猴頭菇多糖粗提液的殼聚糖法脫蛋白及分離純化研究

易曉敏,周春暉,黃惠華,*

(1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510640;2.廣東太陽神集團(tuán)有限公司,廣東廣州 510665)

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猴頭菇多糖粗提液的殼聚糖法脫蛋白及分離純化研究

易曉敏1,周春暉2,黃惠華1,*

(1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510640;2.廣東太陽神集團(tuán)有限公司,廣東廣州 510665)

研究了料液比(v/v)、pH、時(shí)間及處理次數(shù)對猴頭菇多糖粗提液殼聚糖法脫蛋白的影響,得到了殼聚糖法脫蛋白的最優(yōu)工藝,并通過柱層析對猴頭菇多糖進(jìn)行了分離純化。優(yōu)化的殼聚糖法脫蛋白工藝為:料液比50∶1,pH為粗提液本身的pH,4 ℃條件下靜置2 h,處理次數(shù)為1次;此時(shí)蛋白質(zhì)去除率為60.11%±0.47%,多糖損失率為11.16%±0.48%,殼聚糖殘留率為1.01%±0.005%,蛋白質(zhì)去除率比Sevage法提高11.67%,且多糖損失率降低了80.87%。猴頭菇粗多糖經(jīng)DEAE Sepharose Fast Flow柱層析分離得到兩種多糖HEP-Ⅰ和HEP-Ⅱ,Sephadex G-75柱層析、紫外檢測得出HEP-Ⅰ和HEP-Ⅱ均為成分均一的多糖,紅外檢測得出HEP-Ⅰ為同時(shí)含有吡喃環(huán)和呋喃環(huán)的糖類物質(zhì),而HEP-Ⅱ?yàn)楹羞拎h(huán)的糖類物質(zhì)。殼聚糖法脫蛋白工藝合理可行,分離純化后的猴頭菇多糖成分均一。

猴頭菇多糖,殼聚糖法,脫蛋白,柱層析,分離純化

猴頭菇(Hericiumerincaceus)是在我國廣泛分布的藥食同源菌,它營養(yǎng)豐富,含蛋白質(zhì)、脂肪、可溶性糖、氨基酸及Fe、Ca、Mg、Zn等多種人體必需的礦物質(zhì)[1]。現(xiàn)代研究表明猴頭菇含有多種活性成分,包括多糖、萜類、生物堿、酚類化合物等。其中猴頭菇多糖因?yàn)榫哂辛己玫拿庖哒{(diào)節(jié)、抗腫瘤、護(hù)胃等生理活性而備受關(guān)注,相關(guān)的保健品也深受消費(fèi)者的喜愛[2-4]。目前相關(guān)的猴頭菇產(chǎn)品多用提取液制備而成,制品中除了含有多糖,還含有蛋白質(zhì)等雜成分,雜成分的存在,除了影響產(chǎn)品的質(zhì)量外,對于闡明猴頭菇中的功能成分有干擾作用。因此對猴頭菇多糖提取物進(jìn)行分離純化對提高相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量具有重要的意義。

目前,多糖常用的脫蛋白方法主要有Sevage法、三氯乙酸法、鹽酸法、氫氧化鈉法等[5],而酸堿的添加易使多糖的結(jié)構(gòu)和活性受到影響,有機(jī)溶劑的使用會引起有毒有害物質(zhì)的殘留,影響到產(chǎn)品的安全性而不能應(yīng)用于食品的加工生產(chǎn)。殼聚糖是一種天然的陽離子多糖,對蛋白質(zhì)有絡(luò)合和吸附作用,且具有提高免疫細(xì)胞活性、抗腫瘤、抗菌、降血壓、抗氧化等生物活性,無毒無害、可食用[6-7]。柱層析是進(jìn)一步分離純化多糖的常用手段,常用的用于分離多糖的柱層析填料有葡聚糖凝膠系列及瓊脂糖凝膠系列,而DEAE Sepharose Fast Flow是高流速的瓊脂糖凝膠,具有分離速度快,分離效果好的特點(diǎn)[8-9]。本研究選擇殼聚糖對猴頭菇多糖粗提液進(jìn)行脫蛋白,旨在尋求綠色環(huán)保、可應(yīng)用于食品加工的脫蛋白方法,并采用DEAE Sepharose Fast Flow進(jìn)行柱層析分離純化,為多糖相關(guān)保健食品的生產(chǎn)及研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

猴頭菇 產(chǎn)自福建省古田縣,經(jīng)干燥粉碎后過80目篩備用;殼聚糖(脫乙酰度≥ 90%,生化試劑BC)上海伯奧生物科技有限公司;DEAE Sepharose Fast Flow,Sephadex G-75 美國GE;D315大孔弱堿性陰離子交換樹脂 鄭州勤實(shí)科技有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋,HJ-6A磁力加熱攪拌器 常州普天儀器制造有限公司;JW-3021HR高速冷凍離心機(jī) 安徽嘉文儀器裝備有限公司;UV-1800紫外可見分光光度計(jì) 日本島津公司;XW-80A旋渦混合器,BSZ-160F電腦自動部份收集器,HL-2B數(shù)顯恒流泵,層析柱(1.6 cm×20 cm) 上海精科實(shí)業(yè)有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器;LGJ-10冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司;VERTEX70傅立葉紅外光譜儀 德國Bruker公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 猴頭菇多糖粗提液的制備 猴頭菇粉末樣品稱重后與蒸餾水以1∶20(g/mL)的料液比混合均勻,在85 ℃水浴攪拌提取5 h,3000 r/min離心15 min,即得到猴頭菇多糖粗提液[10]。

1.2.2 猴頭菇多糖殼聚糖法脫蛋白工藝 取20 mL猴頭菇多糖粗提液,在一定的料液比、pH、靜置時(shí)間和處理次數(shù)的條件下,對粗提液進(jìn)行脫蛋白,3000 r/min離心10 min,取上清液,分別測定蛋白質(zhì)去除率、多糖損失率和殼聚糖殘留率。

1.2.2.1 料液比對殼聚糖法脫蛋白的影響 取20 mL猴頭菇多糖粗提液,添加殼聚糖溶液,pH為粗提液本身的pH(pH為5.85～5.90),旋渦振蕩2 min,常溫靜止10 min,離心取上清液,研究不同料液比(v/v,多糖粗提液/殼聚糖溶液,殼聚糖溶液濃度為2.5%,以1%醋酸溶液配制)20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1對殼聚糖法脫蛋白的影響。

1.2.2.2 pH對殼聚糖法脫蛋白的影響 取20 mL猴頭菇多糖粗提液,以料液比50∶1混合,以0.1 mol/L HCl、0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液的pH,旋渦振蕩2 min,常溫靜止10 min,離心取上清液,研究不同pH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0對殼聚糖法脫蛋白的影響。

1.2.2.3 靜置時(shí)間對殼聚糖法脫蛋白的影響 取20 mL猴頭菇多糖粗提液,以料液比50∶1混合,pH為粗提液本身的pH,旋渦振蕩2 min,4 ℃條件下靜置一段時(shí)間,離心取上清液,研究4 ℃條件下不同靜置時(shí)間0、1、2、3、4 h對殼聚糖法脫蛋白的影響。

1.2.2.4 處理次數(shù)對殼聚糖法脫蛋白的影響 取20 mL猴頭菇多糖粗提液,以料液比50∶1混合,pH為粗提液本身的pH,旋渦振蕩2 min,常溫放置10 min,離心取上清液,再重復(fù)處理,處理結(jié)束后4 ℃條件下放置2 h,再離心取上清液,比較處理次數(shù)為1、2、3、4、5次對殼聚糖法脫蛋白的影響。

1.2.3 Sevage法脫蛋白 取20 mL猴頭菇多糖粗提液,與Sevage試劑(氯仿∶正丁醇=5∶1(v/v))以4∶1(v/v)的比例混合10 min,3000 r/min離心10 min,取上清液,重復(fù)上述處理1、2、3、4、5次,測定蛋白質(zhì)去除率和多糖損失率[11]。

1.2.4 蛋白質(zhì)去除率、多糖損失率及殼聚糖殘留率的測定

1.2.4.1 蛋白質(zhì)去除率的測定 采用考馬斯亮藍(lán)法以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品測定蛋白質(zhì)含量,以595 nm為測定波長,得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。蛋白質(zhì)去除率的計(jì)算如式(1):

式(1)

式中:x1-粗提液的蛋白質(zhì)濃度(mg/mL),x2-脫蛋白后溶液的蛋白質(zhì)濃度(mg/mL),b1-粗提液測定時(shí)的稀釋倍數(shù),b2-脫蛋白后溶液測定時(shí)的稀釋倍數(shù),V1-粗提液的體積(mL),V2-脫蛋白后溶液的體積(mL)。

1.2.4.2 多糖損失率的測定 采用苯酚-硫酸法以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品測定總糖含量,以490 nm為測定波長,得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。采用DNS法以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品測定還原糖含量,以540 nm為測定波長,得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。猴頭菇多糖含量和猴頭菇多糖損失率按式(2)、式(3)計(jì)算:

猴頭菇多糖含量m(mg)=(x1b1-x2b2)×V

式(2)

式(3)

式中:x1-總糖濃度(mg/mL),x2-還原糖濃度(mg/mL),b1-測定總糖時(shí)的稀釋倍數(shù),b2-測定還原糖時(shí)的稀釋倍數(shù),V-溶液的總體積(mL),m1-粗提液的多糖含量(mg),m2-脫蛋白后溶液的多糖含量(mg)。

1.2.4.3 殼聚糖殘留率的測定 采用水溶苯胺藍(lán)褪色光度法測定脫蛋白后提取液中的殼聚糖含量[12]。以殼聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品測定殼聚糖含量,以610nm為測定波長,得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。猴頭菇多糖提取液的殼聚糖殘留率的計(jì)算如式(4):

式(4)

式中:x1-粗提液測定時(shí)的殼聚糖濃度(mg/mL),x2-脫蛋白后溶液測定時(shí)的殼聚糖濃度(mg/mL),b1-粗提液測定時(shí)的稀釋倍數(shù),b2-脫蛋白后溶液測定時(shí)的稀釋倍數(shù),V1-粗提液的體積(mL),V2-脫蛋白后溶液的體積(mL)。

1.2.5 猴頭菇粗多糖的制備 猴頭菇多糖提取工藝按1.2.1進(jìn)行,粗提液經(jīng)濃縮、殼聚糖法脫蛋白后,采用終濃度為80%乙醇溶液醇沉過夜,離心取沉淀溶解,采用D315大孔樹脂進(jìn)行脫色[13],過濾后取濾液進(jìn)行透析,-50 ℃下冷凍干燥36 h,得到猴頭菇粗多糖HEP。

1.2.6 猴頭菇粗多糖的DEAE Sepharose Fast Flow柱層析分離純化 取猴頭菇粗多糖30 mg在1 mL蒸餾水中溶解,配制成濃度為30 mg/mL的上樣液,上樣體積為1 mL,分別以蒸餾水、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1 mol/L的NaCl溶液為洗脫液進(jìn)行洗脫,洗脫流速為1 mL/min,每管收集5 mL,每個(gè)梯度溶液分別收集50管[9]。采用苯酚-硫酸法逐管檢測,以管數(shù)為橫坐標(biāo),490 nm處的吸光值為縱坐標(biāo),繪制洗脫曲線得到相應(yīng)洗脫組分。收集各組分溶液,透析后凍干得到樣品。

1.2.7 猴頭菇多糖純度分析

1.2.7.1 Sephadex G-75柱層析 對DEAE Sepharose Fast Flow柱層析分離得到的樣品進(jìn)行Sephadex G-75柱層析,上樣濃度為50 mg/mL,上樣體積為2 mL,以蒸餾水為洗脫液進(jìn)行洗脫,洗脫流速為0.5 mL/min,每管收集5 mL,收集50管[14]。按1.2.6得到相應(yīng)純化樣品。

1.2.7.2 紫外掃描分析 采用UV-1800紫外可見分光光度計(jì)對猴頭菇多糖溶液(180 μg/mL)在200～800 nm下進(jìn)行掃描,繪制紫外光譜圖[15]。

1.2.7.3 碘-碘化鉀反應(yīng) 取1 mg/mL的多糖溶液,加入1 mL I2-KI溶液,混合,以1 mg/mL的可溶性淀粉為陽性對照,觀察顏色的變化。

1.2.8 紅外光譜分析 采用KBr壓片法得到猴頭菇多糖紅外圖譜。取3 mg猴頭菇多糖與100 mg干燥后的KBr粉末研磨混合均勻,壓成薄片,傅里葉變換紅外光譜儀掃描測定,掃描波長為4000～400 cm-1[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

2.1.1 測定蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 y=8.075x+0.012,R2=0.997,其中x為牛血清白蛋白的質(zhì)量濃度(mg/mL);y為吸光度。

2.1.2 測定總糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 y=13.240x-0.001,R2=0.999,其中x為葡萄糖的質(zhì)量濃度(mg/mL),y為吸光度。

2.1.3 測定單糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 y=1.260x-0.016,R2=0.999。其中x為葡萄糖的質(zhì)量濃度(mg/mL),y為吸光度。

2.1.4 測定殼聚糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 y=-70.26x+0.012,R2=0.998,其中x為殼聚糖的質(zhì)量濃度(mg/mL),y為吸光度。

2.2 殼聚糖法的脫蛋白

2.2.1 料液比對殼聚糖法脫蛋白的影響 由圖1可知,當(dāng)料液比在20∶1～60∶1范圍內(nèi),隨著料液比的增加,蛋白質(zhì)去除率呈現(xiàn)先增大后平穩(wěn)的趨勢,在料液比為50∶1時(shí)達(dá)到最高值。多糖損失率呈現(xiàn)緩慢增加的趨勢,殼聚糖殘留率呈平緩減少的趨勢。料液比為20∶1時(shí)的蛋白質(zhì)去除率幾乎為0%,說明較低的料液比不利于殼聚糖與蛋白質(zhì)的吸附,反而引入了蛋白質(zhì);較高的料液比有利于吸附作用,且減少殼聚糖的殘留。

圖1 料液比對殼聚糖法脫蛋白的影響Fig.1 The influence of ratio of extract to chitosan solvent on protein removal by chitosan method

2.2.2 pH對殼聚糖法脫蛋白的影響 由圖2可知,當(dāng)pH在4.0～8.0范圍內(nèi),隨著pH的增加,蛋白質(zhì)去除率呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢,在pH為6.0時(shí)達(dá)到最高值,多糖損失率呈現(xiàn)緩慢增加的趨勢,殼聚糖殘留率則保持穩(wěn)定。通過對比圖1與圖2的多糖損失率可看出,由于pH的調(diào)節(jié),多糖損失率明顯增加,說明酸堿度的變化可能引起猴頭菇多糖的水解,增加多糖的損失。隨著溶液pH的升高,蛋白質(zhì)所帶的負(fù)電荷增加,容易被帶正電荷的殼聚糖吸附,但隨著溶液中OH-濃度的升高,降低了殼聚糖對蛋白質(zhì)負(fù)電荷的吸附能力,造成蛋白質(zhì)去除率的降低[17]。經(jīng)測定得猴頭菇多糖粗提液的pH為5.80～5.90,與pH6.0接近,且蛋白質(zhì)去除率更高,說明殼聚糖法脫蛋白的最佳pH在5.0～6.0之間,為了保留較好的脫蛋白效果,同時(shí)簡化脫蛋白工藝,因此在采用殼聚糖法脫蛋白時(shí)可避免pH的調(diào)節(jié)。

圖2 pH對殼聚糖法脫蛋白的影響Fig.2 The influence of pH on protein removal by chitosan method

2.2.3 靜置時(shí)間對殼聚糖法脫蛋白的影響 由圖3可知,當(dāng)脫蛋白處理后的提取液在4 ℃條件中放置0～4 h范圍內(nèi),隨著時(shí)間的增加,蛋白質(zhì)去除率呈現(xiàn)先增大后平穩(wěn)的趨勢,在時(shí)間為2 h時(shí)達(dá)到最高值,多糖損失率呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢,殼聚糖殘留率則保持穩(wěn)定。

圖3 靜置時(shí)間對殼聚糖法脫蛋白的影響Fig.3 The influence of time on protein removal by chitosan method

2.2.4 處理次數(shù)對殼聚糖法脫蛋白的影響 由圖4可知,當(dāng)處理次數(shù)在1～5次范圍內(nèi),隨著處理次數(shù)的增加,蛋白質(zhì)去除率呈現(xiàn)下降而后平穩(wěn)的趨勢,在處理次數(shù)為1次時(shí)達(dá)到最高值,多糖損失率呈現(xiàn)緩慢增加的趨勢,殼聚糖殘留率呈緩慢增加的趨勢。蛋白質(zhì)去除率隨著處理次數(shù)增加而降低,可能是由于殼聚糖不純,經(jīng)測定得出所使用的殼聚糖中蛋白質(zhì)含量為50.07%±0.66%,而經(jīng)第一次處理后,再次加入的殼聚糖溶液引入了蛋白質(zhì),且由于殼聚糖的殘留,溶液中料液比發(fā)生了變化,影響了殼聚糖法脫蛋白的效果,而導(dǎo)致蛋白質(zhì)去除率的降低。

圖4 處理次數(shù)對殼聚糖法脫蛋白的影響Fig.4 The influence of frequency on protein removal by chitosan method

綜合分析四個(gè)因素的影響,可知,殼聚糖法脫蛋白最佳方案為料液比為50∶1,pH為粗提液本身的pH,4 ℃靜置2 h,處理次數(shù)為1次;蛋白質(zhì)去除率為60.11%±0.47%,猴頭菇多糖損失率為11.16%±0.48%,殼聚糖殘留率為1.01%±0.005%。

2.3 殼聚糖法脫蛋白與Sevage法脫蛋白的比較

由圖5可知,在處理次數(shù)為1～5次范圍內(nèi),隨著處理次數(shù)的增加,Sevage法的蛋白質(zhì)去除率呈現(xiàn)先增大后平穩(wěn)的趨勢,當(dāng)處理次數(shù)為5次時(shí),達(dá)到最高值;猴頭菇多糖損失率呈現(xiàn)增加的趨勢。在此范圍內(nèi),Sevage法脫蛋白最佳處理次數(shù)為5次,蛋白質(zhì)去除率為53.83%±0.35%,猴頭菇多糖損失率為58.34%±0.62%。由圖6可知,相比之下,殼聚糖法脫蛋白的蛋白質(zhì)去除率比Sevage法的蛋白質(zhì)去除率提高了11.67%,且多糖損失率降低了80.87%,可見,殼聚糖法脫蛋白在去除蛋白質(zhì)的同時(shí),能夠更好的保留了猴頭菇多糖在提取液中的含量。

圖5 Sevage法脫蛋白Fig.5 Protein removal by Sevage method

圖6 殼聚糖法脫蛋白與Sevage法脫蛋白的比較Fig.6 The comparison between chitosan method and Sevage method

2.4 猴頭菇粗多糖的DEAE Sepharose Fast Flow柱層析分離純化

圖7的洗脫曲線顯示有2個(gè)吸收峰,分別出現(xiàn)在蒸餾水洗脫和0.1 mol/L NaCl溶液的洗脫條件下,收集各吸收峰對應(yīng)的管數(shù)(4～6管,54～59管),透析后冷凍干燥得到多糖的分別命名為HEP-Ⅰ和HEP-Ⅱ。

圖7 DEAE Sepharose Fast Flow柱層析洗脫曲線Fig.7 The elution curve of DEAE Sepharose Fast Flow column chromatogram

2.5 猴頭菇多糖的純度分析

2.5.1 Sephadex G-75柱層析洗脫曲線 由圖8可知,兩條洗脫曲線分別只有一個(gè)對稱的吸收峰,說明猴頭菇粗多糖經(jīng)過DEAE Sepharose Fast Flow 所得的糖分HEP-Ⅰ和HEP-Ⅱ?yàn)榫欢嗵恰?/p>

圖8 HEP-Ⅰ、HEP-Ⅱ的Sephadex G-75柱層析洗脫曲線Fig.8 The elution curve of Sephadex G-75 column chromatogram of HEP-Ⅰand HEP-Ⅱ

圖9 HEP-Ⅰ、HEP-Ⅱ的紫外掃描圖譜Fig.9 UV scanning spectrum of HEP-Ⅰ and HEP-Ⅱ

2.5.2 紫外掃描分析 260、280 nm處的吸收峰通常是大分子多肽、蛋白質(zhì)及核酸等成分的特征吸收峰。由圖9可知,通過與粗糖的對比,猴頭菇多糖HEP-Ⅰ、HEP-Ⅱ在260、280 nm處的吸光值均明顯降低,且均沒有吸收峰出現(xiàn),說明猴頭菇多糖HEP-Ⅰ、HEP-Ⅱ基本不含大分子多肽、蛋白質(zhì)和核酸。

2.5.3 碘-碘化鉀反應(yīng) 與淀粉溶液對比,猴頭菇多糖HEP-Ⅰ、HEP-Ⅱ加入碘-碘化鉀溶液后,靜置30 min,沒有明顯的藍(lán)色變化,說明HEP-Ⅰ、HEP-Ⅱ均不含淀粉。

2.6 紅外光譜分析

猴頭菇多糖HEP-Ⅰ、HEP-Ⅱ的紅外光譜如圖10所示,HEP-Ⅰ的3402.31 cm-1和HEP-Ⅱ的3400.74 cm-1處均為糖分子的O-H鍵伸縮振動引起的吸收峰;HEP-Ⅰ的1371.32 cm-1和HEP-Ⅱ的1374.11 cm-1處的吸收峰為C-H的變角振動造成;這些都是糖類物質(zhì)的特征吸收峰。HEP-Ⅰ的2922.87 cm-1和HEP-Ⅱ的2923.69 cm-1處的吸收峰則由-CH2或-CH3的振動產(chǎn)生;HEP-Ⅰ的1647.00 cm-1和HEP-Ⅱ的1646.38 cm-1處的吸收峰為分子中的結(jié)合水引起;HEP-Ⅰ的1420.06 cm-1和HEP-Ⅱ的1420.67 cm-1處的吸收峰為-COOH的C-O伸縮振動產(chǎn)生;HEP-Ⅰ和HEP-Ⅱ在1000～1200 cm-1之間的一組強(qiáng)烈吸收峰是吡喃環(huán)中C-O-C鍵以及C-O-H的吸收;HEP-Ⅰ的916.23 cm-1和HEP-Ⅱ的918.53 cm-1處的吸收峰為吡喃環(huán)的非對稱環(huán)伸縮振動引起;而HEP-Ⅰ的804.75 cm-1為呋喃糖的C-H變角振動造成;說明HEP-Ⅱ可能為同時(shí)含有吡喃環(huán)和呋喃環(huán)的糖類物質(zhì),而HEP-Ⅱ可能為含有吡喃環(huán)的糖類物質(zhì)[18-19]。

圖10 HEP-Ⅰ、HEP-Ⅱ的紅外光譜Fig.10 Infrared Spectroscopy of HEP-Ⅰand HEP-Ⅱ

3 結(jié)論

采用殼聚糖法對猴頭菇多糖粗提液進(jìn)行脫蛋白的研究表明:殼聚糖法脫蛋白最佳方案為料液比50∶1,放置于4 ℃條件下2 h,再離心取上清液;脫蛋白去除率為60.11%±0.47%,猴頭菇多糖損失率為11.16%±0.48%,殼聚糖殘留率為1.01%±0.005%。此方法的蛋白質(zhì)去除率較Sevage法提高了11.67%,且多糖損失率降低了80.87%。采用DEAE Sepharose Fast Flow柱層析對猴頭菇粗多糖進(jìn)行分離純化,得到兩種多糖HEP-Ⅰ和HEP-Ⅱ。Sephadex G-75柱層析表明其為均一多糖,紫外掃描顯示均無蛋白質(zhì)組分,碘-碘化鉀反應(yīng)說明均不含淀粉,說明猴頭菇多糖HEP-Ⅰ和HEP-Ⅱ?yàn)榫欢嗵恰＜t外光譜顯示HEP-Ⅰ為同時(shí)含有吡喃環(huán)和呋喃環(huán)的糖類物質(zhì),HEP-Ⅱ?yàn)楹羞拎h(huán)的糖類物質(zhì)。

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Protein removal and purification by chitosan method ofHericiumerincaceuspolysaccharide extract

YI Xiao-min1,ZHOU Chun-hui2,HUANG Hui-hua1,*

(1.School of Food Science and Engineering,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China;2.Guangdong Apollo Co.,Ltd.,Guangzhou 510665,China)

Effectsofsolid-liquidratio(v/v),pH,timeandfrequencyonproteinremovalfromHericium erincaceuspolysaccharideextractbychitosanmethodwerestudied,andtheoptimumconditionswereobtained,theHericium erincaceuspolysaccharidewasisolatedandpurifiedbycolumnchromatography.Theresultsshowedthattheoptimumconditionsweretheratioofextracttochitosansolvent(v/v)was50∶1,originalpH,andtimeof2hforatime.Undersuchcondition,theremovalrateofproteinreachedabout60.11%±0.47%,whichwashigherthanSevagemethodby11.67%andthelossrateofpolysaccharideswasdecreasedtoabout11.16%±0.48%,whichwaslowerthanSevagemethodby80.87%,andtheresidualofchitosanwasdetectedabout1.01%±0.005%.Twokindsofpolysaccharide,HEP-ⅠandHEP-Ⅱ,wereisolatedandpurifiedfromthecrudeHericium erinaceuspolysaccharidebyDEAESepharoseFastFlowcolumnchromatography.SephadexG-75columnchromatography,UVspectrophotometer,andFouriertransforminfraredspectroscopywereusedtoanalyzeHEP-ⅠandHEP-Ⅱ.TheresultsshowedthatbothofHEP-ⅠandHEP-Ⅱwereinuniqueform.AndHEP-Ⅰcontaincarbohydratepyranringandfuranring,whileHEP-Ⅱonlycontaincarbohydratepyranring.Chitosanmethodwasreasonablypracticable,andHericium erinaceuspolysaccharidewasinhighpurityaftercolumnchromatography.

Hericium erincaceuspolysaccharides;chitosanmethod;proteinremoval;columnchromatography;purification

2016-04-25

易曉敏(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)，E-mail:yi_xiaomin91@163.com。

*通訊作者:黃惠華(1954-)，男，博士，教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品深加工及高值化,E-mail:fehhuang@scut.edu.cn。

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B090600008)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)21-0119-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.015