大豆蛋白-殼寡糖聚合物的酶促合成及凝膠性質(zhì)

王 丹， 姜 淑 娟， 妥 彥 峰， 錢 方， 牟 光 慶,2

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034； 2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心， 黑龍江 哈爾濱 150030 )

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大豆蛋白-殼寡糖聚合物的酶促合成及凝膠性質(zhì)

王 丹1， 姜 淑 娟1， 妥 彥 峰1， 錢 方1， 牟 光 慶1,2

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034； 2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心， 黑龍江 哈爾濱 150030 )

采用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶促反應(yīng)合成大豆蛋白-殼寡糖聚合物，并對大豆蛋白-殼寡糖聚合物進行凝膠性質(zhì)與微觀結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果表明，酶促反應(yīng)最適條件為：反應(yīng)溫度37 ℃，酶添加量10 U/g，糖與蛋白質(zhì)量比0.8，蛋白質(zhì)量濃度6 mg/mL，反應(yīng)時間3 h。在此條件下，酶促合成聚合物的接枝率為57.49%；制備聚合物的熱致凝膠硬度、彈性與蛋白凝膠基本相同，但其酸化凝膠的硬度、彈性、保水性明顯高于大豆蛋白酸凝膠。

大豆蛋白；殼寡糖；聚合物；凝膠性質(zhì)

0 引 言

大豆蛋白是含量最為豐富的優(yōu)質(zhì)植物蛋白質(zhì)，廣泛應(yīng)用于食品中。對大豆蛋白進行酶法修飾可能改善蛋白功能性質(zhì)，并減少其他方法帶來的營養(yǎng)損失、有毒物質(zhì)等[1]。殼寡糖是自然界中唯一帶有正電荷陽離子堿性氨基多糖，含有親水性羥基與可反應(yīng)氨基，具有廣泛的生物學(xué)功能特性[2]。在殼寡糖存在條件下，利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化轉(zhuǎn)?；磻?yīng)修飾大豆蛋白，形成大豆蛋白-殼寡糖聚合物，可能改善大豆蛋白的凝膠性質(zhì)、保水性等。

駱輝等[3]應(yīng)用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化殼聚糖與明膠的酶促聚合并對其進行表征，發(fā)現(xiàn)溶菌酶可使其降解。黃文秀等[4]應(yīng)用酪蛋白非磷酸肽對大豆蛋白進行修飾，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表面疏水性是影響二者結(jié)合的關(guān)鍵因素，控制蛋白表面疏水性，以期促進最大化的正向聚合。Song等[5]對大豆蛋白與殼寡糖的結(jié)合狀況進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其表面疏水性與乳化性低于大豆蛋白，其乳化穩(wěn)定性明顯高于大豆蛋白。本實驗在殼寡糖存在條件下，利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化對大豆蛋白進行修飾研究，優(yōu)化酶促反應(yīng)條件。通過測定大豆蛋白-殼寡糖聚合物凝膠性質(zhì)，分析評價聚合物凝膠性質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材 料

大豆蛋白，山東嘉華保健品股份有限公司；殼寡糖，浙江金殼藥業(yè)有限公司；轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，泰興市一鳴生物制品有限公司。

SKD-200凱氏定氮儀，上海沛歐分析儀器有限公司；TA-XT plus物性測試儀，Stable Mico System；JSM-6460LV型掃描電子顯微鏡。

1.2 方 法

1.2.1 大豆蛋白-殼寡糖聚合物制備

將大豆蛋白溶液與殼寡糖溶液按照等體積混合均勻后，立即加入TGase酶液，酶添加量為10 U/g 蛋白質(zhì)[6]，混合均勻，在37 ℃水浴振蕩反應(yīng)一定時間后，收集生成的沉淀，并用蒸餾水反復(fù)清洗沉淀，收集沉淀凍干得大豆蛋白-殼寡糖聚合物。在相同條件下，以大豆蛋白溶液、大豆蛋白與殼寡糖混合溶液作為對照組。

1.2.2 聚合物制備條件優(yōu)化

采用單因素實驗研究反應(yīng)條件對聚合物接枝率的影響。實驗條件：糖和蛋白質(zhì)量比分別為0.6、0.8、1.0、1.2、1.4；蛋白質(zhì)量濃度分別為4、5、6、7、8、10 mg/mL；反應(yīng)時間分別為1、2、3、4、5 h，考察各條件對大豆蛋白-殼寡糖聚合物接枝率的影響[7]。

1.2.3 聚合物凝膠制備

熱致凝膠制備過程[8]：分別稱取單一大豆蛋白及聚合物，配制成蛋白質(zhì)量分數(shù)為8%的溶液。90 ℃加熱30 min，取出放置室溫冷卻形成凝膠，測定凝膠強度。

酸化凝膠制備過程[9]：分別稱取單一大豆蛋白及聚合物，配制成蛋白質(zhì)量分數(shù)為5%的溶液。按照1 g蛋白加入0.3 g葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯，攪拌均勻，室溫放置至形成凝膠后，置于室溫保存，測定凝膠強度。

1.2.4 酶活測定

應(yīng)用ELISA試劑盒測定轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶活，ELISA試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶水平，應(yīng)用試劑盒中標準品繪制標準曲線。

1.2.5 聚合物接枝率測定

采用凱氏定氮法[10]測定大豆蛋白-殼寡糖聚合物的含氮量來確定接枝率。大豆蛋白含氮量為11.86%，殼寡糖含氮量為6.97%。

接枝率計算公式[3]：

接枝率=m1/m0×100%

式中：m0為聚合物中大豆蛋白質(zhì)量，g；m1為聚合物中殼聚糖質(zhì)量，g。

1.2.6 聚合物溶解度測定

蛋白質(zhì)溶解性采用氮溶解指數(shù)(NSI)表示[11]。采用考馬斯亮藍法測定上清液中蛋白質(zhì)含量[12]。根據(jù)上清液中蛋白質(zhì)含量和溶液中蛋白質(zhì)含量計算NSI(%)。

1.2.7 凝膠性質(zhì)的測定

凝膠質(zhì)構(gòu)測定：使用新型物性測試儀。凝膠強度測試條件[13]：測試前速5 mm/s，測試速度2 mm/s，測試后速5 mm/s，測試距離為8 mm，使用P 0.5圓柱狀平頭探頭，測定凝膠硬度、彈性、黏性，重復(fù)3次取平均值。硬度以探頭下壓過程中的最大感應(yīng)力(g)表示。

凝膠保水性測定：依據(jù)離心法測定聚合物凝膠保水性[14]。

微觀結(jié)構(gòu)：將蛋白與殼寡糖混合溶液以及聚合物溶液涂片自然晾干，凝膠樣品依據(jù)戊二醛固定方法處理[15]，進行掃描電鏡分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 制備條件的優(yōu)化

不同反應(yīng)條件對大豆蛋白殼聚糖聚合物接枝率的影響如圖1～3所示。如圖1、2所示，在不同質(zhì)量比及不同蛋白濃度下聚合物接枝率皆呈現(xiàn)先增大后逐漸減小的趨勢?？赡苁且驗槠渲幸环N底物含量的增加，提高了蛋白質(zhì)與殼寡糖之間接觸機會,使得反應(yīng)向有利方向進行,從而提高了聚合物接枝率。當(dāng)質(zhì)量比或蛋白質(zhì)濃度增加，一種反應(yīng)物濃度增加到一定程度，反應(yīng)已達到飽和,聚合反應(yīng)不再進行,而使得聚合物接枝率降低。

如圖3所示，在不同反應(yīng)時間下，接枝率隨時間的延長呈先增大后不變的趨勢，可能由于當(dāng)反應(yīng)物質(zhì)量比及蛋白質(zhì)量濃度一定時，隨著反應(yīng)時間增加，聚合物接枝反應(yīng)不再繼續(xù)。當(dāng)反應(yīng)到一定程度，溶液中底物已反應(yīng)完全，聚合物接枝率在達到一定程度后不再增大[16]。結(jié)果表明，聚合反應(yīng)適宜條件為溫度37 ℃，酶添加量10 U/g,殼寡糖與蛋白質(zhì)量比0.8，蛋白質(zhì)量濃度6 mg/mL，反應(yīng)時間3 h。在此條件下制備聚合物，其接枝率為57.49%。

圖1 糖與蛋白質(zhì)量比對聚合物接枝率的影響

圖2 蛋白質(zhì)量濃度對聚合物接枝率的影響

圖3 反應(yīng)時間對聚合物接枝率的影響

2.2 溶解性

大豆蛋白-殼寡糖聚合物的溶解度隨pH變化如圖4所示。與大豆蛋白相比，聚合物溶解度在pH 4.6～5.5有較明顯地提高。在其他pH下都顯著降低，并且聚合物的等電點向酸性方向偏移，這可能是因為殼寡糖的引入改變蛋白分子的電荷分布，聚合物在等電點處的溶解性與大豆蛋白相比，變化不顯著。

圖4 pH對大豆蛋白及其聚合物溶解性的影響

2.3 凝膠性質(zhì)

由表1可知，熱致凝膠中聚合物凝膠黏性明顯低于大豆蛋白，凝膠硬度、彈性、保水性與蛋白凝膠無顯著差異。酸化凝膠中聚合物硬度、彈性、保水性明顯高于大豆蛋白，而黏性顯著低于大豆蛋白。這可能由于聚合物與大豆蛋白結(jié)構(gòu)不同，且二者凝膠機理不同導(dǎo)致的。

表1 大豆蛋白及其聚合物的凝膠性質(zhì)對比

2.4 微觀結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)反映了蛋白質(zhì)分子的狀態(tài)，對蛋白質(zhì)功能特性起著重要的作用。將大豆蛋白與殼寡糖混合物及聚合物溶液在空氣中自然晾干后，用掃描電鏡觀察它們的結(jié)構(gòu)特征。 如圖5所示，大豆蛋白與殼寡糖反應(yīng)后，聚合物其表面結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，與混合物相比，聚合物結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)不規(guī)則交聯(lián)片狀，大豆蛋白球形狀態(tài)消失。蛋白酸化凝膠無片層狀結(jié)構(gòu)，表面呈現(xiàn)凹凸不平、有較少網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)，而聚合物酸化凝膠有較小球狀連接在一起，結(jié)構(gòu)緊密，呈現(xiàn)不規(guī)則狀。可能由于凝膠形成機理不同，導(dǎo)致電鏡觀察凝膠結(jié)構(gòu)明顯不同。

圖5 電子掃描顯微鏡圖譜

3 結(jié) 論

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)大豆蛋白-殼寡糖聚合物適宜條件為：糖與蛋白質(zhì)量比0.8、大豆蛋白質(zhì)量濃度6 mg/mL、反應(yīng)時間3 h，聚合物接枝率達到最大57.49%。聚合物溶解性在部分pH范圍內(nèi)低于大豆蛋白。熱致凝膠中聚合物凝膠硬度、彈性與蛋白凝膠基本無明顯差異；酸化凝膠中聚合物凝膠的硬度、彈性、保水性明顯高于大豆蛋白膠。微觀結(jié)構(gòu)觀察表明聚合物形成結(jié)實緊密的酸凝膠。

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Enzymatic preparation of soybean protein-oligochitosan polymer and its gel properties

WANG Dan1, JIANG Shujuan1, TUO Yanfeng1, QIAN Fang1, MU Guangqing1,2

( 1.School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China； 2.Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China )

Transglutaminase (TGase) was used to prepare soybean protein-oligosaccharide polymer, and its gel properties were studied. The result showed that the optimum reaction condition was protein concentration of 6 mg/mL, oligochitosan and protein in the mass ratio of 0.8, TGase addition of 10 U/g at 37 ℃ in 3 h. Under the condition, the graft degree of protein-oligochitosan polymer could reach to 57.49%. The polymers had little change in the hardness and elasticity of heat-induced gel compared with unmodified protein; but the hardness, elasticity and water holding capacity of its acidified gel were significantly higher than that of soybean protein.

soybean protein; oligochitosan; polymer; gel properties

2015-03-13.

國家自然科學(xué)基金資助項目(31501513)；國家“十二五”科技支撐計劃項目(2013BAD18B04)；遼寧省科學(xué)計劃項目(2013229027).

王 丹(1989-)，女，碩士研究生；通信作者：姜淑娟(1981-)，女，講師.

TS201.7

A

1674-1404(2016)06-0391-04

WANG Dan, JIANG Shujuan, TUO Yanfeng, QIAN Fang, MU Guangqing. Enzymatic preparation of soybean protein-oligochitosan polymer and its gel properties[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2016, 35(6): 391-394.