響應(yīng)面法優(yōu)化超高壓鈍化藍(lán)莓汁中兩種酶活性工藝條件

李星賀,朱金艷,2,孟憲軍,*

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧沈陽(yáng) 110161;2.莊河市食品檢驗(yàn)監(jiān)測(cè)中心,遼寧大連 116400)

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響應(yīng)面法優(yōu)化超高壓鈍化藍(lán)莓汁中兩種酶活性工藝條件

李星賀1,朱金艷1,2,孟憲軍1,*

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧沈陽(yáng) 110161;2.莊河市食品檢驗(yàn)監(jiān)測(cè)中心,遼寧大連 116400)

為了得到超高壓鈍化藍(lán)莓汁中酶活性的最優(yōu)工藝參數(shù),選取過(guò)氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)的酶殘留活性為響應(yīng)值,根據(jù)Central-Composite實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,建立了酶的殘留活性與超高壓處理壓力、時(shí)間和溫度之間的數(shù)學(xué)模型。并采用Design-Expert8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:鈍化過(guò)氧化物酶(POD)最佳處理?xiàng)l件為:處理壓力500 MPa、時(shí)間5 min和溫度40 ℃,處理后POD酶的殘留活性降至49.13%;鈍化多酚氧化酶(PPO)最佳處理?xiàng)l件為:處理壓力500 MPa、時(shí)間15 min和溫度10 ℃,處理后PPO酶的殘留活性降至4.776%。此外,在實(shí)驗(yàn)條件為壓力500 MPa、處理時(shí)間15 min及溫度10 ℃時(shí)處理藍(lán)莓汁,POD和PPO的綜合鈍化效果最佳。

過(guò)氧化物酶,多酚氧化酶,超高壓,響應(yīng)面法,藍(lán)莓汁

藍(lán)莓(Blueberry)屬杜鵑花科越桔屬植物,果實(shí)呈藍(lán)色,果肉細(xì)膩,果味酸甜,風(fēng)味獨(dú)特。藍(lán)莓含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分及多種酶類(lèi),如花色苷、維生素A、B、E、礦物質(zhì)及過(guò)氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)等[1-3]。藍(lán)莓果實(shí)由于存在收獲時(shí)間短、季節(jié)性強(qiáng)、不耐貯存運(yùn)輸?shù)热秉c(diǎn),所以給鮮銷(xiāo)帶來(lái)很大困難,目前主要采用榨汁并經(jīng)殺菌的方式予以解決,但殺菌過(guò)程往往會(huì)造成產(chǎn)品的色澤、風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)等品質(zhì)指標(biāo)下降,嚴(yán)重影響產(chǎn)品的可接受程度[4]。因此以響應(yīng)面法優(yōu)化超高壓鈍化藍(lán)莓汁中兩種酶活性工藝條件,達(dá)到兼顧殺菌與保留品質(zhì)的雙重目標(biāo)。

超高壓加工工藝是一種新興的冷加工技術(shù),近些年來(lái)發(fā)展十分迅速[5-8]。在多種水果加工研究中發(fā)現(xiàn),超高壓處理不僅能殺滅水果果肉或果汁中的微生物,延長(zhǎng)產(chǎn)品保藏期,并且可以抑制酶的活性[9-11]。POD、PPO均為降解花色苷的酶,能水解花色苷糖苷鍵產(chǎn)生花色素和糖,對(duì)藍(lán)莓汁中花色苷含量產(chǎn)生影響。并且會(huì)使藍(lán)莓汁褐變,影響產(chǎn)品的外觀,同時(shí)催化反應(yīng)產(chǎn)物會(huì)影響果汁的口感和風(fēng)味[12-15]。超高壓鈍化酶是通過(guò)改變酶蛋白的構(gòu)象,即變性來(lái)抑制酶的活性[16-17]。酶的催化作用產(chǎn)生于其活性中心,活性中心與三維構(gòu)象有關(guān)。高壓對(duì)酶的影響分為兩種情況:壓力較低時(shí)可能激活酶,壓力較高時(shí)使酶失去活性,加熱可以強(qiáng)化高壓抑制酶活性,超高壓處理中,酶的活性不僅取決于壓力的大小,同時(shí)與處理溫度、保壓時(shí)間和處理對(duì)象的化學(xué)組成都有關(guān)系[18]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)藍(lán)莓汁超高壓滅菌效果研究較多,但對(duì)藍(lán)莓汁超高壓過(guò)程中POD、PPO的變化研究較少。

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)加工工藝對(duì)藍(lán)莓汁中花色苷含量產(chǎn)生影響,而POD、PPO為降解花色苷的酶。因此,采用響應(yīng)面法對(duì)超高壓鈍化藍(lán)莓汁中兩種酶活性的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,得到兩種酶鈍化效果最佳的工藝條件,進(jìn)而降低藍(lán)莓汁中花色苷的降解,減少加工工藝對(duì)花色苷含量造成的損失。使藍(lán)莓果汁在達(dá)到衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的前提下,保持產(chǎn)品原有風(fēng)味口感和營(yíng)養(yǎng)成分。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍(lán)莓 品種為 “藍(lán)豐”,采自遼寧省莊河藍(lán)莓基地,采摘后實(shí)驗(yàn)室-18 ℃冷藏;乙酸、乙酸鈉、PEG、PVPP、TritonX-100、愈創(chuàng)木酚、過(guò)氧化氫、鄰苯二酚均購(gòu)于國(guó)藥試劑。

全自動(dòng)超高壓殺菌機(jī)(HPP-600-L) 溫州濱一機(jī)械有限公司;循環(huán)水真空泵(SHZ-DIII) 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;高速離心機(jī)(CR21G) 日本日立公司;恒溫水浴鍋(PK-S26) 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;分光光度計(jì)(Varian Cary WinUV) 美國(guó)安捷倫公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試樣的準(zhǔn)備 試樣制作工藝流程:藍(lán)莓→燙漂解凍→1∶5(質(zhì)量比)加水榨汁→過(guò)濾去渣(兩層粗紗布)→4 ℃,12000 r/min下離心10 min→取上層液抽濾→定量、裝瓶(聚乙烯塑料瓶,不留頂隙)

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方案 以前期實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)得到結(jié)論,隨著超高壓壓力的升高、保壓時(shí)間的延長(zhǎng)及介質(zhì)溫度的升高,POD和PPO的殘留活性降低。采用Design-Expert8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì),以壓力、時(shí)間和溫度作為自變量,以POD和PPO的殘留活性為響應(yīng)值,局限于實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)條件,實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼見(jiàn)表1。空白對(duì)照為常壓(0.1 MPa)下未經(jīng)處理的樣品[19-21]。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表Table 1 Experimental values and coded level of factors

1.3 酶的活性檢測(cè)

1.3.1 過(guò)氧化物酶(POD)酶活性的測(cè)定 反應(yīng)混合液為0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH6.5)50 mL、50 mmol/L愈創(chuàng)木酚溶液19 μL及30% H2O2溶液228 μL,取光徑為1 cm比色皿兩個(gè),一個(gè)加入1 mL酶液和3 mL反應(yīng)混合液,另一個(gè)加入3 mL 0.2 mL/L磷酸緩沖液(pH6.5)作為對(duì)照。用分光光度計(jì)在470 nm處測(cè)定反應(yīng)3 min前后反應(yīng)液吸光度變化[18]。

1.3.2 多酚氧化酶(PPO)酶活性的測(cè)定 取0.2%的鄰苯二酚溶液(用0.2 mol/L、pH7.4磷酸緩沖液配制)5 mL于試管中,25 ℃下水浴10 min,加入酶液0.5 mL,混勻后,放置1 min后在415 nm處測(cè)定吸光度,空白用5 mL磷酸緩沖液代替鄰苯二酚溶液[22-23]。

1.3.3 酶活性的定義 以每分鐘每毫升酶液吸光度變化0.01定義為1個(gè)酶活性單位。

1.3.4 酶的殘留活性的定義 酶的殘留活性(%)=處理后酶活性/對(duì)照樣品酶的活性×100

2 結(jié)果與討論

2.1 響應(yīng)面法優(yōu)化超高壓鈍化酶結(jié)果

實(shí)驗(yàn)實(shí)施方案及結(jié)果如表2所示。

2.2 POD回歸方程模型建立及顯著性檢驗(yàn)

利用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,得到POD殘留活性(Y1)與超高壓處理壓力(X1)、超高壓處理時(shí)間(X2)、傳熱介質(zhì)溫度(X3)因素在編碼空間的二次多元回歸方程為:Y1(%)=-74.7229+1.145672X1-0.92984X2-0.27557X3+0.0128X1X2+0.004569X1X3+0.069787X2X3-0.00184X12-0.2913X22-0.0651X32

表3 POD回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance(ANOVA)of regression model of POD

注:“**”表示極顯著(p<0.0001),“*”表示顯著(0.0001

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental results for response surface analysis

由F值可見(jiàn),F3>F1>F2,3個(gè)因素對(duì)酶的殘留活性影響主次順序?yàn)闇囟?壓力>時(shí)間。F13>F12>F23,壓力和溫度的交互作用最大,對(duì)酶的活性影響最明顯。

圖1 各因素交互作用對(duì)POD酶活性 殘留率影響的響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface graphs showing the interactive effect of POD activation

從圖1a～圖1c可以看出各參數(shù)之間的相互作用及對(duì)POD殘留活性的影響。如圖所示,若曲線(xiàn)越陡峭,則表明該因素對(duì)POD殘留活性的影響越大,相應(yīng)表現(xiàn)為響應(yīng)值變化的大小。從圖可以看出超高壓溫度對(duì)POD殘留活性的影響最大,壓力次之,時(shí)間的影響最小。表3回歸分析結(jié)果也與此相吻合。當(dāng)溫度和壓力一定時(shí),隨著時(shí)間的增加,POD殘留活性呈現(xiàn)下降的趨勢(shì);當(dāng)超高壓處理時(shí)間和壓力一定時(shí),在溫度為大于22 ℃時(shí),POD的酶殘留活性呈大幅度下降趨勢(shì)。在溫度與時(shí)間不變時(shí),在壓力為300～400 MPa范圍內(nèi),POD酶出現(xiàn)被激活現(xiàn)象。低壓下酶的構(gòu)象沒(méi)有太大變化或失去活力;壓力促進(jìn)酶從附著狀態(tài)中解離出來(lái),提高了酶的活性;此外藍(lán)莓汁中尚存勻漿機(jī)未破碎細(xì)胞,在壓力作用下細(xì)胞膜被損壞或改變了膜的通透性,使細(xì)胞內(nèi)部的過(guò)氧化物酶泄露出來(lái),也會(huì)導(dǎo)致酶活性升高[23-24]。

表4 PPO回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variance(ANOVA)of regression model of PPO

注:“**”表示極顯著(p<0.0001),“*”表示顯著(0.0001

2.3 PPO回歸方程模型建立及顯著性檢驗(yàn)

利用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,得到PPO殘留活性(Y1)與超高壓處理壓力(X1)、超高壓處理時(shí)間(X2)、傳熱介質(zhì)溫度(X3)因素在編碼空間的二次多元回歸方程為:Y2(%)=19.3957+0.31162X1-6.01009X2+1.112519X3-0.00531X1X2-0.00075X1X3+0.211097X2X3-0.00031X12+0.012546X22-0.05449X32

根據(jù)回歸方程繪圖(圖2a～圖2b),它們直觀描述了X1、X2、X3及三個(gè)因素之間交互作用對(duì)PPO殘留活性的影響。由圖:壓力對(duì)PPO殘留活性的影響不明顯,隨著溫度的增加,PPO殘留活性出現(xiàn)一定幅度地減少,升溫會(huì)弱化酶蛋白的一些氫鍵、疏水鍵、離子鍵和靜電相互作用高壓增強(qiáng)這種弱化作用的效果,使酶的三維構(gòu)象受到破壞,加速多酚氧化酶的失活[15,22]。但相較溫度,時(shí)間對(duì)PPO殘留活性的影響較大。尤其是10～15 min范圍內(nèi),PPO殘留活性出現(xiàn)急劇下降。由表4中可見(jiàn),X1X3的F=1.63,故不考慮壓力和時(shí)間的交互作用對(duì)PPO殘留活性的影響。

圖2 各因素交互作用對(duì)PPO酶活性殘留率影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface graphs showing the interactive effect of PPO activation

2.4 超高壓鈍化POD和PPO的工藝優(yōu)化與驗(yàn)證

采用Design-expert 8.0.6進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì),目標(biāo)值為POD、PPO酶殘留活性及兩種酶殘留活性之和最低,結(jié)果如表5所示,每組設(shè)平行實(shí)驗(yàn)三組。

表5 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)及結(jié)果Table 5 Optimization experiment and result

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)測(cè)得,考慮儀器設(shè)備及實(shí)際操作情況,在將最優(yōu)處理?xiàng)l件設(shè)置為壓力500 MPa、時(shí)間5 min和溫度40 ℃時(shí),POD的酶殘留活性降至49.13%,與預(yù)測(cè)值相差0.2%;在處理?xiàng)l件為壓力500 MPa、時(shí)間15 min和溫度10 ℃時(shí),PPO的酶殘留活性降至4.776%,與預(yù)測(cè)值相差0.08%;綜合考慮，在處理?xiàng)l件為壓力500 MPa、處理時(shí)間15 min及溫度10 ℃處理藍(lán)莓汁時(shí),鈍化酶效果最佳，此時(shí)，POD殘留活性79.459%，PPO殘留活性7.239%。因此采用超高壓處理,優(yōu)化結(jié)果準(zhǔn)確可靠,符合生產(chǎn)實(shí)踐實(shí)際。

3 結(jié)論

采用超高壓處理技術(shù)鈍化藍(lán)莓汁中過(guò)氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO),以超高壓處理的壓力、時(shí)間和溫度為自變量,以?xún)煞N酶的殘留活性為響應(yīng)值,通過(guò)回歸分析,建立的回歸方程模型極顯著,失擬性不顯著。R2分別為0.9957和0.9917皆小于1。說(shuō)明回歸方程與實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬合性很好。

根據(jù)方差分析結(jié)果和響應(yīng)面圖可知,在超高壓處理壓力為300～500 MPa、時(shí)間為5～15 min及溫度在10～40 ℃的條件下,對(duì)POD的酶殘留活性影響主次順序?yàn)闇囟?壓力>時(shí)間。對(duì)PPO的酶殘留活性影響主次順序?yàn)闀r(shí)間>溫度>壓力。

利用Design-Expert8.0.6軟件優(yōu)化回歸方程確定鈍化過(guò)氧化物酶(POD)最佳處理?xiàng)l件為:處理壓力500 MPa、時(shí)間5 min和溫度40 ℃,處理后酶的殘留活性降至49.13%;鈍化多酚氧化酶(PPO)最佳處理?xiàng)l件為:處理壓力500 MPa、時(shí)間15 min和溫度10 ℃,處理后酶的殘留活性降至4.776%;鈍化兩種酶殘留活性的最佳處理?xiàng)l件為:處理壓力500 MPa、時(shí)間15 min和溫度10 ℃。

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Optimization of ultra-high pressure conditions for inactivation of two enzymes in blueberry juice by response surface methodology

LI Xing-he1,ZHU Jin-yan1,2,MENG Xian-jun1,*

(1.Food College of Shen Yang Agriculture University,Shenyang 110161,China;2.Food Inspection Monitoring Center of Zhuanghe,Dalian 116400,China)

Inordertogettheoptimumprocessparametersthatinactivatetheenzymesactivitiesinblueberryjuiceduringultra-highpressuretreatment,activitiesofperoxidase(POD)andpolyphenoloxidase(PPO)weretakenastheresponsevalues.AccordingtotheprincipleofCentral-Compositeexperimentdesign,themathematicalmodelofenzymeresidualactivitiesandpressure,timeandtemperaturewereestablished.Design-Expert8.0.6wasusedforresponsesurfaceanalysis.TheresultsshowedthattheoptimumconditionsforinactivatingPODwere:pressure500MPa,time5minandtemperature40 ℃,afterprocessingusingtheseconditions,theresidualactivitiesofPODwas49.13%,theoptimumconditionsforinactivatingPPOwere:pressure500MPa,time15minandtemperature10 ℃,undertheseconditions,theresidualactivitiesofPPOwas4.776%.Additionally,blueberryjuicewastreatedundertheconditionsofpressure500MPa,time15min,andtemperature10 ℃,thepassivationeffectofPODandPPOwasoptimum.

peroxidase;polyphenoloxidase;ultra-highpressure;responsesurfacemethod;blueberryjuice

2016-05-12

李星賀(1992-)，女，碩士，研究生，研究方向：小漿果深加工關(guān)鍵技術(shù)，E-mail：syaulxh@163.com。

*通訊作者:孟憲軍(1960-)，男，博士，教授，研究方向：小漿果深加工關(guān)鍵技術(shù)，E-mail：mengxjsy@126.com。

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)(201303073)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)21-0269-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.043