石柑子藥材的HPLC指紋圖譜研究Δ

羅文匯，劉布鳴，彭麗詩，邱宏聰，陳 昭，江潔怡（1.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣州 510095；2.廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510095；.廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院，南寧 50022；.廣東仙樂制藥有限公司，廣東汕頭 51501）

石柑子藥材的HPLC指紋圖譜研究Δ

羅文匯1，2＊，劉布鳴3，彭麗詩4，邱宏聰3，陳 昭1，2，江潔怡1，2（1.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣州 510095；2.廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510095；3.廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院，南寧 530022；4.廣東仙樂制藥有限公司，廣東汕頭 515041）

目的：建立石柑子藥材的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜。方法：采用HPLC法。色譜柱為Thermo Hypersil ODS-2，流動相為甲醇-0.4%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 ml/min，檢測波長為300 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μl。以阿魏酰酪胺色譜峰為參照峰，測定24批藥材的HPLC圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004A版）進(jìn)行共有峰鑒定和相似度評價。結(jié)果：24批石柑子藥材有16個共有峰，其中21批藥材的相似度＞0.8。結(jié)論：該研究所建指紋圖譜專屬性強(qiáng)、結(jié)果穩(wěn)定，可為石柑子藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

石柑子；高效液相色譜法；指紋圖譜

石柑子為南方地區(qū)習(xí)用中草藥，為天南星科石蒲藤Pothos chienesis（Raf.）Merr.的干燥全草，主要分布于廣東、廣西、臺灣等省區(qū)。具有行氣止痛、消積除脹、祛風(fēng)除濕、散瘀解毒的功效，多用于治療心胃氣痛、疝氣、小兒疳積、食積腹脹、晚期血吸蟲病、肝脾腫大、風(fēng)濕痹痛、腳氣腫痛、跌打損傷、骨折、聤耳流膿、鼻淵等癥[1-2]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，石柑子含有苷類、生物堿、黃酮、蒽醌、香豆素、萜類內(nèi)酯、甾體、三萜類、糖類、有機(jī)酸、氨基酸、蛋白質(zhì)、揮發(fā)油和油脂類等化合物[3-6]。因此，筆者采用高效液相色譜法（HPLC）建立了石柑子藥材的指紋圖譜[7-8]分析方法，旨在為有效控制其質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

e2695-2489型HPLC儀，包括PAD二極管陣列檢測器、四元梯度泵、Empower2數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng)（美國Waters公司）；Advantage A10超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；XS205DU型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：250 W，頻率：40 kHz）；HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市科析儀器有限公司）。

1.2 試劑

阿魏酰酪胺對照品（筆者自制，經(jīng)H譜、C譜和質(zhì)譜確定結(jié)構(gòu)，經(jīng)HPLC測定純度≥99.5%）；丁香酸對照品（筆者自制，經(jīng)H譜、C譜和質(zhì)譜確定結(jié)構(gòu)，經(jīng)HPLC測定純度≥99.0%）；香草酸對照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號：X-030-140801，純度＞98%）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

石柑子藥材均由廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院提供（見表1），經(jīng)該院賴茂祥研究員鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Hypersil ODS-2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.4%磷酸溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表2）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：300 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μl。

表1 石柑子藥材來源Tab 1 Origin of Pothos chinensi

表2 梯度洗脫程序Tab 2 Gradient elution program

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱定阿魏酰酪胺、丁香酸、香草酸對照品適量，加50%甲醇制成阿魏酰酪胺、丁香酸、香草酸質(zhì)量濃度分別為60.42、120.14、71.25 μg/ml的混合對照品溶液，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取本品粉末（過4號篩）約2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 ml，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，精密量取續(xù)濾液10 ml，蒸干，殘渣加50%甲醇溶解并定容至2 ml，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，以阿魏酰酪胺峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，各共有峰相對保留時間的RSD＜1%，相對峰面積的RSD＜2%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號：S20）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、16、24 h時按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以阿魏酰酪胺峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均＜3%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品（編號：S20）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以阿魏酰酪胺峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均＜3%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜的建立及共有峰的指認(rèn)

2.4.1 指紋圖譜的建立 取24批石柑子藥材粉末適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，得特征指紋圖譜，詳見圖1。

圖1 24批石柑子藥材的高效液相色譜疊加圖Fig 1 HPLC overlay chromatograms of 24 batches of P.chienesis

2.4.2 石柑子對照圖譜的生成 采用國家藥典委員會頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004 A版），選取時間窗寬度為0.1 min，以中位數(shù)生成對照譜圖，經(jīng)過多點(diǎn)校正后自動匹配，生成石柑子指紋圖譜共有模式，并計算24批石柑子藥材的指紋圖譜與該共有模式的相似度。結(jié)果表明，24批石柑子藥材共有特征峰16個，其中2號峰為香草酸，3號峰為丁香酸，11號峰為阿魏酰酪胺；由于阿魏酰酪胺色譜峰出峰時間居中且穩(wěn)定，與相鄰峰分離良好，特征明顯，因此選擇阿魏酰酪胺色譜峰為參照峰，詳見圖2。

圖2 24批石柑子藥材的高效液相色譜共有峰Fig 2 HPLC chromatograms of the common peaks 24 batches of P.chienesis

2.4.3 相對保留時間和相對峰面積分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004 A版）對24批石柑子藥材的色譜進(jìn)行比較分析。24批石柑子藥材指紋圖譜相對保留時間和相對峰面積見表3、表4。

2.4.4 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004 A版）對24批石柑子藥材的色譜進(jìn)行比較分析。結(jié)果，24批藥材中，12批樣品的相似度在0.9以上，9批樣品的相似度在0.8～0.9之間，其余3批樣品的相似度在0.7～0.8之間（見表5）。對相似度在0.8以下的3批樣品進(jìn)行分析，11號樣品中莖的部分較多而葉的部分較少，從而導(dǎo)致化學(xué)成分有所不同，共有峰較少；12號樣品生長年限較短，葉片較幼嫩，葉綠素較多，成分富集不夠；22號樣品在貯存過程中有少量霉變，可能導(dǎo)致部分成分發(fā)生變化。由此表明，石柑子藥材的質(zhì)量受到生長年限、采收加工和貯存條件等諸多因素的影響。

3 討論

本研究收集的24批石柑子藥材均采自廣西瑤族山區(qū)或購買于廣西當(dāng)?shù)厮幉氖袌?，具有良好的道地性和代表性。通過對流動相體系、色譜柱、檢測波長、柱溫和流速以及供試品提取方法、提取溶劑和提取時間進(jìn)行優(yōu)選，最終確定了石柑子HPLC指紋圖譜方法。經(jīng)方法學(xué)考察，結(jié)果符合要求。

表3 24批石柑子藥材的指紋圖譜共有峰相對保留時間Tab 3 Relative retention time of fingerprint common peaks of the 24 batches of P.chinensi

表4 24批石柑子藥材的指紋圖譜共有峰相對峰面積Tab 4 Relative peak areas of fingerprint common peaks of the 24 batches of P.chinensi

筆者采用上述方法，確定了石柑子藥材的16個共有峰，通過與對照品圖譜的比對，指認(rèn)了其中2、3和11號色譜峰，分別為香草酸、丁香酸和阿魏酰酪胺。由于β-谷甾醇的最大吸收波長在200 nm附近，在300 nm波長處無紫外吸收，故β-谷甾醇的色譜峰在指紋圖譜上未顯示。

中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)在共有模式的生成過程中有中位數(shù)和平均數(shù)兩種計算方法，筆者發(fā)現(xiàn)對于同一種樣品而言，兩種計算結(jié)果有一定的區(qū)別。因?yàn)樗伤幉木鶠樘烊划a(chǎn)物，受海拔、氣候、生長條件等自然因素影響，各批次間差異較大。對于個別差異過大的樣品應(yīng)該降低其在對照圖譜生成過程中所占的比例，故認(rèn)為采用中位數(shù)的算法比較合理。

表5 24批石柑子藥材相似度評價結(jié)果Tab 5 Similarity of fingerprint common peaks of the 24 batches of P.chinensi

通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件生成24批石柑子藥材HPLC指紋圖譜的共有模式，可作為其特征圖譜。16個共有峰在24批石柑子藥材HPLC指紋圖譜中均穩(wěn)定存在，但各個特征峰的相對含量分布在各批次的石柑子藥材之間存在差異。

綜上所述，本研究所建指紋圖譜專屬性強(qiáng)、結(jié)果穩(wěn)定，可為石柑子藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

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Study on the HPLC Fingerprint of Pothos chinensis

LUO Wenhui1，2，LIU Buming3，PENG Lishi4，QIU Hongcong3，CHEN Zhao1，2，JIANG Jieyi1，2（1.Guangdong Provincial Institute of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510095，China；2.Guangdong Provincial Key Laboratory of R&D in Traditional Chinese Medicine，Guangzhou，510095，China；3.Guangxi Zhuang Autonomous Region Institute of Chinese Medicine and Pharmaceutical Science，Nanning 530022，China；4.Guangdong Sirio Pharma Co.，Ltd.，Guangdong Shantou 515041，China）

OBJECTIVE：To establish the HPLC fingerprint of Pothos chinensis.METHODS：HPLC was performed on the column of Thermo Hypersil ODS-2 with mobile phase of methanol-0.4%phosphoric acid solution（gradient elution）at a flow rate of 1.0 ml/min，detection wavelength was 300 nm，column temperature was 30℃，and injection volume was 10 μl.Using ferulic acid tyramine peak as reference，HPLC spectrum of 24 batches of medicinal herbs was determined，and TCM Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System（2004 edition）was adopted for common peak identification and similarity evaluation.RESULTS：There were 16 common peaks totally in the 24 batches，similarity of the 21 batches of medicinal materials were higher than 0.8. CONCLUSIONS：The established fingerprint is specific，stable，and can provide basis for quality control of P.chinensis.

Pothos chinensis；HPLC；Fingerprint

R917

A

1001-0408（2016）33-4701-04

2015-12-28

2016-02-25）

（編輯：張 靜）

廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題項(xiàng)目（No.桂中重開201302）；廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項(xiàng)目（No.桂科重1355001-4-5）

＊副主任中藥師。研究方向：中藥質(zhì)量評價。電話：020-83482098。E-mail：acid123@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.33.31