HPLC法同時(shí)測(cè)定藏藥獨(dú)一味中山梔苷甲酯、木犀草素、芹菜素的含量

乙永林，孫連先（1.連云港市疾病預(yù)防控制中心，江蘇連云港 003；.連云港市第二人民醫(yī)院，江蘇 連云港 03）

HPLC法同時(shí)測(cè)定藏藥獨(dú)一味中山梔苷甲酯、木犀草素、芹菜素的含量

乙永林1＊，孫連先2（1.連云港市疾病預(yù)防控制中心，江蘇連云港 222003；2.連云港市第二人民醫(yī)院，江蘇 連云港 222023）

目的：建立同時(shí)測(cè)定獨(dú)一味中山梔苷甲酯、木犀草素、芹菜素含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Diamonds C18，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為238 nm（山梔苷甲酯）、348 nm（木犀草素、芹菜素），柱溫為25℃，進(jìn)樣量為10 μl。結(jié)果：山梔苷甲酯、木犀草素、芹菜素檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別3.08～308 μg/ml（r＝0.999 8）、3.72～372 μg/ml（r＝0.999 9）、2.92～292 μg/ml（r＝0.999 9）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜3.0%；加樣回收率分別為95.38%～103.15%（RSD＝1.85%，n＝9）、96.05%～102.66%（RSD＝2.07%，n＝9）、95.49%～103.59%（RSD＝2.18%，n＝9）。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于獨(dú)一味中山梔苷甲酯、木犀草素、芹菜素含量的同時(shí)測(cè)定。

獨(dú)一味；山梔苷甲酯；木犀草素；芹菜素；含量；高效液相色譜法

獨(dú)一味為唇形科植物獨(dú)一味Lamiophlomis rotate（Benth.）Kudo的干燥地上部分[1]，藏語(yǔ)又稱“大巴”“打布巴”，在我國(guó)四川、青海、甘肅、西藏等地區(qū)廣泛分布，常于9～10月采收，以根及根狀莖入藥，味苦，微寒，有小毒，可補(bǔ)髓、止血[2]。臨床上主要用于急性軟組織損傷、關(guān)節(jié)炎、腰椎間盤突出等癥的治療。

獨(dú)一味含有多種有效成分，如黃酮類、環(huán)烯醚萜苷類、苯乙醇苷類、總環(huán)烯醚萜苷等，其中黃酮類成分和苯乙醇苷類成分具有良好的鎮(zhèn)痛作用[3]；環(huán)烯醚萜苷類具有顯著的抗炎作用[4-5]；總環(huán)烯醚萜苷具有吸水特性，因此對(duì)小鼠斷尾出血、兔腹主動(dòng)脈出血、兔耳中動(dòng)脈出血和大鼠肝臟組織損傷出血有很好的止血作用[6-8]。近年來(lái)，由于對(duì)獨(dú)一味的需求日益加大，其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)也日趨嚴(yán)格，因此筆者采用高效液相色譜法（HPLC）建立同時(shí)測(cè)定其中獨(dú)一味中山梔苷甲酯、木犀草素、芹菜素含量的方法，以為獨(dú)一味藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

600型HPLC儀，包括2487雙通道紫外檢測(cè)器、Millennium32色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；BS224S型分析天平（德國(guó)Satorius公司）。

1.2 試劑

山梔苷甲酯對(duì)照品（批號(hào)：111873-201101，純度＞98%）、木犀草素對(duì)照品（批號(hào)：111520-201204，純度＞98%）、芹菜素對(duì)照品（批號(hào)：111901-201205，純度＞98%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈、磷酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

獨(dú)一味藥材購(gòu)自南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院中藥房，由連云港市第二人民醫(yī)院孫連先副主任中藥師鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Diamonds C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B，含1 mmol/L十六烷基三甲基溴化銨），梯度洗脫（0～12 min，10%A；12～20 min，10%→18.5% A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：238 nm（山梔苷甲酯）、348 nm（木犀草素、芹菜素）；流速：1.0 ml/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μl。記錄色譜，詳見(jiàn)圖1。在上述色譜條件下，理論板數(shù)以山梔苷甲酯、木犀草素、芹菜素峰計(jì)分別為4 500、5 200、6 500；各成分基線分離良好，分離度＞1.5。

2.2 溶液的制備

圖1 高效液相色譜圖A.混合對(duì)照品；B.供試品；1.山梔苷甲酯；2.木犀草素；3.芹菜素；Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed reference substance；B.test sample；1.dipsacoside；2.luteolin；3. apigenin

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 稱取減壓干燥至恒質(zhì)量的山梔苷甲酯、木犀草素、芹菜素對(duì)照品適量，加60%甲醇制成山梔苷甲酯、木犀草素、芹菜素質(zhì)量濃度分別為0.308、0.372、0.292 mg/ml的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品藥材粉末（過(guò)2號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，加60%甲醇40 ml，稱定質(zhì)量，回流提取60 min，冷卻后以60%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1 ml，分別加60%甲醇稀釋至100、80、60、40、20、1 ml，制成系列混合對(duì)照品溶液。精密量取上述系列混合對(duì)照品溶液各10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以山梔苷甲酯、木犀草素、芹菜素質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得山梔苷甲酯、木犀草素、芹菜素回歸方程分別為y＝16.379x+0.461 2（r＝0.999 8）、y＝22.435x+0.396 4（r＝0.999 9）、y＝38.598x+0.528 6（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，山梔苷甲酯、木犀草素、芹菜素檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為3.08～308、3.72～372、2.92～292 μg/ml。

2.4 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，山梔苷甲酯、木犀草素、芹菜素峰面積的RSD分別為1.52%、2.07%、2.75%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、10、12 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，山梔苷甲酯、木犀草素、芹菜素峰面積的RSD分別為1.61%、2.07%、1.82%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果，山梔苷甲酯、木犀草素、芹菜素的平均含量分別為4.683、8.457、3.274 mg/g，RSD分別為1.32%、1.87%、2.43%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量樣品適量，共6份，分別加入高、中、低質(zhì)量的山梔苷甲酯、木犀草素、芹菜素對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

2.8 樣品含量測(cè)定

取樣品各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Results of contents determination of samples（n＝3）

3 討論

3.1 流動(dòng)相的考察

黃酮類成分大多含有酚羥基，極性較大，且容易以離子形式存在，色譜峰容易拖尾且保留值太小。因此，本試驗(yàn)在流動(dòng)相中加入了十六烷基三甲基溴化銨離子對(duì)試劑，使樣品離子在流動(dòng)相中與離子對(duì)試劑的反離子生成無(wú)荷電的疏水性離子對(duì)，從而改善峰形和分離度。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的考察

筆者分別對(duì)3個(gè)被測(cè)成分進(jìn)行190～400 nm全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果表明，山梔苷甲酯最大吸收波長(zhǎng)為238 nm，木犀草素最大吸收波長(zhǎng)為254、354 nm，芹菜素最大吸收波長(zhǎng)為258、342 nm，由于在238 nm波長(zhǎng)處木犀草素和芹菜素的含量很低，而348 nm波長(zhǎng)處可更好地測(cè)定木犀草素和芹菜素的含量，因此本試驗(yàn)設(shè)置兩個(gè)波長(zhǎng)來(lái)檢測(cè)3個(gè)成分的含量。

3.3 供試品提取方法的考察

在預(yù)試驗(yàn)中，筆者分別考察了不同提取方式（水回流提取法、水提醇沉提取法）、不同體積分?jǐn)?shù)甲醇（100%、80%、60%、40%）、不同料液比（1∶160、1∶80、1∶40、1∶20）和不同提取時(shí)間（30、60、90 min）。結(jié)果表明，0.5 g藥材粉末中加60%甲醇40 ml，回流提取60 min時(shí)有效成分含量較高。

綜上所述，本方法操作簡(jiǎn)便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于獨(dú)一味中山梔苷甲酯、木犀草素、芹菜素含量的同時(shí)測(cè)定。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：262.

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（編輯：張 靜）

Simultaneous Determination of Dipsacoside B，Luteolin and Apigenin in Zang Medicine Lamiophlomis rotata by HPLC

YI Yonglin1，SUN Lianxian2（1.Center for Disease Control and Prevention of Lianyungang，Jiangsu Lianyungang 222003，China；2.The Second People's Hospital of Lianyungang，Jiangsu Lianyungang 222023，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the contents determination of dipsacoside B，luteolin and apigenin in Zang medicine Lamiophlomis rotata.METHODS：HPLC was performed on the column of Diamonds C18with mobile phase of acetonitrile-0.1%phosphoric acid solution（gradient elution）at a flow rate of 1.0 ml/min，detection wavelength was 238 nm for dipsacoside B，348 nm for luteolin and apigenin，column temperature was 25℃，and injection volume was 10 μl.RESULTS：The linear range was 3.08-308 μg/ml for dipsacoside B（r＝0.999 8），3.72-372 μg/ml for luteolin（r＝0.999 9）and 2.92-292 μg/ml for apigenin（r＝0.999 9）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 3.0%；recoveries were 95.38%-103.15%（RSD＝1.85%，n＝9），96.05%-102.66%（RSD＝2.07%，n＝9）and 95.49%-103.59%（RSD＝2.18%，n＝9）.CONCLUSIONS：The method is simple with good precision，stability and reproducibility，and can be used for the simultaneous determination of dipsacoside B，luteolin and apigenin in Zang medicine L.rotata.

Lamiophlomis rotata；Dipsacoside B；Luteolin；Apigenin；Content；HPLC

R927

A

1001-0408（2016）33-4733-03

2016-06-22

2016-09-13）

＊副主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。E-mail：lygyyl@sina.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.33.42