凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1產(chǎn)中性蛋白酶的發(fā)酵培養(yǎng)基及條件優(yōu)化

張營營,郭 茜,熊利霞,張紅星,謝遠紅,劉 慧,*,梁新貝,連正興

(1.北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院,微生態(tài)制劑關(guān)鍵技術(shù)開發(fā)北京市工程實驗室,食品質(zhì)量與安全北京實驗室,農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點實驗室,北京 102206;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,北京 100094)

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凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1產(chǎn)中性蛋白酶的發(fā)酵培養(yǎng)基及條件優(yōu)化

張營營1,郭 茜1,熊利霞1,張紅星1,謝遠紅1,劉 慧1,*,梁新貝1,連正興2

(1.北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院,微生態(tài)制劑關(guān)鍵技術(shù)開發(fā)北京市工程實驗室,食品質(zhì)量與安全北京實驗室,農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點實驗室,北京 102206;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,北京 100094)

為提高一株產(chǎn)中性蛋白酶凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)Liu-g1發(fā)酵液中蛋白酶活力,采用單因素和正交實驗研究不同培養(yǎng)基配方和不同發(fā)酵條件對凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1產(chǎn)中性蛋白酶活力的影響。結(jié)果表明:發(fā)酵培養(yǎng)基最優(yōu)配方為大豆粕1%、玉米淀粉4%、碳酸鈣0.6%;在初始pH7.5,裝液量30 mL/250 mL,發(fā)酵溫度45 ℃,發(fā)酵時間72 h優(yōu)化條件下發(fā)酵液中蛋白酶活力最高,可達243.874 U/mL,為優(yōu)化前的5.8倍。

凝結(jié)芽孢桿菌,中性蛋白酶活力,發(fā)酵,優(yōu)化

凝結(jié)芽孢桿菌具有乳酸菌產(chǎn)乳酸和芽孢桿菌耐高溫、抗逆性強、穩(wěn)定性好的儲存特性,以及具有豐富的胞外酶系統(tǒng),作為一種獨特的新型芽孢益生菌,被國內(nèi)外學(xué)者研究并應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、保健、畜牧和水產(chǎn)品養(yǎng)殖等行業(yè)[1-5]?？锶旱萚6]研究發(fā)現(xiàn)投喂凝結(jié)芽孢桿菌后的團頭魴魚的生長率和蛋白質(zhì)利用率均顯著提高,料肉比和腸道大腸桿菌數(shù)量顯著降低;曾麗莉等人[7]研究顯示飼料中添加適量的凝結(jié)芽孢桿菌可明顯改善櫻桃谷肉鴨的生長性能和生化指標(biāo);林麗花等人[8]在飼糧中添加200 mg/kg凝結(jié)芽孢桿菌菌粉(1×109CFU/g)可顯著提高黃羽肉雞日增重、胸肌率和成活率,顯著降低了全期肉雞的料肉比。諸多動物實驗中凝結(jié)芽孢桿菌體現(xiàn)出提高日增重、降低料肉比的效果,在很大程度上得益于其分泌的豐富胞外酶。凝結(jié)芽孢桿菌進入機體定植于腸道后,一方面產(chǎn)生大量蛋白酶[9]、脂肪酶[10]等,促進畜禽對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收;另一方面菌株代謝產(chǎn)生的氨基酸、維生素、短鏈脂肪酸、促生長因子等可供動物機體利用[11],從而促進畜禽的生長。雖然凝結(jié)芽孢桿菌在優(yōu)化發(fā)酵條件以獲得大量菌體或芽孢方面研究頗多,但是在優(yōu)化發(fā)酵條件以提高中性蛋白酶活力方面研究甚少。本文利用篩選自傳統(tǒng)干酪的凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1,采用單因素和正交實驗研究不同培養(yǎng)基配方和不同發(fā)酵條件對菌株Liu-g1產(chǎn)中性蛋白酶活力的影響,優(yōu)化凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1產(chǎn)中性蛋白酶的發(fā)酵條件,為工業(yè)化生產(chǎn)中性蛋白酶奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株 凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)Liu-g1:篩選于傳統(tǒng)干酪,經(jīng)前期實驗鑒定為產(chǎn)中性蛋白酶的菌株。保藏地址:中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基[12]:葡萄糖1%、蛋白胨1%、氯化鈉0.4%,pH7.0。

干酪素、L-酪氨酸 國藥集團化學(xué)試劑北京有限公司;福林試劑 Sigma試劑公司;其它發(fā)酵培養(yǎng)基試劑均為分析純 北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司。

BS224S型精密電子天平 德國賽多利斯集團;MLS-3750型全自動高壓蒸汽滅菌鍋 日本SANYO公司;BCN-1360B型無菌超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;2100型可見光分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;DSHZ-300多用途水浴恒溫振蕩器 江蘇太倉市實驗設(shè)備廠;雷磁PHS-3B型pH計 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化及擴培 凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1以2%的接種量移種于裝有10 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的試管中,于37 ℃在轉(zhuǎn)速為150 r/min的搖床培養(yǎng)48 h。如此活化培養(yǎng)2代,得到活化菌種。將活化菌液以2%接種量移種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中(50 mL/250 mL),培養(yǎng)條件同上,得到擴大培養(yǎng)液[13]。

1.2.2 單因素實驗確定發(fā)酵培養(yǎng)基配方

1.2.2.1 碳源的確定 將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源分別由1%葡萄糖、蔗糖、纖維素、可溶性淀粉、玉米淀粉、麥芽糖替代,將擴培菌液以2%接種量移種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中(50 mL/250 mL),于150 r/min的搖床37 ℃培養(yǎng)48 h,8000 r/min離心10 min,取上清測定發(fā)酵液中蛋白酶活力,根據(jù)酶活力大小分析確定較好的碳源。

1.2.2.2 氮源的確定 在確定較好碳源的基礎(chǔ)上,將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源分別由1%花生麩皮、大豆粕、棉籽粕、玉米麩皮、小麥麩皮替代[14],以上述同樣條件發(fā)酵后8000 r/min離心10 min,取上清測定發(fā)酵液中蛋白酶活力,根據(jù)酶活力大小分析確定較好的氮源。

1.2.2.3 無機鹽的確定 在確定較好碳源和氮源的基礎(chǔ)上,將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的無機鹽分別由0.4%氯化鈉、氯化鈣、碳酸鈣、硫酸鎂、硫酸錳、K2HPO4∶KH2PO4=1∶1替代,以上述同樣條件發(fā)酵后8000 r/min離心10 min,取上清測定發(fā)酵液中蛋白酶活力,根據(jù)酶活力大小分析確定較好的無機鹽。

1.2.3 正交實驗優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方 根據(jù)上述單因素多水平實驗結(jié)果,選擇質(zhì)量分數(shù)分別為1%、2%、4%的大豆粕,1%、2%、4%的玉米淀粉,0.2%、0.4%、0.6%的碳酸鈣設(shè)計凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1產(chǎn)中性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基的三因素三水平[L9(34)]正交實驗,因素水平表見表1。以上述同樣條件發(fā)酵后8000 r/min離心10 min,取上清測定發(fā)酵液中蛋白酶活力,根據(jù)酶活力大小分析確定優(yōu)化培養(yǎng)基配方。

表1 優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基正交因素水平表Table 1 Orthogonal factors level table for the optimization of medium components for Bacillus coagulans Liu-g1

1.2.4 單因素實驗確定發(fā)酵條件

1.2.4.1 發(fā)酵裝液量的確定 采用經(jīng)上述優(yōu)化好的培養(yǎng)基配方,250 mL三角瓶中裝液量分別為30、40、50、60、70 mL,以上述同樣條件發(fā)酵后8000 r/min離心10 min,取上清測定發(fā)酵液中蛋白酶活力,根據(jù)酶活力大小分析確定較好裝液量。

1.2.4.2 發(fā)酵轉(zhuǎn)速的確定 采用上述較好發(fā)酵裝液量,轉(zhuǎn)速分別為140、160、180、200、220 r/min,以上述同樣條件發(fā)酵后8000 r/min離心10 min,取上清測定發(fā)酵液中蛋白酶活力,根據(jù)酶活力大小分析確定較好轉(zhuǎn)速。

1.2.4.3 發(fā)酵接種量的確定 采用上述較好發(fā)酵裝液量、轉(zhuǎn)速,接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%,以上述同樣條件發(fā)酵后8000 r/min離心10 min,取上清測定發(fā)酵液中蛋白酶活力,根據(jù)酶活力大小分析確定較好接種量。

1.2.4.4 發(fā)酵pH的確定 采用上述較好發(fā)酵裝液量、轉(zhuǎn)速、接種量,初始培養(yǎng)基pH分別調(diào)節(jié)為6.5、7、7.5(自然)、8,以上述同樣條件發(fā)酵后8000 r/min離心10 min,取上清測定發(fā)酵液中蛋白酶活力,根據(jù)酶活力大小分析確定較好pH。

1.2.4.5 發(fā)酵時間的確定 采用上述較好發(fā)酵裝液量、轉(zhuǎn)速、接種量、初始pH7,發(fā)酵時間分別為12、24、36、48、60 h,以上述同樣條件發(fā)酵后8000 r/min離心10 min,取上清測定發(fā)酵液中蛋白酶活力,根據(jù)酶活力大小分析確定較好發(fā)酵時間。

1.2.4.6 發(fā)酵溫度的確定 采用上述較好發(fā)酵裝液量、轉(zhuǎn)速、接種量、初始pH7、發(fā)酵時間48 h,發(fā)酵溫度分別為37、41、45、50、55 ℃,以上述同樣條件發(fā)酵后8000 r/min離心10 min,取上清測定發(fā)酵液中蛋白酶活力,根據(jù)酶活力大小分析確定較好發(fā)酵溫度。

1.2.5 正交實驗優(yōu)化發(fā)酵條件 根據(jù)上述單因素多水平實驗結(jié)果,選擇6.5、7、7.5初始培養(yǎng)基pH,30、45、60 mL裝液量,37、41、45 ℃發(fā)酵溫度,48、60、72 h發(fā)酵時間設(shè)計四因素三水平[L9(34)]正交實驗,以上述同樣條件發(fā)酵后8000 r/min離心10 min,取上清測定發(fā)酵液中蛋白酶活力,根據(jù)酶活力大小分析確定優(yōu)化發(fā)酵條件。正交因素水平表如下:

表2 優(yōu)化發(fā)酵條件正交因素水平表Table 2 Orthogonal factors level table for the optimization of fermentation conditions for Bacillus coagulans Liu-g1

1.2.6 蛋白酶活力測定 參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T23527—2009《蛋白酶制劑》,采用福林-酚法測定中性蛋白酶活力[15]。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理方法 使用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗確定發(fā)酵培養(yǎng)基配方

2.1.1 碳源的確定 碳源即為微生物提供碳素來源的營養(yǎng)物質(zhì),主要生理功能是構(gòu)成微生物細胞物質(zhì)和代謝產(chǎn)物[16]。由圖1可見,以纖維素為碳源時發(fā)酵液有較高的蛋白酶活力,說明該菌能夠分泌纖維素酶;當(dāng)玉米淀粉為碳源時蛋白酶活力極顯著(p<0.01)高于其他碳源,為181.552 U/mL。這是由于玉米淀粉為遲效碳源,有利于菌體在穩(wěn)定期合成蛋白酶,而葡萄糖、蔗糖、麥芽糖為速效碳源,有利于菌體生長,但不利于代謝產(chǎn)物的合成。因此確定玉米淀粉為Liu-g1菌株發(fā)酵培養(yǎng)基碳源。

圖1 發(fā)酵培養(yǎng)基碳源對中性蛋白酶活力的影響Fig.1 Effect of carbon source on neutral proteinase activity

2.1.2 氮源的確定 氮源是組成微生物細胞中蛋白質(zhì)和核酸的重要成分。由圖2可知,五種不同的有機氮源條件下,Liu-g1菌株產(chǎn)中性蛋白酶活力差異明顯。以玉米麩皮和小麥麩皮為氮源時產(chǎn)蛋白酶活力極低;以大豆粕為氮源時產(chǎn)蛋白酶活力極顯著(p<0.01)高于花生麩皮,達161.513 U/mL,棉籽粕次之,為125.949 U/mL。因此確定豆粕為Liu-g1菌株發(fā)酵培養(yǎng)基氮源。

圖2 發(fā)酵培養(yǎng)基氮源對中性蛋白酶活力的影響Fig.2 Effect of nitrogen source on neutral proteinase activity

圖3 發(fā)酵培養(yǎng)基無機鹽對中性蛋白酶活力的影響Fig.3 Effect of inorganic salts on neutral proteinase activitty

2.2 正交實驗優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方

由表3可見RA>RB>RC,即影響Liu-g1菌株發(fā)酵液中蛋白酶活力的因素主次順序依次為:碳源含量、氮源含量、無機鹽含量;由KA1>KA2>KA3,KB3>KB1>KB2,KC3>KC2>KC1可知,發(fā)酵培養(yǎng)基配方最優(yōu)組合為A1B3C3,即碳源含量為1%,氮源含量為4%,無機鹽含量為0.6%,碳源∶氮源=1∶4。

表3 優(yōu)化培養(yǎng)基條件[L9(34)]正交實驗結(jié)果Table 3 Orthogonal array design and results for the optimization of medium components for Bacillus coagulans Liu-g1

2.3 單因素實驗確定發(fā)酵條件

2.3.1 發(fā)酵裝液量的確定 由圖4可知,裝液量在30 mL/250 mL時發(fā)酵液蛋白酶活力最高,達到186.048 U/mL。發(fā)酵裝液量是發(fā)酵環(huán)境中溶氧量的間接體現(xiàn),凝結(jié)芽孢桿菌為兼性厭氧菌,雖然缺氧乃至無氧條件下也可生存,但富氧環(huán)境有利于菌體的快速大量繁殖,足夠多的菌體富集因而能產(chǎn)生更多的蛋白酶。因此確定Liu-g1菌株發(fā)酵裝液量為30 mL/250 mL。

圖4 發(fā)酵裝液量對中性蛋白酶活力的影響Fig.4 Effect of fermentation volume on neutral proteinase activity

圖5 發(fā)酵轉(zhuǎn)速對中性蛋白酶活力的影響Fig.5 Effect of revolving speed on neutral proteinase activity

2.3.2 發(fā)酵轉(zhuǎn)速的確定 由圖5可知,發(fā)酵轉(zhuǎn)速對于發(fā)酵液中蛋白酶活力影響不大,轉(zhuǎn)速在140～220 r/min時發(fā)酵液蛋白酶活力先升高后降低,轉(zhuǎn)速在180 r/min時,發(fā)酵液蛋白酶活力最高。在一定范圍內(nèi),轉(zhuǎn)速的提高可以增加發(fā)酵液中溶氧量,從而促進菌體生長和蛋白酶累積;然而當(dāng)轉(zhuǎn)速超過180 r/min時,過高轉(zhuǎn)速開始不利于菌體的穩(wěn)定繁殖,從而降低發(fā)酵液中蛋白酶活力。由此確定Liu-g1菌株發(fā)酵轉(zhuǎn)速為180 r/min。

2.3.3 發(fā)酵接種量的確定 由圖6可見,隨發(fā)酵接種量的逐漸增加發(fā)酵液中蛋白酶活力呈現(xiàn)不規(guī)則跳躍,在接種量為5%時,發(fā)酵液蛋白酶活力最高,達143.869 U/mL。不同接種量水平對蛋白酶活力的影響差異不顯著。因此確定Liu-g1菌株發(fā)酵接種量為5%。

圖6 發(fā)酵接種量對中性蛋白酶活力的影響Fig.6 Effect of inoculation amount on neutral proteinase activity

2.3.4 發(fā)酵pH的確定 pH通過影響菌體營養(yǎng)物質(zhì)離子化程度、細胞膜電荷及膜滲透性,影響菌體對養(yǎng)分的吸收[17]。由圖7可知,初始pH在6.5～8.0時,發(fā)酵液中蛋白酶活力呈現(xiàn)先上升后下降趨勢,當(dāng)pH為7.0時,發(fā)酵液中蛋白酶活力最高,達180.523 U/mL。因此確定Liu-g1菌株發(fā)酵液初始pH為7.0。

圖7 發(fā)酵液pH對中性蛋白酶活力的影響Fig.7 Effect of initial pH on neutral proteinase activity

2.3.5 發(fā)酵時間的確定 由圖8可知,發(fā)酵時間為24 h和36 h時發(fā)酵液中蛋白酶活力極低,48 h時明顯升高,之后緩慢提高,發(fā)酵72 h的發(fā)酵液中蛋白酶活力極顯著(p<0.01)高于其他發(fā)酵時間組。這是由于發(fā)酵36 h之前Liu-g1菌株處于生長對數(shù)期,而菌體蛋白酶一般在穩(wěn)定期合成?？紤]發(fā)酵周期和成本因素,發(fā)酵時間選擇72 h。

圖8 發(fā)酵時間對中性蛋白酶活力的影響Fig.8 Effect of fermentation time on neutral proteinase activity

表5 發(fā)酵條件優(yōu)化前后產(chǎn)中性蛋白酶活力對照Table 5 Comparison of neutral protease activity before and after optimization of fermentation conditions

2.3.6 發(fā)酵溫度的確定 發(fā)酵溫度對蛋白酶合成及其活力有較大影響。由圖9可知,溫度在35～45 ℃時,發(fā)酵液蛋白酶活力逐漸升高;當(dāng)溫度為45 ℃時,發(fā)酵液蛋白酶活力最高,說明45 ℃為蛋白酶最適合成溫度;當(dāng)高于45 ℃時發(fā)酵液蛋白酶活力逐漸降低,這緣于較高的溫度會導(dǎo)致蛋白酶活力降低。因此確定Liu-g1菌株發(fā)酵溫度為45 ℃。

圖9 發(fā)酵溫度對中性蛋白酶活力的影響Fig.9 Effect of fermentation temprature on neutral proteinase activity

2.4 正交實驗優(yōu)化發(fā)酵條件

由表4可見RD>RC>RB>RA,即影響Liu-g1菌株發(fā)酵液中蛋白酶活力的因素主次順序依次為:發(fā)酵時間、裝液量、發(fā)酵溫度、初始pH;由KA3>KA2>KA1,KB1>KB2>KB3,KC3>KC2>KC1,KD3>KD2>KD1可知,發(fā)酵條件最優(yōu)組合為A3B1C3D3,即初始pH7.5,裝液量30 mL/250 mL,發(fā)酵溫度45 ℃,發(fā)酵時間72 h。

表4 優(yōu)化發(fā)酵條件L9(34)正交實驗結(jié)果Table 4 Orthogonal array design and results for the optimization of fermentation conditions for Bacillus coagulans Liu-g1

2.5 驗證實驗

由表5可知,對照組凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1蛋白酶活力為42.106 U/mL,優(yōu)化發(fā)酵條件下Liu-g1菌株發(fā)酵液中蛋白酶活力可達243.874 U/mL,為優(yōu)化前的5.8倍。

3 結(jié)論

本文通過單因素和正交實驗優(yōu)化凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1產(chǎn)中性蛋白酶的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:大豆粕1%、玉米淀粉4%、碳酸鈣0.6%;優(yōu)化發(fā)酵條件為:初始pH7.5,裝液量30 mL/250 mL,發(fā)酵溫度45 ℃,發(fā)酵時間72 h。在優(yōu)化發(fā)酵條件下中蛋白酶活力可達243.874 U/mL,為優(yōu)化前的5.8倍。

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Optimization of culture medium and fermentation conditions for neutral protease produced byBacilluscoagulansLiu-g1

ZHANG Ying-ying1,GUO Qian1,XIONG Li-xia1,ZHANG Hong-xing1,XIE Yuan-hong1,LIU Hui1,*,LIANG Xin-bei1,LIAN Zheng-xing2

(1.Food Science and Engineering College,Beijing University of Agriculture,Beijing Engineering Laboratory of Probiotics Key Technology Development,Food Quality and Safety Lab in Beijing,Harmful Microorganisms and Pesticide Safety Inspection of Agricultural Products and the Control of the Beijing Key Laboratory,Beijing 102206,China;2.College of Animal Science and Technology,China Agricultural University,Beijing 100094,China)

InordertoimprovetheactivityofneutralproteaseproducedbyBacillus coagulansLiu-g1,singlefactortestandorthogonaltestonBacillus coagulansLiu-g1proteaseactivitywerecarriedout.Theresultsshowedthattheoptimalculturemediumformulawas1%ofsoybeanpowder,4%ofcornstarchand0.6%ofcalciumcarbonate.TheresultsalsoindicatedthatthebestinitialpHwas7.5,fermentationvolumeof30mL/250mL,incubationtemperatureat45 ℃,fermentationtimefor72h.Theproteaseactivityreached243.874U/mLinsuchconditions,5.8timestheamountofinitialconditions.

Bacillus coagulans;neutralproteaseactivity;fermentation;optimization

2016-05-30

張營營(1990-)，女，碩士，研究方向：食品微生物，E-mail：18811300700@163.com。

*通訊作者:劉慧(1963-)，女，碩士，教授，研究方向：食品微生物與發(fā)酵，E-mail：mxdlh1963@163.com。

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(2014ZX08008-005)；北京市屬高等學(xué)校高層次人才引進與培養(yǎng)項目(CIT&TCD20140315)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)21-0150-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.021