刺五加水提取物的抗氧化活性研究

田松陽,于成龍,徐 微,4,*,陳鐵云,孫 擎,王君妍,李 妍

(1.哈爾濱學院工學院食品科學與工程系,黑龍江哈爾濱 150086;2.黑龍江職業(yè)學院,黑龍江哈爾濱 150080;3.東北林業(yè)大學野生動物資源學院,黑龍江哈爾濱 150040;4.乳品科學教育部重點實驗室,東北農(nóng)業(yè)大學,黑龍江哈爾濱 150030)

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刺五加水提取物的抗氧化活性研究

田松陽1,于成龍2,3,+,徐 微1,4,*,陳鐵云1,孫 擎1,王君妍2,李 妍1

(1.哈爾濱學院工學院食品科學與工程系,黑龍江哈爾濱 150086;2.黑龍江職業(yè)學院,黑龍江哈爾濱 150080;3.東北林業(yè)大學野生動物資源學院,黑龍江哈爾濱 150040;4.乳品科學教育部重點實驗室,東北農(nóng)業(yè)大學,黑龍江哈爾濱 150030)

采用熱水浸提法對刺五加中水溶性成分進行提取,以浸提液對DPPH自由基的清除率為評價指標,研究了浸提溫度、浸提時間、料液比、浸提次數(shù)對其抗氧化活性的影響,從而確定最佳提取條件。正交實驗結(jié)果表明,在浸提溫度為70 ℃、提取時間110 min、料液比1∶80(g/mL),提取次數(shù)為2次的條件下,浸提液對DPPH自由基的清除率可達69.14%。此外,將最佳條件下獲得的刺五加水提取物的清除DPPH自由基、O2-·自由基和·OH自由基能力與維生素C進行對比分析。結(jié)果表明,浸提液對 O2-·自由基的清除能力顯著低于維生素C(p<0.05),其清除率為31.69%;而浸提液對超氧陰離子和羥自由基的清除率均顯著高于維生素C(p<0.05),其中對羥自由基的清除率達到76.03%。

刺五加,提取,抗氧化性質(zhì),自由基

刺五加(AcanthopanaxsenticocusHarms)是多年生木本植物,屬傘形目五加科植物。主要分布在我國黑龍江、吉林、遼寧和河北等地,是我國東北地區(qū)典型的藥用植物,它也是經(jīng)國家衛(wèi)生部批準頒布的藥食同源中藥之一。刺五加中含有豐富的生物活性成分,如刺五加多糖、刺五加總皂苷、β-谷甾醇、胡蘿卜苷和紫丁香樹脂醇苷等,其中部分活性物質(zhì)具有營養(yǎng)保健作用。中醫(yī)和本草綱目認為,刺五加具有益氣健脾和補腎安神的功效[1]。大量研究也證實了,它能有效治療心臟病、高血壓、風濕病和糖尿病等多種疾病[2-4],此外,它還具有較強的免疫活性,能促進T細胞、B細胞、NK細胞等免疫細胞對細胞因子的分泌[5-6]。而近些年研究人員發(fā)現(xiàn),刺五加存在一定的抗氧化活性和抗腫瘤作用[7-9]。因此,對刺五加生物活性成分的抗氧化能力探究成為近些年的主要研究內(nèi)容。

目前,刺五加有效成分的提取方法有微波法、超聲波法、超臨界二氧化碳萃取法、有機溶劑法等。但在提取過程中,這些方法可能會對有效成分的活性產(chǎn)生一定影響,因此,本研究采用熱水浸提法提取刺五加的有效成分,并以其清除DPPH自由基的能力為指標,通過正交實驗優(yōu)化提取工藝,并配以維生素C作為對照,研究其超氧陰離子自由基和羥自由基的清除能力,為刺五加的進一步開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺五加 黑龍江省中藥聯(lián)營總公司批發(fā)四部;DPPH Sigma公司;無水乙醇 天津市永大化學試劑有限公司;番紅 北京中生瑞泰科技有限公司;鄰苯三酚 上海展云化工有限公司;抗壞血酸 深圳安泰生物科技有限公司,等;所有試劑均為分析純。

T6型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;FA224型電子分析天平 上海?？惦娮觾x器廠;DK-98-11A型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;FK-A型組織搗碎機 江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠;Alpha 1-4 中型凍干機真空冷凍干燥機 德國Matin Christ;202A-F型電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司,等。

1.2 實驗方法

1.2.1 有效成分的提取 將刺五加洗凈,烘干至恒重后粉碎,過20目篩子。根據(jù)反應條件,準確稱取刺五加粉末,加入蒸餾水,用勻漿機進行處理得到勻漿液。采用熱水浸提法對刺五加的有效成分進行提取,提取液凍干備用。

1.2.2 單因素實驗設計

1.2.2.1 浸提溫度對DPPH自由基清除率的影響 在料液比為1∶40(g/mL),浸提時間為120 min,提取次數(shù)為1次的浸提條件下,研究浸提溫度(40、50、60、70、80、90 ℃)對DPPH自由基清除率的影響。

1.2.2.2 浸提時間對DPPH自由基清除率的影響 在料液比為1∶40(g/mL),浸提溫度為70 ℃,提取次數(shù)為1次的浸提條件下,研究浸提時間(30、60、90、120、150 min)對DPPH自由基清除率的影響。

1.2.2.3 料液比對DPPH自由基清除率的影響 在浸提溫度為70 ℃,浸提時間為90 min,提取次數(shù)為1次的浸提條件下,研究料液比(1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100)(g/mL)對DPPH自由基清除率的影響。

1.2.2.4 浸提次數(shù)對DPPH自由基清除率的影響 在浸提溫度為70 ℃,浸提時間為90 min,料液比為1∶60(g/mL)的條件下,研究提取次數(shù)(1、2和3次)對DPPH自由基清除率的影響。

1.2.3 正交實驗設計 在單因素實驗的基礎上,固定提取次數(shù)為2次,選擇提取溫度、提取時間以及料液比三個因素,以提取物對DPPH自由基的清除率為指標,設計四因素三水平正交實驗,正交實驗表L9(34)如表1所示。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

1.2.4 提取物抗氧化性質(zhì)的評價 通過測定提取物對DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基的清除能力,來評價提取物的抗氧化性質(zhì)。本研究以濃度為0.1 mg/mL維生素C作為對照。

1.2.4.1 提取物對DPPH自由基的清除能力的測定 通過測定刺五加提取物的DPPH自由基清除率可以評定其抗氧化活性。采用Nsimba R Y等[10]和Shimada K等[11]的方法,并作適當修改。配制終濃度為20 μmol/L的DPPH無水乙醇溶液,提取物的凍干粉配制成濃度為0.5 mg/mL的溶液,將DPPH乙醇溶液與提取物樣品以1∶2的比例混合,室溫下避光反應30 min后于517 nm處測定其吸光值,同時利用無水乙醇進行空白實驗,平行實驗三次。

DPPH自由基清除率的計算公式如式(1):

式(1)

其中:A517空白-空白樣在517 nm處的吸光值;A517樣品-待測樣在517 nm處的吸光值。

1.2.4.2 提取物對超氧陰離子自由基的清除能力的測定 本實驗采用鄰苯三酚自氧化法[12]。在試管中加入4.5 mL pH8.2的磷酸緩沖溶液和1 mL濃度為0.5 mg/mL的刺五加提取物,25 ℃水浴加熱20 min,再加入于25 ℃預熱的0.4 mL濃度為25 mol/L的鄰苯三酚溶液,震蕩反應3 min后立即加入100 μL 3%抗壞血酸,混勻后于320 nm處測定其吸光度。

O2-·自由基清除率的計算公式如式(2):

式(2)

其中:A0-不加樣品時吸光度;A1-加入樣品的吸光度;A2-不加鄰苯三酚樣品的吸光度。

1.2.4.3 提取物對羥基自由基(·OH)清除能力的測定 該測定方法參照劉立新等[13]的方法,并略作改動。在試管中加入1.0 mL磷酸鹽緩沖溶液。0.2 mL番紅,1.0 mL EDTANa2-Fe2+,再加入0.5 mg/mL的刺五加提取物7.0 mL,最后加入H2O2溶液0.8 mL,于40 ℃水浴30 min后在520 nm處測定吸光度值,同時利用蒸餾水進行空白實驗,利用等體積的H2O2和蒸餾水溶液進行對照實驗,平行實驗三次。

羥自由基清除率的計算公式如式(3):

式(3)

其中:A517空白-空白樣在517 nm處的吸光值;A517樣品-待測樣在517 nm處的吸光值;A517對照-對照樣在517 nm處的吸光值。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 本研究中數(shù)據(jù)均以平均值±標準偏差表示;采用spss 16軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性分析;采用Excel(2003)軟件進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 浸提溫度對自由基清除率的影響 按照1.2.2.1的提取條件,結(jié)果如圖1所示。隨著反應溫度的升高,提取物對DPPH自由基清除清除率呈現(xiàn)先增大再減小的趨勢,且在70 ℃時清除率最高達到54.12%。當溫度高于80 ℃時,提取物對自由基的清除率開始下降。這可能是因為溫度升高,分子熱運動加劇,有利于有效成分的解吸和溶解,浸提效率增大,刺五加提取物中抗氧化活性物質(zhì)的濃度在不斷的增大。但當溫度過高時,部分有效成分開始降解,或者發(fā)生其他化學反應,從而提取物的抗氧化活性反而下降。考慮到能耗,選擇70 ℃為最佳反應溫度。

圖1 浸提溫度對DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the free radical scavenging rate of DPPH

2.1.2 浸提時間對自由基清除率的影響 按照1.2.2.2的提取條件,結(jié)果如圖2。提取物對DPPH自由基清除清除率隨著浸提時間的延長而增大,在90～150 min,清除率增加較緩慢。這是由于在提取的前期階段,提取物中抗氧化有效成分含量低,原料組織中有效成分含量高,濃度梯度大,抗氧化成分由原料內(nèi)部向浸提液中擴散的傳質(zhì)動力較大,因此隨著浸提時間的增加,浸提液中抗氧化成分的含量迅速增加。而隨著浸提時間的繼續(xù)增加,抗氧化成分的濃度梯度逐漸減小,故浸提效率降低。綜合考慮,浸提時間選擇90 min 較為適宜。

2.1.3 料液比對自由基清除率的影響 按照1.2.2.3的提取條件,結(jié)果如圖3。從圖中可以看出,隨著物料與浸提液比例的增大(即浸提體系刺五加勻漿液濃度的降低),提取物對DPPH自由基清除清除率呈不斷增加的趨勢,因為濃度差是滲透和擴散的主要推動力,故低濃度的浸提體系,抗氧化活性物質(zhì)的提取效率會增加。但當料液比大于1∶60(g/mL)以后,再繼續(xù)增大料液比,提取物的抗氧化效果增加不顯著,故選取料液比為1∶60(g/mL)。

圖3 料液比對DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the free radical scavenging rate of DPPH

2.1.4 浸提次數(shù)對自由基清除率的影響 按照1.2.2.4的提取條件,結(jié)果如圖4。增加提取次數(shù),可增大提取物對DPPH自由基清除率。2次提取比1次提取的提取物對DPPH自由基清除率提高了24.96%。當提取次數(shù)增加為3次時,提取物的抗氧化活性較2次時略有增加,統(tǒng)計分析結(jié)果為不顯著。綜合考慮能耗和經(jīng)濟性,提取次數(shù)為2次為宜。

圖4 浸提次數(shù)對DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effect of extraction times on the free radical scavenging rate of DPPH

2.2 正交實驗結(jié)果

正交實驗結(jié)果如表2所示。由直觀分析可知,當浸提溫度為70 ℃、提取時間90 min、料液比1∶80(g/mL)及提取次數(shù)2次,提取物對DPPH自由基的清除率最高為66.25%。通過極差分析可以看出,各因素對抗氧化活性的影響程度為C>A>B,即料液比>浸提溫度>浸提時間。因本研究的最優(yōu)實驗條件A2B3C3不在正交實驗中,故對此實驗條件進行驗證實驗。

表2 正交實驗設計方案及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design matrix and corresponding experimental results

2.3 驗證實驗及對其他自由基清除能力的分析

在反應溫度為70 ℃、提取時間110 min、料液比1∶80(g/mL),提取次數(shù)為2次的條件下,分別測定刺五加提取物對DPPH自由基、O2-·自由基及·OH自由基的清除率。同時,測定維生素C的抗氧化活性。結(jié)果如表3。從結(jié)果可以看出,在最優(yōu)實驗條件下,提取物對DPPH自由基、O2-·自由基、·OH自由基清除率分別為69.14%、31.69%、76.03%。且對DPPH自由基及·OH自由基的清除效果均好于維生素C,體現(xiàn)了良好的抗氧化性。

表3 驗證實驗結(jié)果及對O2-·自由基 和·OH自由基清除能力的分析(%)Table 3 Verification experiment and analysis of the scavenging rate of superoxide anion radical and hydroxyl radical(%)

事實上,刺五加提取物中含有多種具有功能活性的化學成分,如苷類、萜類、黃酮、多糖、維生素和礦質(zhì)元素等。近年來,國內(nèi)外學者對刺五加的化學成分進行了深入廣泛的研究,刺五加苷、紫丁香苷和異嗪皮啶等為主要活性成分[14-16]。李志峰等從刺五加提取物中分離鑒定了12個化合物,其中包括苷類、多糖、刺五加酮等化合物[17]。張濤等從長白山區(qū)刺五加中分離到了11個化合物,其中四種具有較好的自由基清除活性,其對DPPH自由基清除作用的IC50值分別為0.01、0.01、0.01、0.66 μg/mL[18]。本文未對提取物的化學成分進行分析,在未來的研究中將做進一步探討。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,刺五加熱水浸提物具有很好的抗氧化活性,通過正交實驗得到最佳的提取條件為:反應溫度為70 ℃、提取時間110 min、料液比1∶80(g/mL)、提取次數(shù)為2次。提取物對DPPH自由基、·OH自由基的清除率均好于維生素C,對O2-·自由基也有一定的清除效果。刺五加資源豐富且無毒副作用,提取物可以作為一種營養(yǎng)保健成分或天然的抗氧化劑添加到食品中,這對植物資源的綜合開發(fā)利用具有重要的意義。

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Antioxidant activity of water extraction fromAcanthopanacissenticosus

TIAN Song-yang1,YU Cheng-long2,3,+,XU Wei1,4，*,CHEN Tie-yun1,SUN Qing2,WANG Jun-yan1,LI Yan1

(1.Department of Food Science and Engineering,Harbin University,Harbin 150086,China;2.Heilongjiang Polytechnic,Harbin 150080,China;3.College of Wildlife Resources,Northeast Forest University,Harbin 150040,China;4.Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

WatersolublecomponentsofAcanthopanax senticosuswereextractedbyhotwater,extractionliquidonDPPHfreeradicalscavengingrateasevaluationindex,theeffectoftheextractiontemperature,extractiontime,solid-liquidratioandextractiontimesontheantioxidantactivitywerestudiedtoobtaintheoptimalextractioncondition.Orthogonaltestshowedthattheoptimialconditionswerereactiontemperatureof70 ℃,extractiontimeof110min,materialliquidratioof1∶80(g/mL),twiceextraction,andtheremovalratewastheDPPHfreeradicalscavengingratewas69.14%.Inaddition,DPPH,superoxideanionandhydroxylradicalscavengingactivitiesoftheextractionobtainedunderoptimalextractionconditionandvitaminCwereanalyzed.ResultsshowedthatsuperoxideanionradicalscavengingactivitiesoftheextractionwaslowerthanvitaminC(p<0.05),andscavengingratewas31.69%.However,DPPHandhydroxylradicalscavengingactivitiesoftheextractionwerehigherthanvitaminC(p<0.05),andhydroxylradicalscavengingratewas76.03%.

Acanthopanacis senticosus;extraction;antioxidantactivity;freeradical

2016-04-08

田松陽(1993-)，女，在讀本科生，研究方向：食品加工，E-mail:1714389909@qq.com。 于成龍(1983-)，男，講師，在讀博士研究生，研究方向：旅游管理及野生植物資源開發(fā)，E-mail:yuchenglong1983@126.com。

*通訊作者:徐微(1982-)，女，在讀博士研究生，講師，主要從事食品化學和營養(yǎng)學研究，E-mail:xweihappy@163.com。

黑龍江省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201510234001);哈爾濱學院學生科研項目(HXS20161344)。

TS255.1

A

1002-0306(2016)21-0110-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.013