重組桿狀病毒表達(dá)Sf-caspase-1雙鏈RNA對昆蟲細(xì)胞凋亡的影響

歐艷梅，許曉東

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

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重組桿狀病毒表達(dá)Sf-caspase-1雙鏈RNA對昆蟲細(xì)胞凋亡的影響

歐艷梅，許曉東

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

【目的】 構(gòu)建包含Sf-caspase-1反向重復(fù)序列的重組桿狀病毒vAcMNPV-dsCasp，并在草地貪夜蛾(Sf9)細(xì)胞中表達(dá)Sf-caspase-1雙鏈RNA，用以抑制Sf9細(xì)胞的凋亡，為未來優(yōu)化桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)提供試驗依據(jù)。【方法】 將Sf-caspase-1反向重復(fù)序列構(gòu)建到pBac5上，與AcMNPV Bacmid共轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞產(chǎn)生重組桿狀病毒，用RT-PCR和PI活細(xì)胞染色方法，分別檢測Sf-caspase-1 mRNA含量及Sf9細(xì)胞的凋亡情況?！窘Y(jié)果】 PCR和雙酶切檢測結(jié)果表明，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pBac5-dsCasp，并得到重組桿狀病毒vAcMNPV-dsCasp。PI染色結(jié)果表明，相比野生型病毒vAcMNPV,重組桿狀病毒vAcMNPV-dsCasp能夠抑制Sf9細(xì)胞的凋亡。RT-PCR結(jié)果表明，vAcMNPV-dsCasp感染的Sf9細(xì)胞中Sf-caspase-1 mRNA含量明顯下降。【結(jié)論】 在重組桿狀病毒上表達(dá)Sf-caspase-1雙鏈RNA確實能夠沉默Sf-caspase-1，從而抑制細(xì)胞凋亡。

vAcMNPV；RNAi；dsRNA；Sf-caspase-1；細(xì)胞凋亡；桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)

RNA干擾(RNAi)是生物體內(nèi)一種進(jìn)化上保守的可抵御轉(zhuǎn)基因或外來病毒侵犯的防御機(jī)制。其原理是，將與靶基因mRNA具有同源互補(bǔ)序列的雙鏈RNA(dsRNA) 導(dǎo)入細(xì)胞，能特異性地降解靶基因的mRNA，從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失[1-3]。RNAi現(xiàn)象由Fire等[3]在線蟲中發(fā)現(xiàn)后，被廣泛應(yīng)用于沉默目的基因，以研究相關(guān)基因的功能。

目前，RNAi技術(shù)已成功應(yīng)用于線蟲、果蠅、真菌及哺乳動物等生物基因功能的研究[4-6]。而桿狀病毒是特異感染節(jié)肢動物的DNA病毒，主要包括核型多角體病毒屬(NPV)和顆粒體病毒屬(GV)，苜蓿銀紋夜蛾多核型多角體病毒(AcMNPV)是桿狀病毒的模式種。自從1983年Smith等[7]首次將桿狀病毒運(yùn)用于表達(dá)系統(tǒng)以來，針對桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)的改造研究一直進(jìn)展緩慢，其中延長感染細(xì)胞存活期以提高目的蛋白表達(dá)量是優(yōu)化桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的一種重要方式，而宿主細(xì)胞的存活時間與細(xì)胞凋亡有著密切的關(guān)系。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種程序性死亡過程[8-9]，它的主要作用是清除機(jī)體內(nèi)不正?；虿恍枰募?xì)胞，凋亡過程中細(xì)胞會發(fā)生一系列的形態(tài)變化，如DNA斷裂、染色體聚集、產(chǎn)生膜泡等[8,10]。細(xì)胞凋亡的信號通路主要有2個：膜受體通路和caspase(cysteinyl aspartate specific proteinase) 激活的生物化學(xué)途徑，其中細(xì)胞調(diào)控caspase活性對細(xì)胞凋亡非常重要[11]。

利用RNAi技術(shù)延長感染細(xì)胞存活期的研究較多。2007年，臺灣的一個研究組用RNA干擾載體在草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda，Sf9)細(xì)胞中表達(dá)Sf-caspase-1 dsRNA，成功沉默了細(xì)胞中的Sf-caspase-1，從而延長了細(xì)胞的生存時間，并篩選出了抑制Sf9細(xì)胞凋亡的細(xì)胞系[12]。2008年，Li等[13]研究發(fā)現(xiàn)，刪除AcMNPV ac68，可將幼蟲半數(shù)致死時間延長16 h。2009年，Shen等[14]發(fā)現(xiàn),敲除家蠶核型多角體病毒(BombyxmoriNuclear Polyhydrosis Virus,BmNPV)中同源基因Orf74,可將其幼蟲存活時間延長14.7 h。2013年，Wu等[15]用RNA干擾沉默了細(xì)胞周期蛋白D，發(fā)現(xiàn)目的蛋白表達(dá)量提高了2倍。但目前尚未見在重組桿狀病毒載體上表達(dá)dsRNA來抑制細(xì)胞凋亡的報道。本研究運(yùn)用RNAi技術(shù)，構(gòu)建包含Sf-caspase-1 dsRNA的重組桿狀病毒vAcMNPV-dsCasp，并在Sf9細(xì)胞中成功表達(dá)Sf-caspase-1 dsRNA，沉默Sf9細(xì)胞中的Sf-caspase-1，從而抑制Sf9細(xì)胞的凋亡，以期為桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)化提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞

大腸桿菌Top10細(xì)胞、pTriEx、Sf9細(xì)胞皆由西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子病毒學(xué)實驗室所保存；載體pBac5購自Novagen公司；AcMNPV Bacmid來源于University of Reading, Prof. Ian Jones實驗室，其與外源蛋白的重組效率為100%[16]。

1.2 主要試劑

反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自ABM生物公司；實時定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司；Taq酶、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、UNIQ-10柱式病毒基因組抽提試劑盒均購自上海生工生物工程有限公司；柱式DNAback試劑盒購自北京天恩澤基因科技有限公司；限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、BamHⅠ、EcoRⅠ、NcoⅠ和其同尾酶BspHⅠ及T4 DNA連接酶均購自Fermentas公司；DL5000 DNA Marker和DL2000 DNA Marker購自Vazyme公司；酵母浸粉和蛋白胨均購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；FuGENE?HD轉(zhuǎn)染試劑、碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)購自Roche公司；胎牛血清和昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基購自Thermo Scientific HyClone公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

參照NCBI中草地貪夜蛾 caspase-1 mRNA序列(序列號1814278),用Primer Premier 5和VectorNTI軟件設(shè)計特異性擴(kuò)增引物(表1)。引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4Sf-caspase-1 dsRNA重組質(zhì)粒pBac5-dsCasp的構(gòu)建

1.4.1 Sf-forward-caspase-1和Sf-reverse-caspase-1片段的擴(kuò)增 以Sf9細(xì)胞基因組為模板，分別擴(kuò)增Sf-forward-caspase-1及Sf-reverse-caspase-1片段。反應(yīng)體系為：Sf9 細(xì)胞100 ng，5 mmol/L MgCl22.5 μL，10×TaqBuffer 2.5 μL，25 mmol/L dNTP 0.5 μL，10 μmol/L上游引物Sf-caspase-F 1 μL，10 μmol/L下游引物Sf-forward-caspaseR-EcoRⅠ或Sf-reverse-caspaseR-EcoRⅠ 1 μL，Taq酶 0.25 μL，ddH2O補(bǔ)足25 μL；反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃ 30 s， 58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；最后72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，再用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后于-20 ℃保存。

表 1 本試驗中 PCR和RT-PCR所用引物

1.4.2 重組質(zhì)粒pBac5-dsCasp的構(gòu)建 用NcoⅠ和EcoRⅠ雙酶切載體pBac5，然后切膠回收。用EcoRⅠ和NcoⅠ同尾酶BspHⅠ對Sf-forward-caspase-1 PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，然后用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收。將Sf-forward-caspase-1 PCR酶切產(chǎn)物和酶切后的載體pBac5用T4 DNA連接酶于22 ℃連接1 h，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含50 μg/mL氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)，挑單菌落進(jìn)行PCR鑒定；然后將陽性菌落接種至含50 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r/min過夜搖菌，用質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒；用BamHⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定成功的重組質(zhì)粒為pBac5-dsCasp-forward，再用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切該質(zhì)粒，膠回收后待用。Sf-reverse-caspase-1 PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，然后按構(gòu)建重組質(zhì)粒pBac5-dsCasp-forward的步驟，把Sf-reverse-caspase-1 PCR產(chǎn)物連接到pBac5-dsCasp-forward載體上，XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定篩選陽性克隆，命名為pBac5-dsCasp。

1.5 重組桿狀病毒的構(gòu)建

用pBac5和pBac5-dsCasp分別與線性化的AcMNPV Bacmid共轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，轉(zhuǎn)染過程如下：先向1.5 mL離心管中加入100 μL無菌水，然后加入3 μL線性化的AcMNPV Bacmid，再分別加入5 μL的pBac5和pBac5-dsCasp，充分混勻，最后加入5 μL轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻，靜置15～30 min。將Sf9細(xì)胞鋪入6孔板中，靜置15 min使細(xì)胞貼壁，然后將上述混合好的溶液逐滴加入到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，混勻，28 ℃培養(yǎng)5 d后分別收集重組病毒vAcMNPV和vAcMNPV-dsCasp(即上清液)。取收集的病毒上清100 μL再次感染Sf9細(xì)胞，28 ℃培養(yǎng)3 d后收集病毒，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 重組病毒滴度的Q-PCR測定

取重組病毒vAcMNPV和vAcMNPV-dsCasp各100 μL，按UNIQ-10柱式病毒基因組抽提試劑盒操作手冊提取重組病毒vAcMNPV和vAcMNPV-dsCasp基因組。取10 μL pTriEx質(zhì)粒稀釋到100 μL，測定OD260，得到質(zhì)粒濃度；并將pTriEx質(zhì)粒梯度稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。用1629FO和1629RO為引物進(jìn)行Q-PCR，反應(yīng)體系如下：各稀釋梯度的質(zhì)粒或病毒DNA 2 μL，2×SYBR Premix ExTaqⅡ 12.5 μL，1629FO(10 μmol/L) 1 μL，1629RO(10 μmol/L) 1 μL，超純水 8.5 μL。采用兩步法PCR，第1步，95 ℃預(yù)變性30 s；第2步， 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；60 ℃ 5 s，每個循環(huán)增加0.5 ℃直到95 ℃。PCR結(jié)束后，用CFX96定量分析軟件分析數(shù)據(jù)。

1.7Sf9細(xì)胞凋亡的PI活細(xì)胞染色法檢測

根據(jù)1.6中得到的病毒滴度，用重組病毒vAcMNPV和vAcMNPV-dsCasp平行感染Sf9細(xì)胞，感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection，MOI)分別為5，20，50和100，并設(shè)無病毒感染的Sf9細(xì)胞作為陰性對照。5 d后收集細(xì)胞到1.5 mL離心管中，600g離心1 min，PBS(pH 7.4)清洗，加100 μL PBS懸浮后，分別加入1 μL PI(100 μg/mL)至各個樣品中，15 min后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.8Sf9細(xì)胞中Sf-caspase-1 mRNA含量的RT-PCR檢測

重組病毒vAcMNPV和vAcMNPV-dsCasp再次平行感染Sf9細(xì)胞4 d，用無病毒感染的Sf9細(xì)胞作為陰性對照。根據(jù)康為世紀(jì)生物公司的TRIzol總RNA提取操作手冊提取總RNA。以RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，反應(yīng)體系如下：RNA 1 μL，5×reaction Mix 2 μL，RNase Free ddH2O 7 μL；反應(yīng)程序為：25 ℃ 10 min，42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。將cDNA稀釋20倍，作為PCR模板，Sf-casp1mRNA-forward 和Sf-casp1mRNA-reverse、Sf-casp1dsRNA-forward和Sf-casp1dsRNA-reverse、ActinF和ActinR分別為引物進(jìn)行RT-PCR，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并用Image-Pro Plus 6.0分析光密度，比較重組病毒vAcMNPV和vAcMNPV-dsCasp感染Sf9細(xì)胞中caspase mRNA、caspase dsRNA和Actin mRNA的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pBac5-dsCasp的構(gòu)建

構(gòu)建的重組質(zhì)粒pBac5-dsCasp-forward用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定，得到的900 bp DNA片段與預(yù)期(圖1A)一致，說明重組質(zhì)粒pBac5-dsCasp-forward 構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒pBac5-dsCasp用XhoⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，得到長800 bp的片段，其大小也與預(yù)期相吻合(圖1B)，說明重組質(zhì)粒pBac5-dsCasp構(gòu)建成功。

圖 1 pBac5-dsCasp-forward(A)及pBac5-dsCasp(B)的雙酶切鑒定

2.2Sf9細(xì)胞凋亡情況檢測

pBac5-dsCasp重組質(zhì)粒包含Sf-caspase-1 800 bp反向重復(fù)序列Sf-forward-caspase-1及Sf-reverse-caspase-1和100 bp間隔區(qū)域。該質(zhì)粒與AcMNPV Bacmid共轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞后，產(chǎn)生重組桿狀病毒vAcMNPV-dsCasp(圖2)。其在Sf9細(xì)胞中表達(dá)Sf-caspase-1 dsRNA，可以沉默Sf9細(xì)胞中Sf-caspase-1的表達(dá)。

圖 2 重組桿狀病毒vAcMNPV-dsCasp的構(gòu)建圖譜和Sf-caspase-1 dsRNA的內(nèi)源性表達(dá)

PI為一種核酸染料，不能透過完整的細(xì)胞膜，可用于凋亡中晚期和死細(xì)胞的染色。PI染色后，用流式細(xì)胞儀檢測，峰值越偏右，說明被PI染色的細(xì)胞越多，即死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞越多。如圖3所示，PI染色后，相比vAcMNPV病毒感染的Sf9細(xì)胞，重組病毒vAcMNPV-dsCasp感染Sf9細(xì)胞的峰值整體向左移動。以Sf9細(xì)胞為參考設(shè)門，門內(nèi)細(xì)胞幾何平均值即熒光強(qiáng)度平均值見表2。由表2可知，vAcMNPV-dsCasp感染Sf9細(xì)胞的熒光強(qiáng)度平均值比vAcMNPV病毒感染Sf9細(xì)胞降低20%，說明重組病毒vAcMNPV-dsCasp感染Sf9細(xì)胞后，抑制了Sf9細(xì)胞的凋亡。

圖 3 基于PI染色的Sf9細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測

表 2 Sf9細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

2.3Sf9細(xì)胞中的Sf-caspase-1 mRNA 含量

用RT-PCR檢測Sf-caspase1 RNA含量，以確定重組病毒vAcMNPV-dsCasp能否沉默Sf- caspase-1，結(jié)果見圖4和表3。由圖4和表3可知，相對于感染vAcMNPV的Sf9細(xì)胞，vAcMNPV-dsCasp感染Sf9細(xì)胞的光密度值降幅為51.8%，表明感染vAcMNPV-dsCasp的Sf9細(xì)胞表達(dá)Sf-caspase1 dsRNA后降低了Sf-caspase-1 RNA含量，說明重組型病毒vAcMNPV-dsCasp表達(dá)的Sf-caspase-1 dsRNA確實降低了Sf-caspase-1的含量，這與PI染色檢測細(xì)胞凋亡的結(jié)果相符。

圖 4 vAcMNPV-dsCasp感染Sf9細(xì)胞后Sf-caspase-1 mRNA含量

表 3 Sf-caspase-1 mRNA的光密度值

3 討 論

有研究表明，體外導(dǎo)入雙鏈RNA到粉紋夜蛾(Trichoplusini)、草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)細(xì)胞中能夠沉默目的蛋白[17-19]。但是，目前主要通過體外直接導(dǎo)入雙鏈RNA或用RNAi表達(dá)質(zhì)粒直接表達(dá)雙鏈RNA，篩選出相應(yīng)的細(xì)胞系，還未見直接在重組桿狀病毒上表達(dá)雙鏈RNA抑制蛋白表達(dá)的相關(guān)研究。

1983年，Smith等[7]成功將桿狀病毒作為外源蛋白表達(dá)載體，表達(dá)外源蛋白。人們運(yùn)用各種方法改造桿狀病毒-昆蟲表達(dá)系統(tǒng)以提高外源蛋白表達(dá)的產(chǎn)量。其中，Lin等[12]在Sf9細(xì)胞中用RNA干擾表達(dá)載體表達(dá)了Sf-caspase-1的雙鏈RNA以沉默Sf-caspase-1，同時篩選出了細(xì)胞系。但是，將Sf-caspase-1反向重復(fù)序列構(gòu)建在昆蟲染色體上可能會導(dǎo)致昆蟲細(xì)胞失去凋亡通路，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞系的退化。因此，若能在重組桿狀病毒上表達(dá)Sf-caspase-1雙鏈RNA，則在病毒感染細(xì)胞的同時，還可抑制細(xì)胞凋亡，即重組桿狀病毒能夠延長Sf9細(xì)胞的存活時間，且不會導(dǎo)致Sf9細(xì)胞系的退化。

本研究將表達(dá)Sf-caspase-1雙鏈RNA的重組質(zhì)粒直接重組到vAcMNPV病毒上，這個重組桿狀病毒能夠抑制宿主細(xì)胞Sf9細(xì)胞的凋亡，從而延長了Sf9細(xì)胞的存活時間，而桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是瞬時表達(dá)系統(tǒng)，延長Sf9細(xì)胞的存活時間可大大提高外源蛋白的表達(dá)量，因此，本研究構(gòu)建的重組桿狀病毒對于桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)化有重要的意義。

4 結(jié) 論

本研究將Sf-caspase-1 dsRNA的反向互補(bǔ)序列成功重組到桿狀病毒vAcMNPV上，使重組桿狀病毒vAcMNPV-dsCasp在Sf9細(xì)胞中表達(dá)Sf-caspase-1 dsRNA，進(jìn)而起到沉默Sf-caspase-1的作用，以抑制Sf9細(xì)胞的凋亡。檢測結(jié)果表明，重組桿狀病毒vAcMNPV-dsCasp感染細(xì)胞后會使細(xì)胞中Sf-caspase-1 mRNA的含量下降，從而成功抑制細(xì)胞凋亡。這為未來優(yōu)化桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)提供了重要的基礎(chǔ)。

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Influence of insect cell apoptosis by expression ofSf-caspase-1 double-stranded RNA in recombinant baculovirus

OU Yanmei,XU Xiaodong

(CollegeofLifeSciences,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 This study constructed recombinant baculovirus containing inverted repeat sequence ofSf-caspase-1.The recombinant baculovirus expressedSf-caspase-1 double-stranded RNA and inhibited apoptosis ofSpodopterafrugiperda(Sf9) cell.【Method】 Inverted repeat sequence ofSf-caspase-1 was inserted into pBac5 before being co-transfected with AcMNPV Bacmid into Sf9 cells to produce recombinant baculovirus.RT-PCR and PI vital cell staining were used to detect the content ofSf-caspase-1 mRNA and apoptosis of Sf9,respectively.【Result】 PCR and restriction enzyme digestion showed that pBac5-dsCasp vector was built successfully.The recombinant virus vAcMNPV-dsCasp was obtained by recombination between Bacmid and pBac5-dsCasp.Comparing with the cell infected by vAcMNPV,RT-PCR and PI vital cell staining indicated that vAcMNPV-dsCasp inhibited cell apoptosis and the content ofSf-caspase1 mRNA declined.【Conclusion】 Expression ofSf-caspase-1 double-strained RNA in recombinant baculvirus silencedSf-caspase-1,and inhibited cell apoptosis.

vAcMNPV；RNAi；dsRNA；Sf-caspase-1；cell apoptosis;baculovirus expression system

時間:2016-10-09 10:08

10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.11.027

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20161009.1008.054.html

2015-05-29

陜西省自然科學(xué)基金項目(2011JM3002)

歐艷梅(1988-)，女，湖南寧遠(yuǎn)人，在讀碩士，主要從事桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)化研究。 E-mail：ouyanmei19881223@163.com

許曉東(1967-)，男，黑龍江甘南人，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事分子病毒學(xué)研究。E-mail：xuxd@nwsuaf.edu.cn

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1671-9387(2016)11-0187-06