激素誘導(dǎo)和非生物脅迫對虎杖根中白藜蘆醇含量影響及虎杖根中白藜蘆醇閃提工藝優(yōu)化

董潔瓊,王意敏,李建霞,董施彬,寧亞萍,陳 苑,王建中

(北京林業(yè)大學(xué) 北京林業(yè)大學(xué)林業(yè)食品加工與安全北京市重點實驗室,北京 100083)

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激素誘導(dǎo)和非生物脅迫對虎杖根中白藜蘆醇含量影響及虎杖根中白藜蘆醇閃提工藝優(yōu)化

董潔瓊,王意敏,李建霞,董施彬,寧亞萍,陳 苑,王建中*

(北京林業(yè)大學(xué) 北京林業(yè)大學(xué)林業(yè)食品加工與安全北京市重點實驗室,北京 100083)

用紫外輻射和水楊酸、乙烯利、H2O2溶液對新鮮虎杖根進(jìn)行處理,探究其對新鮮虎杖根中白藜蘆醇含量的影響。采用閃式提取法從虎杖根中提取白藜蘆醇,在單因素實驗的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交實驗探究最佳提取工藝條件,用HPLC對白藜蘆醇進(jìn)行定性定量分析。結(jié)果表明:紫外輻射15 min,暗處理24 h后虎杖根中白藜蘆醇的含量達(dá)到最大值,較輻射前提高了72%。10 mmol/L水楊酸溶液浸泡24 h后虎杖根中的白藜蘆醇含量提升到原來的4倍多。5% H2O2溶液浸泡24 h后虎杖根中白藜蘆醇含量上升了34%。而乙烯利溶液浸泡則會降低白藜蘆醇的含量。閃式提取法提取虎杖根中白藜蘆醇的最佳工藝條件是:提取溫度50 ℃,提取時間60 s,乙醇濃度80%,料液比例1∶30 g/mL,在此條件下,白藜蘆醇得率為0.1877%。

虎杖根,白藜蘆醇,閃式提取,誘導(dǎo)

白藜蘆醇(Resveratrol)為含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物,是一些植物受到生物或非生物脅迫(如真菌感染、紫外照射等)時產(chǎn)生的植物抗毒素,廣泛存在于葡萄、虎杖、決明子和花生等植物中。白藜蘆醇主要有抗氧化、抗菌消炎、抗血小板凝集等作用,在心血管疾病及腫瘤治療方面也有不錯的療效[1]。但是白藜蘆醇在植物中含量相對較低,不足以滿足人們的需要,因此如何提高植物中白藜蘆醇的含量成為近年來的研究熱點。

研究表明,一些植物激素和非生物脅迫對某些植物中白藜蘆醇類植物抗毒素具有明顯的誘導(dǎo)作用[2-3]。它們對葡萄、花生等植物中白藜蘆醇類化合物的誘導(dǎo)作用已經(jīng)得到了證實,如劉蘭竹等[4]研究表明對葡萄進(jìn)行紫外輻射可以使其中的白藜蘆醇含量明顯升高,張楠等[5]的研究也表明紫外光照射和水楊酸浸泡均能誘導(dǎo)虎杖嫩葉產(chǎn)生更多的白藜蘆醇。

本實驗用白藜蘆醇含量相對較高的虎杖根作為研究對象,探討紫外輻射、水楊酸溶液浸泡、乙烯利溶液浸泡、H2O2溶液浸泡對虎杖根中白藜蘆醇及白藜蘆醇苷的含量影響,并在單因素實驗的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交實驗探究閃式提取法提取虎杖根中的白藜蘆醇的最佳工藝條件,以期為虎杖的功能成分開發(fā)利用以及白藜蘆醇的工業(yè)化提取提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮虎杖根 采挖于湖北恩施,經(jīng)北京林業(yè)大學(xué)植物學(xué)專家鑒定;白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品、白藜蘆醇苷標(biāo)準(zhǔn)品 中國藥品生物制品檢定所;色譜甲醇、色譜乙腈、雙氧水、水楊酸、無水乙醇 天津市精細(xì)化工研究所;乙烯利 美國sigma公司。

島津LC-2010A高效液相色譜儀 日本島津公司;ZK200手提式多功能粉碎機(jī) 上海廣沙工貿(mào)有限公司;FA2004電子天平 上海上平儀器有限公司;JHBE-50S閃式提取控制器 北京金鼐科技發(fā)展有限公司;TD5A臺式低速離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司;紫外燈(30W)北京華強(qiáng)電子有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 虎杖根的前處理 將采挖來的新鮮虎杖根洗凈、瀝干,用樹枝剪剪成長約1 cm的小段。

1.2.2 虎杖根中白藜蘆醇的誘導(dǎo)

1.2.2.1 紫外線輻射對白藜蘆醇的誘導(dǎo) 將處理后的樣品分成質(zhì)量均等的20份,在A4紙上鋪平,放置在紫外燈下30 cm處進(jìn)行紫外照射。分別照射5、10、15、20、25 min后,再分別暗處理12、24、36、48 h。然后40 ℃下干燥至恒重,用粉碎機(jī)粉碎后過60目篩,再放入干燥器內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 植物激素對白藜蘆醇的誘導(dǎo) 分別配置濃度為1、4、7、10、13 mmol/L的水楊酸溶液,濃度為20、30、40、50 mmol/L的乙烯利溶液,濃度為2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%的H2O2溶液各500 mL,將質(zhì)量均等的樣品分別浸沒其中,在避光條件下浸泡24 h。然后40 ℃下干燥至恒重,用粉碎機(jī)粉碎后過60目篩,再放入干燥器內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 虎杖根中白藜蘆醇提取單因素實驗 以乙醇的濃度、提取溫度、提取時間、料液比四個因素為研究對象,以白藜蘆醇的得率為指標(biāo)進(jìn)行單因素實驗[6-8]。

1.2.3.1 閃式提取溫度對得率的影響 準(zhǔn)確稱取虎杖根粉末5份,每份7.5 g,以1∶20的料液比,分別加入70%的乙醇溶液,在溫度為30、40、50、60、70 ℃的條件下,閃提60 s,比較結(jié)果從而確定最佳的提取溫度。

1.2.3.2 乙醇的濃度對得率的影響 準(zhǔn)確稱取虎杖根粉末5份,每份7.5 g,以1∶20的料液比,分別加入濃度為 50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液,在溫度50 ℃的條件下,閃提60 s,比較結(jié)果從而確定最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)。

1.2.3.3 閃式提取時間對得率的影響 準(zhǔn)確稱取虎杖粉末5份,每份7.5 g,以1∶20的料液比,分別加入70%的乙醇溶液,在溫度為50 ℃的條件下,分別閃式提取20、40、60、80、100 s,比較結(jié)果從而確定最佳提取時間。

1.2.3.4 料液比對得率的影響 準(zhǔn)確稱取虎杖根粉末5份,分別為15、7.5、5.0、3.75、3.0 g,分別以1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50的料液比加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液,在溫度50 ℃的條件下,閃提60 s,比較結(jié)果從而確定最佳料液比。

1.2.4 虎杖根中白藜蘆醇的提取正交實驗 為分析各因素之間的相互作用對虎杖根中白藜蘆醇提取得率的影響,在單因素實驗的基礎(chǔ)上進(jìn)行了L9(34)正交實驗,從而求得閃式提取的最佳條件。實驗因素及水平見表1。

表1 正交實驗因素水平設(shè)計Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.2.5 白藜蘆醇測定方法 將提取液以4000 r/min速度離心10 min,收集上清液,用0.22 μm有機(jī)過濾膜過濾后,采用液相色譜法對白藜蘆醇進(jìn)行測定[9]。根據(jù)下面公式計算白藜蘆醇得率:

式中:C:提取液中白藜蘆醇濃度(mg/mL)；V:提取液的體積(mL)；M:虎杖根粉末質(zhì)量(g)。

1.2.5.1 色譜條件 島津高效液相色譜儀(LC-2010A),LC-2010型紫外檢測器,色譜柱為SHIMADZUVP-ODS(250×4.6mm),流速為0.7mL/min,柱溫為25 ℃,流動相為水和乙腈,梯度洗脫:0～15min,乙腈/水 31/69～50/50,15～20min,乙腈/水50∶50～98∶2,20～30min,乙腈/水98∶2。檢測波長為306nm,進(jìn)樣量為10μL。

1.2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)先在放置五氧化二磷干燥劑的真空干燥箱中40 ℃干燥至恒重。然后精密稱取白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品9.2mg,白藜蘆醇苷標(biāo)準(zhǔn)品7.5mg,分別用色譜純甲醇溶解后定容于50mL容量瓶。分別吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mL于10mL容量瓶中并用色譜純甲醇定容至刻度。按上述色譜條件測定,每個濃度重復(fù)三次,記錄峰面積。再以峰面積為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1HPLC測定方法

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與色譜圖 按1.2.5.2的方法制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1,圖2所示。白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程y=10000000x-286840.476(R2=0.9998)。白藜蘆醇苷標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程y=6000000x-289002.4286(R2=0.9992)。白藜蘆醇和白藜蘆醇苷標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的色譜圖如圖3,圖4所示:在1.2.5.1的色譜條件下,白藜蘆醇苷的保留時間為6.799min,白藜蘆醇的保留時間為13.430min,標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的保留時間相一致,測定方法可行。

圖1 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Resveratrol standard curves

圖2 白藜蘆醇苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Polydatin standard curves

圖3 標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of standards

圖4 樣品HPLC 色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of extract of Polygomum cuspidatum

2.1.2 精密度實驗 將0.092 mg/mL白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液與0.075 mg/mL白藜蘆醇苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別重復(fù)進(jìn)樣5次,進(jìn)樣量為10 μL。測得白藜蘆醇的RSD為1.15%,白藜蘆醇苷的RSD為1.31%,表明儀器精密度良好。

2.1.3 回收率實驗 精密稱取同一份虎杖根提取上清液5份,每份1 mL。分別精密加入一定量白藜蘆醇和白藜蘆醇苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液,用液相色譜進(jìn)行檢測并計算回收率。算得白藜蘆醇的回收率為98.32%,RSD為1.21%,白藜蘆醇苷的回收率為99.03%,RSD為0.98%。

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 閃提溫度對得率的影響 不同的提取溫度對虎杖根中白藜蘆醇的得率影響如圖5所示。隨著提取溫度的不斷上升白藜蘆醇的得率不斷上升,當(dāng)溫度為50 ℃時得率達(dá)到最高。繼續(xù)升高溫度,提取得率則呈下降趨勢,可能是溫度過高導(dǎo)致了一部分白藜蘆醇發(fā)生降解從而使得率降低。

圖5 閃提溫度對白藜蘆醇得率的影響Fig.5 Effect of flash-extraction temperature on the extraction rate of resveratrol

2.2.2 乙醇的濃度對得率的影響 不同的乙醇濃度對白藜蘆醇得率的影響如圖6所示。隨著乙醇濃度的提高,白藜蘆醇的提取得率逐漸上升,在乙醇濃度為70%時得率最高,之后略有降低。這可能是因為乙醇濃度不同,溶液極性也不同,而70%的乙醇極性與白藜蘆醇最相似,所以得率最高。

圖6 乙醇濃度對白藜蘆醇得率的影響Fig.6 Effect of ethanol concentration on extraction rate of resveratrol

2.2.3 閃式提取時間對得率的影響 閃式提取可以快速有效的破壞細(xì)胞,從而使細(xì)胞中的有效成分充分融入提取液,不同的閃式提取時間對白藜蘆醇提取得率的影響如圖7所示。當(dāng)提取時間為80 s時白藜蘆醇的得率最高,推測這時細(xì)胞已破碎較為充分。當(dāng)提取時間再升高時由于刀頭持續(xù)高速旋轉(zhuǎn)會使提取液溫度升高較快,反而降低了白藜蘆醇得率。

圖7 閃提時間對白藜蘆醇得率的影響Fig.7 Effect of extraction time on extraction rate of resveratrol

圖8 料液比例對白藜蘆醇得率的影響Fig.8 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of resveratrol

2.2.4 料液比對得率的影響 料液比對白藜蘆醇得率的影響如圖8所示。隨著料液比的增大,白藜蘆醇的提取得率不斷上升,當(dāng)料液比例達(dá)到1∶40時白藜蘆醇的得率趨于平穩(wěn)。從節(jié)省提取溶劑的角度,最佳料液比選擇1∶40。

2.3 正交實驗結(jié)果

由表2,表3分析可知,四個因素對白藜蘆醇得率影響的主次為:提取時間(A)>提取溫度(B)>料液比例(D)>乙醇濃度(C),提取時間和提取溫度對白藜蘆醇的得率影響顯著,料液比例和乙醇濃度對得率的影響不顯著。這可能是由閃式提取的特點決定的,閃式提取主要通過高壓攪拌和超強(qiáng)振動使原料組織破碎從而使其內(nèi)部有效成分溶出,所以提取時間關(guān)系到刀頭對組織磨碎的程度,所以其對提取得率的影響較大。由于閃式提取器的刀頭高速旋轉(zhuǎn),在旋轉(zhuǎn)過程中會產(chǎn)生熱量,使提取液溫度上升,所以開始的提取溫度對白藜蘆醇得率的影響也較大。綜合正交設(shè)計結(jié)果,極差分析和方差分析得出最佳提取條件為A1B2C3D1,即提取時間60 s,提取溫度50 ℃,乙醇濃度80%,料液比1∶30。用最佳條件進(jìn)行驗證性實驗得到白藜蘆醇的得率為0.1877%。

表2 正交實驗結(jié)果Table 2 The results of orthogonal experiment

表3 正交實驗方差分析表Table 3 Orthogonal array design and anova results

2.4 激素誘導(dǎo)和非生物脅迫對虎杖根中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷含量的影響

2.4.1 紫外線輻射對虎杖根中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷含量的影響 對表4數(shù)據(jù)進(jìn)行分析可知:對虎杖根進(jìn)行紫外輻射,可對其中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量產(chǎn)生影響。當(dāng)輻照劑量達(dá)到一定的值,即輻照15 min時,白藜蘆醇含量提升到最大值,相比輻照前提升了72%。而白藜蘆醇苷的含量也相對提高了近20%。然后隨著輻照劑量的增大,兩種物質(zhì)的含量呈現(xiàn)下降的趨勢。由表中數(shù)據(jù)可發(fā)現(xiàn),輻照后的暗處理也可使虎杖根中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量有所增加。隨著暗處理時間的延長,白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量同樣呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,在暗處理24 h左右,二者含量達(dá)到最大值。

表4 紫外輻射對虎杖根中白藜蘆醇/白藜蘆醇苷含量的影響(%)Table 4 Effect of UV-C on resveratrol/Polydatin content in polygonum cuspidatum roots

2.4.2 H2O2對虎杖中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷含量的影響 由圖9可知,用不同濃度的H2O2對新鮮虎杖根進(jìn)行浸泡,會對其中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量產(chǎn)生影響。隨著H2O2的濃度不斷增大,虎杖根中的白藜蘆醇的含量先上升后下降,而白藜蘆醇苷的含量則相應(yīng)的先下降后上升。推測是H2O2促使虎杖中的白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇,而H2O2的最佳轉(zhuǎn)化濃度為5%,即在此濃度下白藜蘆醇含量最高,較浸泡前提升了34%。

圖9 不同濃度的H2O2對白藜蘆醇 和白藜蘆醇苷含量的影響Fig.9 Accumulation of resveratrol and polydatin in polygonum cuspidatum roots responding to H2O2

2.4.3 乙烯利對虎杖中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷含量的影響 如圖10可知,用不同濃度的乙烯利對新鮮虎杖根進(jìn)行浸泡,會對其中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量產(chǎn)生影響。隨著乙烯利濃度的升高,虎杖根中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量都呈現(xiàn)明顯的下降趨勢。

圖10 不同濃度的乙烯利對白藜蘆醇 和白藜蘆醇苷含量的影響Fig.10 Accumulation of resveratrol and polygonum in polygonum cuspidatum roots responding to ethephon

2.4.4 水楊酸對虎杖根中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷含量的影響 由圖11可知,不同濃度的水楊酸亦會對虎杖根中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量產(chǎn)生影響。隨著水楊酸濃度的上升,白藜蘆醇的含量先上升然后趨于平穩(wěn),而白藜蘆醇苷的含量則是先下降然后趨于平穩(wěn)。推測水楊酸能促使虎杖根中的白藜蘆醇苷向白藜蘆醇轉(zhuǎn)化,從而使白藜蘆醇含量升高。

圖11 不同濃度的水楊酸對白藜蘆醇 和白藜蘆醇苷含量的影響Fig.11 Accumulation of resveratrol and polygonum in polygonum cuspidatum roots responding to salicylic acid

為進(jìn)一步探究水楊酸浸泡虎杖的最佳條件,另取一份新鮮虎杖根樣品,以10 mmol/L的水楊酸浸泡,在3、6、12、24、36 h分別取樣進(jìn)行檢測,結(jié)果如圖12,發(fā)現(xiàn)隨著浸泡時間的延長,虎杖根中的白藜蘆醇含量先減小后增大,而白藜蘆醇苷的含量也發(fā)生了與之相反的變化。所以為提高虎杖根中白藜蘆醇的含量,用水楊酸浸泡的最佳條件為10 mmol/L的水楊酸浸泡24 h。白藜蘆醇含量與浸泡前相比提升4倍多。

圖12 10 mmol/L水楊酸不同浸泡時間 對白藜蘆醇和白藜蘆醇苷含量的影響Fig.12 Accumulation of resveratrol and polydatin in polygonum cuspidatum roots responding to different soaking time of 10 mmol/L salicylic acid

3 結(jié)論與討論

采用閃式提取法對虎杖根中的白藜蘆醇的提取工藝進(jìn)行探究,考察提取溫度,提取時間,乙醇濃度,料液比例對提取得率的影響,并在單因素的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交實驗,優(yōu)化得到的最佳閃式提取工藝為提取時間60 s,提取溫度50 ℃,乙醇濃度80%,料液比例1∶30,白藜蘆醇的提取得率為0.1877%。該方法快捷實用,且提取得率高,可用于白藜蘆醇的提取。

已有的研究結(jié)果表明紫外輻射能通過某些途徑提高植物體中一些酶的活性。推測這可能是紫外輻射后虎杖根中白藜蘆醇含量升高的原因。白藜蘆醇是一種抗毒素,當(dāng)在植物體內(nèi)積累到一定量時會自發(fā)的轉(zhuǎn)化成一種毒性較小的糖苷形式,即白藜蘆醇苷[11-13]。所以經(jīng)紫外輻射后白藜蘆醇苷的含量也有所上升。又有研究表明:當(dāng)植物體遭受病菌侵染或者外部適宜生長環(huán)境遭到破壞時,植物體內(nèi)的糖苷會被特殊的糖苷酶水解并釋放毒性較強(qiáng)的苷元化合物。所以,在水楊酸或H2O2的處理下,虎杖根中的白藜蘆醇含量升高而白藜蘆醇苷含量下降[14-16]

本研究中,紫外輻射和水楊酸浸泡等方法,均能明顯提高虎杖根中白藜蘆醇的含量,與之前所使用的酶水解法和微生物發(fā)酵法相比,安全性更高,成本更低,且操作也更加方便?？蔀橐院蠡⒄鹊纳罴庸ぜ鞍邹继J醇的工業(yè)化提取提供參考。

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Effect of phytohormones induced and abiotic stresses on resveratrol content and optimization of resveratrol flash-extraction in polygonum cuspidatum roots

DONG Jie-qiong，WANG Yi-min，LI Jian-xia，DONG Shi-bin，NING Ya-ping，CHEN Yuan，WANG Jian-zhong*

(Beijing Key Laboratory of Forest Food Processing and Safety,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China)

TheeffectsofUVlights,salicylicacid,ethephonandH2O2onresveratrolinductioninfreshpolygonumcuspidatumrootswerestudied.Theeffectsofextractiontemperature,extractiontime,ethanolconcentrationandsolid-liquidratioonresveratrolcontentwereinvestigated.Basedonthesinglefactorexperiments,theoptimizationofresveratrolflash-extractionprocesswascarriedbytheorthogonaltest.AndtheresveratrolcontentwasanalyzedbyHPLC.Theresultsshowedthattheresveratrolcontentinpolygonumcuspidatumcouldreachitsmaximum(improve72%)afterUVradiation15minanddarktreatment24h.Itscontentincreasedbymorethanfourtimesaftersoakinginthe10mmol/Lsalicylicacidfor24handitincreasedby34%aftersoakingin5%H2O2for24h.Butethephondidnotwork.Thebestflash-extractionconditionswereasfollows:extractiontemperature50 ℃,extractiontime60s,ethanolconcentration80%andsolid-liquidratio1∶30g/mL.Undertheseconditions,theextractionrateofresveratrolwas0.1877%.

polygonumcuspidatumroots;resveratrol;flash-extraction;induction

2016-05-12

董潔瓊(1990-),女,碩士研究生,研究方向:天然產(chǎn)物研究,E-mail:dongjq100@163.com。

*通訊作者:王建中(1952-),男,碩士,教授,研究方向:林產(chǎn)品加工利用，E-mail:dongjq100@163.com。

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項重大項目(201204401)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)21-0210-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.032