品進行分析,此時姜黃素類化合物能夠達到良好的分離,并且具有良好的峰形(結(jié)果見圖1)。

圖1 姜黃素類化合物的對照品溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard curcuminoids注:1:雙去甲氧基姜黃素;2:去甲氧基姜黃素;3:姜黃素。

2.2 姜黃素類化合物標準曲線的建立和方法學(xué)的考察

2.2.1 姜黃素類化合物標準曲線的繪制 按照1.2.5.1操作,配制不同濃度梯度的姜黃素類化合物對照品溶液,在最優(yōu)色譜條件進行HPLC分析,得出姜黃素類化合物的線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)R2與檢出限(LOD),結(jié)果見表3。

2.2.2 方法學(xué)的考察 方法學(xué)的考察實驗包括精密度實驗、穩(wěn)定性實驗、重復(fù)性實驗以及加標回收率實驗,結(jié)果見表4。

表4 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性以 及加標回收率實驗結(jié)果Table 4 Test results of precision,stability, repeatability and recoveries of spiked standard

2.3 不同種類的姜黃根莖和姜黃素飲料中姜黃素類化合物的測定

精確吸取20 μL樣品處理溶液,按1.2.4中色譜條件測定其中姜黃素類化合物含量,不同種類的姜黃根莖測定結(jié)果見圖2和表5;不同種類的姜黃素飲料測定結(jié)果見圖3和表6。

圖2 姜黃根莖提取液色譜圖Fig.2 Chromatograms of turmeric rhizome extract

表5 姜黃根莖樣品測定結(jié)果(n=3)Table 5 Analysis results of actual sample of Curcuma longa L(n=3)

表6 姜黃素飲料樣品測定結(jié)果(n=3)Table 6 Analysis results of actual sample of curcumin beverage(n=3)

圖3 飲料中姜黃素類化合物色譜圖Fig.3 Chromatograms of curcuminoids in beverage

由表5數(shù)據(jù)結(jié)果分析,不同地區(qū)生長的姜黃中所含姜黃素類化合物的含量不同。在所分析的姜黃根莖中姜黃素類化合物含量最高的印度二批的姜黃,其次是緬甸三批的姜黃、印度一批的姜黃,含量最低的是四川姜黃。然而姜黃素在姜黃素類化合物中所占的比例最大的是印度一批姜黃,為63.05%,其次是四川姜黃,所占比例為62.27%,再次是印度二批和緬甸一批,所占比例分別是59.18%和56.92%。去甲氧基姜黃素含量最高的是印度二批姜黃,其次是緬甸三批和緬甸二批。雙去甲氧基姜黃素含量最高的是緬甸三批,其次是緬甸二批和印度二批。另外,印度二批的姜黃中所含的姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素的含量所占比例大致相同。

由表6數(shù)據(jù)分析可知,所研究的4種姜黃素飲料中主要的姜黃素類化合物成分均是姜黃素,分別約占姜黃素類化合物總量的87.5%、85.6%、87.8%和82.8%。其中,市售姜黃素飲料中種類2中的去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素的含量最高,而市售姜黃素飲料種類3中的姜黃素含量最高。

雖然這3種姜黃素類化合物在結(jié)構(gòu)上相近,很多生理活性相似,但是由于它們在結(jié)構(gòu)上烷氧基的微小差異,使其在生理功效上也有所不同[23,25],例如在抑制血管平滑肌細胞的增殖、動脈粥樣硬化的形成方面最強的是姜黃素,其次是去甲氧基姜黃素[26];在抑制人內(nèi)皮細胞生長增殖作用活性最強的是雙去甲氧基姜黃素[27]。在抑制脂質(zhì)過氧化方面,活性強弱順序依次是姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素[28]。因此,不同種類的姜黃素飲料其中的各姜黃素類化合物的含量有所不同,其保健的側(cè)重點也不相同。

3 結(jié)論

本研究建立了利用HPLC方法分析檢測姜黃根莖及飲料中姜黃素類化合物的方法,優(yōu)化了色譜條件。該方法操作簡單,并且具有較高的準確性和精密性,能夠同時測定姜黃根莖及飲料中3種姜黃素類化合物的含量,為保健品中姜黃素類化合物的測定提供了參考依據(jù)。

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High-performance liquid chromatography method for quantitative determination of curcuminoids in rhizomes ofCurcumaLongaL. and curcumin beverage

SUN Peng-yao,LI Dan-dan,MO De-hua*

(College of Bioscience and Bioengineering,Hebei University of Science and Technology,Shijiazhuang 050018,China)

AHPLCmethodwasestablishedforthedeterminationofcurcuminoidscontentinrhizomesofCurcuma Longa L.andcurcuminbeverage.Thesampleswereextractedinethanolbyultrasonictreatment.ThedeterminationbyRP-HPLCwascarriedoutusingDIKMAPlatisilODScolumn(4.6mm×250mm,5μm)andacetonitrile-water(pH=3.0adjustedbyphosphoricacid)withgradientelutionataflowrateof1mL/min.TheUVdetectionwavelengthwas425nmandthecolumntemperaturewassetat30 ℃.Thecalibrationcurveswerelinearintherangeof1.00～200.00,0.96～192.00,0.96～192.00mg/L(R2>0.999)forcurcumin,demethoxycurcuminandbisdemethoxycurcumin.Theaveragerecoverieswere106.87%(RSD=1.24%),105.28%(RSD=0.48%)and96.86%(RSD=0.26%),respectively.Themethodwassimple,rapidandreproducible,andcanbeusedforthedeterminationofcurcuminoidsinrhizomesofCurcuma longa L.andcurcuminbeverage.

HPLC;Curcuma longa L.;beverage;curcuminoids;contentdetermination

2016-04-25

孫鵬堯(1990-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)與工程，E-mail:spy_yao@163.com。

*通訊作者:牟德華(1960-)，男，本科，教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工，E-mail:dh_mou@163.com。

TS207.3

A

1002-0306(2016)21-0313-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.052