米曲霉β-半乳糖苷酶系的克隆表達(dá)與酶學(xué)特性分析

董自星,賈 超,王 君,路福平,王正祥,,*

(1.天津科技大學(xué)化工與材料學(xué)院生物化工系,天津 300457;2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院與工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300457)

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米曲霉β-半乳糖苷酶系的克隆表達(dá)與酶學(xué)特性分析

董自星1,賈 超2,王 君2,路福平2,王正祥1,2,*

(1.天津科技大學(xué)化工與材料學(xué)院生物化工系,天津 300457;2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院與工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300457)

本研究通過對米曲霉的3個(gè)β-半乳糖苷酶基因O158、AO及O76進(jìn)行了克隆與表達(dá),成功構(gòu)建了相應(yīng)的重組菌GS115(pPIC-O158)、GS115(pPIC-AO)和GS115(pPIC-O76),并獲得相應(yīng)的重組酶。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),重組酶O158、AO和O76的最適作用pH分別為4.0、5.5和7.0;最適作用溫度均為50 ℃;在pH5.0～7.5之間或30～40 ℃均較為穩(wěn)定。Mn2+對重組酶O158、AO和O76有明顯的激活作用,而Fe2+、Cu2+和Zn2+則強(qiáng)烈抑制它們的酶活。O158、AO和O76只對乳糖具有水解與轉(zhuǎn)苷活性,而且AO對乳糖的親和力和催化效率均高于O158和O76。此外,在所試米曲霉菌種中不存在參照基因組中的β-半乳糖苷酶基因O42。本文系統(tǒng)地對米曲霉的3個(gè)β-半乳糖苷酶進(jìn)行了異源表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)的研究,為其大規(guī)模生產(chǎn)及工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

米曲霉,β-半乳糖苷酶,分子克隆,酶學(xué)性質(zhì)

Cloning,expression and biochemical characterization ofβ-galactosidases fromAspergillusoryzae

DONG Zi-xing1,JIA Chao2,WANG Jun2,LU Fu-ping2,WANG Zheng-xiang1,2,*

(1.Department of Biochemical Engineering,College of Chemical Engineering and Materials Science,Tianjin University of Science & Technology,Tianjin 300457,China;2.Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology,Ministry of Education,

β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase,EC 3.2.1.23),是能水解多糖、寡糖或次級代謝產(chǎn)物中的β-半乳糖苷鍵的一類酶,可將乳制品中的乳糖水解為半乳糖和葡萄糖,用于治療乳糖不耐受癥。某些β-半乳糖苷酶還能催化轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)[1],可生產(chǎn)半乳糖化的產(chǎn)品(galactosylated products)[2]。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

*注:下劃線部分為限制性酶切位點(diǎn)。此外,β-半乳糖苷酶在基因工程、醫(yī)藥、分析檢測和環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用[2-3]。

β-半乳糖苷酶的來源非常廣泛,但目前工業(yè)上常用的β-半乳糖苷酶主要由克魯維酵母、曲霉和青霉等發(fā)酵制得[3]。克魯維酵母可以產(chǎn)生大量的β-半乳糖苷酶,但它們均為中性的胞內(nèi)酶,較難應(yīng)用于酸性的工業(yè)環(huán)境;黑曲霉和多色青霉等所產(chǎn)的β-半乳糖苷酶為嗜酸胞外酶,但其產(chǎn)量遠(yuǎn)低于酵母菌,限制了其在工業(yè)上的應(yīng)用[4]。研究表明,米曲霉具有合成與分泌β-半乳糖苷酶的酶活特征,且其產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶具有較高的轉(zhuǎn)糖基活性[5]。米曲霉也成為了工業(yè)上β-半乳糖苷酶的主要生產(chǎn)菌株[6]。針對米曲霉來源的β-半乳糖苷酶,目前的研究主要集中在異源表達(dá)[7]、酶學(xué)特征解析[7-8]、轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)[9]和固定化[10]等方面。

研究顯示,單一生物體往往具有多個(gè)β-半乳糖苷酶,而且這些酶之間存在性質(zhì)與功能的差異[11]。本課題組之前對黑曲霉β-半乳糖苷酶家族的研究也揭示了這一特征,但米曲霉菌種中是否也具有與黑曲霉相似的β-半乳糖苷酶家族尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究將米曲霉來源的4個(gè)β-半乳糖苷酶進(jìn)行了克隆表達(dá),并系統(tǒng)研究了其生化特征的異同點(diǎn),以期為實(shí)現(xiàn)其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株P(guān)ichia pastoris GS115以及質(zhì)粒pPIC9K Invitrogen公司。大腸桿菌(EscherichiacoliJM109)和米曲霉(AspergillusoryzaeCICIM F1005F) 本實(shí)驗(yàn)保藏。大腸桿菌用LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng);米曲霉采用CD培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng);畢赤酵母及其重組菌的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法按照Invitrogen的畢赤酵母操作手冊進(jìn)行。

LA Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶等 寶生物工程(大連)有限公司;T4DNA連接酶、質(zhì)粒小量提取試劑盒和小量DNA產(chǎn)物純化回收試劑盒等 Thermo公司提供;RNA抽提試劑盒(High Pure RNA Isolation Kit)以及cDNA 合成試劑盒(Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit) Roche公司產(chǎn)品;胰蛋白胨(Tryptone)和酵母抽提物(Yeast Extract) 英國OXOID公司;G418、生物素(D-Biotin)和無氨基酵母氮源(YNB) 北京索萊寶生物科技有限公司;鄰-硝基酚-D-半乳糖吡喃糖苷(ONPG) 上海生物工程有限公司,其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

PTC-200型PCR儀 MJ Research Inc.;凝膠成像儀 美國SYNGENE公司;Gene Pulser Xcell電轉(zhuǎn)儀 美國BIO-RAD公司;恒溫水浴鍋 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;SBA 40-C生物傳感分析儀 山東省科學(xué)院生物研究所;Agilent HP 1100高效液相色譜儀 美國惠普公司。

1.2 米曲霉β-半乳糖苷酶系的克隆與表達(dá)

1.2.1 畢赤酵母工程菌的構(gòu)建 米曲霉總RNA的提取與cDNA的制備按照試劑盒說明書進(jìn)行?；驍U(kuò)增過程所采用的4對寡核苷酸引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,其核苷酸序列匯總于表1。PCR產(chǎn)物純化、質(zhì)粒、酶切、連接以及電轉(zhuǎn)化等采用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行[12]。

1.2.2 重組酶的誘導(dǎo)表達(dá)與制備 將構(gòu)建成功的畢赤酵母重組菌GS115(pPIC-O158)、GS115(pPIC-AO)和GS115(pPIC-O76)在YPD平板上進(jìn)行純化,挑取單菌落接種于YPD液體培養(yǎng)基中,30 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD600=2～6,約18～20 h)。按1%接種量接入25 mL BMGY培養(yǎng)基中,30 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD600=2～6,約16～18 h)。室溫下5000 r/min離心5 min回收酵母細(xì)胞,棄上清,將細(xì)胞重懸于50 mL BMMY培養(yǎng)基中至OD600=1.0,30 ℃繼續(xù)培養(yǎng)并開始誘導(dǎo)。每隔24 h補(bǔ)加0.5%的甲醇以維持誘導(dǎo),同時(shí)取樣進(jìn)行酶活測定。發(fā)酵結(jié)束后,12000 r/min離心10 min收集發(fā)酵上清液,即為粗酶液,保存到新的離心管中,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 重組β-半乳糖苷酶的酶活測定與酶學(xué)特征分析

1.3.1β-半乳糖苷酶的酶活測定 將發(fā)酵上清用0.05 mol/L pH5.0醋酸緩沖液稀釋,稱取0.2 g乳糖加入1 mL酶液,即反應(yīng)體系中含有20%的乳糖,在50 ℃水浴中反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后,在沸水中滅活20 min,再通過生物傳感儀檢測葡萄糖的含量。β-半乳糖苷酶的活性定義為:在pH5.0、50 ℃下1 h分解乳糖生成1 mmol/L葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。

1.3.2 最適pH和pH穩(wěn)定性的測定 將酶用不同pH的緩沖液稀釋,以酶活最高者為100%,以相對酶活力對pH作圖;將酶用不同pH的緩沖液稀釋,25 ℃保溫1 h后,測定各自的酶活力,以最適pH下測得的酶活力為100%,以殘余酶活力對pH作圖,繪制pH穩(wěn)定性曲線。所用緩沖液為:0.05 mol/L醋酸鈉緩沖液(pH3.0～6.5)和0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH7.0～9.0)。

1.3.3 最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性的測定 將反應(yīng)體系分別置于30～80 ℃水浴進(jìn)行酶促反應(yīng)以測定其酶活力,以酶活最高者為100%,以相對酶活對溫度作圖;分別將酶液置于30～80 ℃水浴1 h后,立即置于冰上,測定殘余酶活力,以未水浴處理過的酶活為100%,以殘余酶活力對溫度作圖。

表2 米曲霉β-半乳糖苷酶基本特征Table 2 The properties of β-galactosidases from A. oryzae

1.3.4 不同金屬離子和化學(xué)試劑對酶活的影響 在β-半乳糖苷酶與其底物進(jìn)行反應(yīng)的體系中,加入終濃度為10 mmol/L的不同的金屬離子或化學(xué)試劑,分別測定加入不同金屬離子或化學(xué)試劑后各反應(yīng)體系中β-半乳糖苷酶的相對酶活,以不加金屬離子和化學(xué)試劑的反應(yīng)體系的酶活定義為100%。

1.3.5β-半乳糖苷酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測定 在0.05 mol/L pH5.0緩沖體系中,加入不同濃度的乳糖底物。反應(yīng)1 h后,用生物傳感儀測定葡萄糖含量,計(jì)算出不同底物濃度的反應(yīng)速率。利用軟件Origin 8.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合得到米氏方程,并計(jì)算出酶反應(yīng)的Km、Vmax、kcat和kcat/Km。

1.4 底物特異性與反應(yīng)產(chǎn)物分析

在1 mL酶促反應(yīng)體系中,加入終濃度為20%(w/v)的不同的底物,并加入經(jīng)適當(dāng)稀釋的酶液。在50 ℃水浴鍋中反應(yīng)12 h,將反應(yīng)液經(jīng)過適當(dāng)稀釋,進(jìn)行高壓液相色譜分析。色譜條件:流動(dòng)相為乙腈∶水=65∶35(體積比)。色譜柱:TSK-GEL G3000PWXL-CP(7.8 mm×300 mm,7 μm)。柱溫25 ℃,流速:1.0 mL/min。檢測器:蒸發(fā)光散射檢測器,其漂移管的溫度為90 ℃,氣體流速:2.2 mL/min。進(jìn)樣量:10 μL。低聚半乳糖標(biāo)準(zhǔn)品由本實(shí)驗(yàn)室制備,使用前進(jìn)行適當(dāng)稀釋。

1.5 米曲霉基因組中β-半乳糖苷酶系的生物信息分析與比對

從NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲取不同來源的β-半乳糖苷酶的氨基酸序列。利用Clustal X2軟件對這些序列進(jìn)行多序列比對,并通過軟件MEGA 4.0以鄰近法(Neighbour-joining)構(gòu)建進(jìn)化樹,分析它們親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近[13]。通過軟件BioEdit對米曲霉來源的β-半乳糖苷酶的氨基酸序列進(jìn)行比對和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 米曲霉β-半乳糖苷酶的基因克隆與序列分析

依據(jù)A.oryzaeRIB40的基因組序列信息(EMBL BA000049～BA000056),采用BLAST等分析方法,獲得了4個(gè)可能編碼β-半乳糖苷酶的基因,分別重新命名為O158、AO、O76和O42(表2，其中在參照基因組中的β-半乳糖苷酶基因O42在所試米曲霉菌種中不存在)。進(jìn)一步制備米曲霉cDNA,以此為模板PCR擴(kuò)增β-半乳糖苷酶并成功克隆入pPIC9K,獲得重組質(zhì)粒pPIC-O158、pPIC-AO和pPIC-O76。通過測序結(jié)果可知,O158的測序結(jié)果比原始序列多出75個(gè)核苷酸殘基(即25個(gè)氨基酸),且另有3個(gè)氨基酸不同;而AO和O76的測序結(jié)果與原始序列保持一致(表2)。

利用MEGA 4.0將不同來源的β-半乳糖苷酶的氨基酸序列進(jìn)行比對和進(jìn)化樹的構(gòu)建,結(jié)果匯總于圖1。此進(jìn)化樹反映了不同來源的β-半乳糖苷酶之間的遺傳距離。其中,3個(gè)米曲霉來源的β-半乳糖苷酶分屬3個(gè)不同組合,相對而言O(shè)158與AO的相似度高一些。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),O158、AO和O76分別與來源于A.niger、A.candidus以及A.flavusAF70的β-半乳糖苷酶具有較高相似度。

以AoAO的三維結(jié)構(gòu)[14]為參照,通過氨基酸序列比對對AoO158和AoO76的保守區(qū)進(jìn)行分析和比較,結(jié)果如圖2所示。AoO158與AoAO具有較高的序列相似度,且具有相似的結(jié)構(gòu)域(Domain 1到6)。其中,第一個(gè)結(jié)構(gòu)域(Asp40～Thr397)為催化功能區(qū),具有(α/β)8桶狀結(jié)構(gòu)。它們的保守區(qū)組成為:作為酸/堿催化劑的Glu200和作為親核劑的Glu298。而AoO76比AoAO和AoO158少了一個(gè)結(jié)構(gòu)域(Domain 6),且其與AoAO中的Glu200和Glu298對應(yīng)的氨基酸殘基分別為Pro196和Ala307。

2.2β-半乳糖苷酶的重組表達(dá)與重組酶的酶學(xué)特征

圖1 進(jìn)化樹描述不同來源的β-半乳糖苷酶的遺傳距離Fig.1 Phylogenetic tree describing the genetic distances among β-galactosidases from different microorganisms注：米曲霉來源的β-半乳糖苷酶用黑體表示;采用Jones-Tay-Thornton(JTT)距離矩陣模型計(jì)算遺傳距離。

圖2 不同來源的β-半乳糖苷酶的氨基酸序列比對Fig.2 Multiple sequence alignment of β-galactosidases from different microorganisms注：保守的氨基酸、保守的替換和半保守的替換分別用星號、分號和點(diǎn)表示;圓矩形表示的是前蛋白序列;AoAO中的1～6個(gè)結(jié)構(gòu)域依次用矩形、下劃線、淺灰色、灰色、深灰色和黑色表示;AoO158、AoAO、AoO76、AnBglA和AfBglA分別為A. oryzae O158、A. oryzae AO、A. oryzae O76、A. niger BglA以及A. flavus AF70 BglA。

將上述構(gòu)建獲得的重組質(zhì)粒pPIC-O158、pPIC-AO和pPIC-O76分別線性化后,轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,獲得重組菌GS115(pPIC-O158)、GS115(pPIC-AO)和GS115(pPIC-O76)。采用搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn),在甲醇的誘導(dǎo)下進(jìn)行酶液制備。發(fā)酵持續(xù)120 h,離心收集酶液并經(jīng)凍干獲得重組β-半乳糖苷酶O158、AO和O76。通過酶活測定發(fā)現(xiàn),這三個(gè)重酶的酶活分別為0.35,0.30 U/g和0.28 U/g。同步以pPIC9K質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115獲得含有空白質(zhì)粒的重組菌,其發(fā)酵液檢測不到β-半乳糖苷酶酶活。

2.2.1 重組酶的最適作用pH及pH穩(wěn)定性 在不同pH反應(yīng)條件下分析重組酶O158、AO和O76的酶活力,結(jié)果匯總于圖3A。O158、AO和O76的最適作用pH分別為4.0、5.5和7.0。O158具有相對寬泛的pH作用范圍(pH3.5～7.0),在該pH范圍內(nèi)相對酶活在80%以上。而AO在pH低于5.5或高于6.0時(shí),酶活會(huì)急劇下降;O76在pH低于6.5或高于7.5時(shí),酶活也會(huì)急劇下降。因此,AO和O76的酶活力較O158更容易受pH的影響。

pH穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖3B所示。在25 ℃、不同pH的緩沖液中放置1 h后,O158、AO和O76殘留的酶活在80%以上的pH范圍分別為4.0～8.5、3.5～7.5和5.5～8.0。與AO和O76相比,O158在較寬泛的pH范圍內(nèi)相對酶活穩(wěn)定。

圖3 β-半乳糖苷酶的最適作用pH及pH穩(wěn)定性Fig.3 pH optima and pH stability of β-galactosidases注：A：最適作用pH;B：pH穩(wěn)定性。

2.2.2 重組β-半乳糖苷酶的最適作用溫度及熱穩(wěn)定性 在不同溫度下測定β-半乳糖苷酶的酶活,結(jié)果匯總于圖4A。米曲霉來源的3種β-半乳糖苷酶O158、AO和O76的最適作用溫度均為50 ℃。當(dāng)溫度低于50 ℃或者高于50 ℃時(shí),酶活力會(huì)顯著下降,溫度變化對三者酶活力影響都較大。

重組酶的熱穩(wěn)定性結(jié)果匯總于圖4B。在不同的溫度下孵育1 h后,重組酶O158、AO和O76殘留的酶活隨著溫度的上升顯著降低。

表4 重組β-半乳糖苷酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 4 Kinetic parameters of recombinant β-galactosidases

這三種酶殘留的酶活在80%以上的溫度范圍分別為30～50、30～40、30～40 ℃;殘留酶活小于40%的溫度范圍分別為60 ℃以上、70 ℃以上和70 ℃以上。此外,在30～50 ℃內(nèi),O158的穩(wěn)定性優(yōu)于AO和O76;而在60～80 ℃時(shí),O158的穩(wěn)定性低于AO和O76。

圖4 β-半乳糖苷酶的最適作用溫度及pH穩(wěn)定性Fig.4 The optimal temperature and stability of β-galactosidases注：A：最適作用溫度;B：熱穩(wěn)定性。

2.2.3 金屬離子和化學(xué)試劑對重組β-半乳糖苷酶活性的影響 在酶促反應(yīng)中加入不同的金屬離子或化學(xué)試劑(終濃度10 mmol/L),研究其對O158、AO和O76酶活的影響,結(jié)果匯總于表3。只有Mn2+對三者的活性有明顯促進(jìn)作用。Fe2+、Cu2+對三者的活性有明顯抑制作用,EDTA和Zn2+對三者的活性有輕微的抑制作用。Ca2+、K+對O158和O76有微弱的抑制作用,而對O76的酶活沒有影響。而Co2+、Na+對O158及O76沒有影響,但是對O76有輕微的抑制作用。此外,Mg2+對三者的活性均無影響。

表3 金屬離子及化學(xué)試劑 對重組β-半乳糖苷酶活性的影響Table 3 Effect of metal ions and chemicals on enzymatic activity of recombinant β-galactosidases

2.2.4 米曲霉β-半乳糖苷酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)與比較 以不同濃度的乳糖為底物,其它條件保持不變,測定酶的反應(yīng)速度。采用雙倒數(shù)作圖法(Lineweaver-Burk法),分別繪制O158、AO和O76水解乳糖的動(dòng)力學(xué)曲線,求出其動(dòng)力學(xué)參數(shù)(表4)。結(jié)果表明,O158、AO和O76的Km分別為5.48、5.27和6.21 mmol/L;Vmax分別為0.03、0.05和0.02 mmol/(L·s);kcat分別為16.5、27.5和6.2 1/s;kcat/Km分別為3.0、5.2和1.0 L/(mmol·s)。其中,AO的Km最小,Vmax、kcat以及kcat/Km均最大,說明AO對底物乳糖的親和力大于O158和O76,且具有更高的催化效率。

2.3 米曲霉β-半乳糖苷酶的底物特異性與催化特征分析

分別以乳糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、蔗糖、麥芽糖、戊聚糖、低聚木糖及果膠為底物,分別在O158、AO和O76的最適反應(yīng)pH(分別為4.0、5.5和7.0)和最適作用溫度(均為55 ℃)下反應(yīng)12 h后取樣,采用高效液相色譜儀分析反應(yīng)產(chǎn)物,結(jié)果匯總于表5。O158、AO和O76均對乳糖表現(xiàn)出水解與轉(zhuǎn)苷活性,對其它測試底物則未表現(xiàn)出任何活性。其中,O158、AO和O76對乳糖的水解率分別為27.4%、19.0%和51.1%;對乳糖的轉(zhuǎn)苷率分別為3.2%、3.1%和2.3%(圖5)。

表5 米曲霉β-半乳糖苷酶的底物作用特征Table 5 Substrate specificity of A. oryzae β-galactosidases

注:+:具有活性,-:沒有活性,/:沒有測定。

圖5 重組β-半乳糖苷酶作用于乳糖的產(chǎn)物分析Fig.5 HPLC profile of lactose catalyzed by recombinant β-galactosidases

3 結(jié)論與討論

米曲霉乳糖酶常被用于處理牛奶、酸奶和生產(chǎn)低聚半乳糖,是商業(yè)化乳糖酶制劑的主要來源之一[14]。但是,國內(nèi)外還沒有系統(tǒng)研究米曲霉β-半乳糖苷酶酶系的酶學(xué)特征的報(bào)道。本研究對米曲霉的4個(gè)可能的β-半乳糖苷酶基因進(jìn)行了分子克隆與表達(dá)、酶學(xué)性質(zhì)等方面的研究,首次解析了它們之間的異同點(diǎn)。

米曲霉基因組中含有4個(gè)β-半乳糖苷酶開放閱讀框,其中3個(gè)基因O158、AO和O76已經(jīng)被成功地克隆和表達(dá)。通過測序結(jié)果分析,O158的測序結(jié)果有差異,AO與O76的測序結(jié)果一致(表2)。然而,以米曲霉CICIM F1005F的cDNA和基因組DNA為模板均沒有將β-半乳糖苷酶基因O42擴(kuò)增成功。氨基酸序列比對的結(jié)果顯示,AO和O158的活性中心均是Glu200(酸/堿催化劑)和Glu298(親和劑)(圖2)。它們的催化反應(yīng)遵循兩步反應(yīng)的雙替換機(jī)制(two-step double-displacement mechanism),包括糖基-酶復(fù)合物過渡態(tài)的形成和水解,每步反應(yīng)均通過酸堿催化完成[15]。而O76 與AO中的Glu200和Glu298對應(yīng)的氨基酸殘基分別為Pro196和Ala307,且比它們少了一個(gè)結(jié)構(gòu)域。進(jìn)一步通過BLAST分析發(fā)現(xiàn),與O76氨基酸序列相似度較高(≧40%)的β-半乳糖苷酶都沒有相關(guān)研究報(bào)道,它可能是一種新的真菌β-半乳糖苷酶。

米曲霉來源的β-半乳糖苷酶最適作用pH較低,一般在2.5和5.5之間;最適作用溫度較高,通常為45～60 ℃[4]。本研究中的重組β-半乳糖苷酶O158、AO和O76的最適作用溫度均為50 ℃,在30～40 ℃有較高的熱穩(wěn)定性。O158和AO的最適作用pH分別為4.0、5.5,pH穩(wěn)定范圍分別為4.0～8.5和3.5～7.5。而O76最適pH為7.0,偏中性,與酵母和細(xì)菌β-半乳糖苷酶的最適反應(yīng)pH接近;pH穩(wěn)定范圍是5.0～8.0。這三種重組酶的最適作用pH以及pH穩(wěn)定性差別較大,綜合了真菌和細(xì)菌類β-半乳糖苷酶的優(yōu)勢。其中,AO的最適作用pH略高于已報(bào)道的最適反應(yīng)pH(5.2),而最適作用溫度則低于文獻(xiàn)報(bào)道(60 ℃)[6],這可能是由于所用的底物不同造成的。除了O158,AO和O76的最適作用pH均高于A.oryzaeRT102以及A.oryzaeh26-10-7β-半乳糖苷酶的最適作用pH(分別為4.8和4.75)[16-17];這三種重組酶的最適作用溫度高于A. oryzae RT102β-半乳糖苷酶的最適作用溫度(46 ℃)[16],卻低于A.oryzaeh26-10-7β-半乳糖苷酶的最適作用溫度(60 ℃)[17]。

本研究中的重組β-半乳糖苷酶O158、AO和O76的Km分別為5.48、5.27、6.21 mmol/L,遠(yuǎn)高于A.oryzaeh26-10-7以及A.oryzaeβ-半乳糖苷酶對乳糖的Km值(分別為69.36 mmol/L[17]和50.0 mmol/L[18]),對天然底物乳糖表現(xiàn)出更高的底物親和力。但是,這三者的Km均高于MushroomsA.oryzae(Sigma)β-半乳糖苷酶的Km(1.6 mmol/L);它們的Vmax均低于該β-半乳糖苷酶的Vmax(62.8 μmol/(min·mg protein))[19]。

β-半乳糖苷酶一般具有水解和轉(zhuǎn)苷兩種活性[2]。近年來,利用β-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)苷活性生產(chǎn)具有特定生理功能的低聚糖已成為新的研究內(nèi)容[20-21]。與其它研究報(bào)道相似,本研究所克隆與表達(dá)的3種β-半乳糖苷酶皆對其天然底物乳糖表現(xiàn)出水解和轉(zhuǎn)苷活性,對其它天然底物均沒有水解和轉(zhuǎn)苷活性。此外,雖然戊聚糖、低聚木糖及果膠中含有半乳糖苷鍵,但是O158、AO和O76對它們均不起作用(表3)。

本文通過現(xiàn)代生物信息學(xué)與分子克隆等技術(shù)對米曲霉來源的4個(gè)β-半乳糖苷酶在畢赤酵母中進(jìn)行了克隆和表達(dá),并系統(tǒng)地解析了其酶學(xué)性質(zhì)。其中重組酶O158和AO的最適pH偏酸性,且對乳糖有較好的親和力和催化效率,適用于干酪和酸乳清等低pH的加工過程中。而偏中性的O76則可用于水解乳制品工業(yè)中的乳糖等。此外,它們對乳糖均具有較高的轉(zhuǎn)糖基活性,這為其用于合成具有特定生理功能的新物質(zhì)提供了可能。

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College of Biotechnology,Tianjin University of Science & Technology,Tianjin 300457,China)

Inthisstudy,threegenes(O158,AOandO76)encodingβ-galactosidasesfromAspergillus oryzaewereclonedandexpressed.TherecombinantsGS115(pPIC-O158),GS115(pPIC-AO)andGS115(pPIC-O76)wereconstructedandtherecombinantenzymesweresubsequentlyobtained.FurtheranalysisshowedthatthepHoptimaofO158,AOandO76were4.0,5.5and7.0,respectively,andtheiroptimaltemperatureswereall50 ℃.TheserecombinantenzymeswerestableinthepHrangeof5.0～7.5orattemperaturesrangingfrom30to40 ℃.TheiractivitieswereenhancedbyMn2+,butsignificantlyinhibitedbyFe2+,Cu2+andZn2+.O158,AOandO76onlyexhibitedhydrolyticandtransgalactosylactivitiestowardlactose.TheaffinityandcatalyticefficiencyofAOtowardslactosewerehigherthanthoseofO158andO76.Besides,O42wasnotexistedintheteststrainalthoughitwaspredictedinthereferencegenomesequence.Theheterologousexpressionandbiochemicalpropertiesofthreeβ-galactosidasesfromA. oryzaewerecomprehensivelyinvestigatedinthisstudy,whichlaysasolidfoundationfortheirlarge-scaleproductionsandindustrialapplications.

Aspergillus oryzae;β-Galactosidase;Molecularcloning;Biochemicalproperties

2016-05-10

董自星(1986-)，男，博士，助理研究員，研究方向：酶工程與技術(shù)，E-mail:star1987.com@163.com。

*通訊作者:王正祥(1964-)，男，博士，教授，研究方向：工業(yè)微生物資源與開發(fā)、工業(yè)酶制劑的高效表達(dá)與分子改造,E-mail:zx.wang@tust.edu.cn。

TS201.3

A

1002-0306(2016)21-0172-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.025