富血小板纖維蛋白和濃縮生長因子對(duì)施萬細(xì)胞影響的比較

吳晶洋，白艷潔，王稚英

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院口腔種植中心，遼寧 錦州 121001；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院集團(tuán)撫順醫(yī)院口腔科，遼寧 撫順113000）

富血小板纖維蛋白和濃縮生長因子對(duì)施萬細(xì)胞影響的比較

吳晶洋1，2，白艷潔2，王稚英1

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院口腔種植中心，遼寧 錦州 121001；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院集團(tuán)撫順醫(yī)院口腔科，遼寧 撫順113000）

目的以施萬細(xì)胞作為周圍神經(jīng)模型，比較富血小板纖維蛋白（PRF）與濃縮生長因子（CGF）對(duì)其的影響。方法隨機(jī)選取18～55歲身體健康志愿者10人，無菌條件下采集靜脈血10 mL，制備PRF和CGF。將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、PRF組和CGF組。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；MTT比色法測(cè)定細(xì)胞增殖能力；酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)細(xì)胞上清液中神經(jīng)生長因子的分泌量；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。結(jié)果倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)無明顯差異；MTT結(jié)果顯示PRF組和CGF組與對(duì)照組相比光密度值明顯升高（P＜0.05），細(xì)胞上清液中神經(jīng)生長因子分泌量均明顯升高（P＜0.05），處于S+G2M期的細(xì)胞數(shù)明顯增多（P＜0.01），而PRF組與CGF組相比各項(xiàng)指標(biāo)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論P(yáng)RF和CGF均可以促進(jìn)施萬細(xì)胞增殖并增加神經(jīng)生長因子的分泌量，但就改善細(xì)胞增殖能力、促進(jìn)神經(jīng)生長因子分泌來看，二者無明顯差異。

富血小板纖維蛋白；濃縮生長因子；施萬細(xì)胞；神經(jīng)生長因子；細(xì)胞周期

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口腔種植技術(shù)正處于飛速發(fā)展與日益完善的黃金時(shí)期，越來越多的牙齒缺失患者放棄了傳統(tǒng)鑲牙而選擇口腔種植修復(fù)，后者無論是在美觀還是實(shí)用性上與傳統(tǒng)鑲牙相比都有較大優(yōu)勢(shì)。牙周膜組織中含有大量魯菲尼小體，它們是天然牙的機(jī)械感受器，對(duì)于牙齒缺失的患者來說，牙周膜組織也遭到了不同程度的破壞，這導(dǎo)致了種植體對(duì)機(jī)械刺激的感受閾值要比天然牙高出許多倍，當(dāng)種植體所受外力較大時(shí)就會(huì)造成其周圍骨吸收，最終導(dǎo)致種植失敗，如何刺激種植體周圍神經(jīng)再生以達(dá)到保護(hù)種植體免受過度受力所造成的損傷成為解決這一問題的關(guān)鍵［1］。

施萬細(xì)胞是神經(jīng)嵴的衍生物，形成了周圍神經(jīng)髓磷脂軸突的髓鞘。每個(gè)施萬細(xì)胞包繞在一個(gè)軸突上，沿著軸突節(jié)形成一層髓磷脂髓鞘，當(dāng)一個(gè)軸突死亡時(shí)，環(huán)繞在其周圍的多個(gè)施萬細(xì)胞與其基底膜管一起形成一個(gè)生長通道，在其尾端形成新的軸突。許多研究［2］證明，施萬細(xì)胞在周圍神經(jīng)的形成、分化和再生等方面扮演了非常重要的角色。富血小板纖維蛋白（platelet rich fibrin，PRF）和濃縮生長因子（concentrated growth factor，CGF）屬于第2代血漿制品，它們?cè)诶^承了第1代血漿濃縮物富血小板血漿優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上，還表現(xiàn)出了許多令人欣喜的特點(diǎn)。進(jìn)入21世紀(jì)，國內(nèi)外開始研究PRF在創(chuàng)傷外科、美容外科、口腔種植科以及顱頜面外科等多個(gè)醫(yī)療再生領(lǐng)域的治療效果。實(shí)驗(yàn)［3］證實(shí)PRF可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖及分化，加速骨組織愈合，減輕周圍組織的炎性反應(yīng)。研究［4］證明，CGF具有改善并增強(qiáng)組織再生的獨(dú)特性質(zhì)，有利于所有再生組織的恢復(fù)，是再生醫(yī)療領(lǐng)域中組織刺激的新技術(shù)。近年來CGF對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞的作用受到廣泛關(guān)注。本研究將PRF和CGF作用于施萬細(xì)胞，比較PRF和CGF對(duì)施萬細(xì)胞的影響，為臨床在種植窩預(yù)備中下齒槽神經(jīng)損傷時(shí)加快受損傷的神經(jīng)恢復(fù)功能提供思路。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞、試劑及儀器

施萬細(xì)胞、施萬細(xì)胞培養(yǎng)基購自上海中禾新舟生物科技有限公司；多聚?L?賴氨酸購自上海士鋒生物科技有限公司；MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；人神經(jīng)生長因子ELI?SA試劑盒購自上海邦奕生物科技有限公司；Annex?in V?FITC流式檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶購自美國Sigma公司；流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司；DNM?9602G型酶標(biāo)分析儀購自北京普朗新技術(shù)有限公司；Medifuge離心機(jī)購自意大利Silfradent公司；倒置相差顯微鏡購自日本Olympus公司；高速離心機(jī)購自德國Ep?pendorf公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

在T?75培養(yǎng)瓶中加入10 mL三蒸水和15 μL的聚?L?賴氨酸，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜。24 h后用三蒸水沖洗包被了聚?L?賴氨酸的培養(yǎng)瓶2次，加入15 mL施萬細(xì)胞培養(yǎng)基，此培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基，將施萬細(xì)胞凍存管置于37℃水浴箱中，輕輕旋轉(zhuǎn)凍存管至內(nèi)容物完全溶解后，迅速將凍存管中的液體移入聚?L?賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，換用無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞生長周期同步化后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3PRF和CGF的制備

1.3.1PRF的制備：血液采集自10名健康志愿者，告知實(shí)驗(yàn)內(nèi)容并取得同意后，一次性采集10 mL靜脈血置于無添加抗凝劑的真空離心管中，立即放入數(shù)字離心機(jī)中3 000 r/min離心10 min后，可見血液分為3層，由上到下依次為無細(xì)胞血漿層、PRF凝塊、紅細(xì)胞層。在超凈工作臺(tái)中，將PRF凝塊放入無菌離心管中，-80℃冰凍1 h，4℃解凍后230g離心10 min，加入5 mL施萬細(xì)胞培養(yǎng)基，37℃孵育24 h后3 000 r/min離心5min，取上清5 mL即為PRF，0.22 μm濾器過濾后加入5 mL施萬細(xì)胞培養(yǎng)基，得到10 mL含PRF的培養(yǎng)液［5］。

1.3.2CGF的制備：血液采集自10名健康志愿者，告知實(shí)驗(yàn)內(nèi)容并取得同意后，一次性采集10 mL靜脈血置于無添加抗凝劑的真空離心管中，立即放入Medifuge離心機(jī)中，設(shè)定制備CGF程序，離心10 min后可見血液分為3層，由上到下依次為無細(xì)胞血漿層、CGF纖維蛋白層、紅細(xì)胞層。在超凈工作臺(tái)中，將CGF凝塊放入無菌離心管中，-80℃冰凍1 h，4℃解凍后230g離心10 min，加入5 mL施萬細(xì)胞培養(yǎng)基，37℃孵育24 h后400g離心5 min，取上清5 mL即為CGF，0.22 μm濾器過濾后加入5 mL施萬細(xì)胞培養(yǎng)基，得到10 mL含CGF的培養(yǎng)液［6］。

1.4實(shí)驗(yàn)分組

對(duì)照組：用施萬細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)；PRF組：用含PRF的施萬細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)；CGF組：用含CGF的施萬細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.5倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)

將施萬細(xì)胞以上述方法吹打收集制成單細(xì)胞懸液，并以1×106/孔的密度接種于6孔板中，根據(jù)各組要求，分別加入相應(yīng)的培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h后，置于倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)。

1.6MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率

用施萬細(xì)胞培養(yǎng)基將施萬細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度，按照5×104/孔將細(xì)胞接種到96孔板中，每孔體積100 μL，培養(yǎng)板的邊緣孔加入等量無水PBS，設(shè)置空白對(duì)照孔。將96孔板置于恒溫37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后去除舊的培養(yǎng)液，按照實(shí)驗(yàn)分組，每孔更換對(duì)應(yīng)培養(yǎng)液100μL置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，各組細(xì)胞處理結(jié)束前4 h每孔加入5 mg/mL的MTT 10 μL，水平搖床上低速混勻1 min繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸掉培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜150 μL，搖床上避光振蕩10 min。用酶標(biāo)分析儀檢測(cè)570 nm波長處各組細(xì)胞的吸光度［7］。

1.7酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)細(xì)胞上清液中神經(jīng)生長因子的分泌量

將施萬細(xì)胞以上述方法吹打收集制成單細(xì)胞懸液，并以1×106/孔的密度接種于6孔板中，根據(jù)各組要求，分別加入相應(yīng)的培養(yǎng)基培養(yǎng)3和5 d后，吸取每孔細(xì)胞上清液，2 000g離心20 min，提取上清液，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。以神經(jīng)生長因子含量為縱坐標(biāo)，450 nm處的光密度（optical density，OD）值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組樣品中神經(jīng)生長因子的含量［8］。

1.8流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期

將施萬細(xì)胞以上述方法吹打收集制成單細(xì)胞懸液，并以1×106/孔的密度接種于6孔板中，根據(jù)各組要求，分別加入相應(yīng)的培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h后，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞DNA含量分布［9］。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)

各組細(xì)胞貼壁緊密，突觸形成并相互連接，細(xì)胞生長狀態(tài)良好。各組間細(xì)胞形態(tài)無明顯差異。見圖1。

2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

圖1　相差顯微鏡下對(duì)照組、PRF組和CGF組的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 ×400Fig.1　Cell morphology observed under inverted phase contrast microscope×400

與對(duì)照組相比，PRF組和CGF組的OD值在第1、3、5天均明顯升高（P＜0.05），PRF組和CGF組的OD值在第1、3、5天相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2　MTT法檢測(cè)不同時(shí)間段3組的細(xì)胞增殖情況Fig.2　Cell proliferation in 3 groups at different time points de?tected by MTT method

2.3酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)細(xì)胞上清液中神經(jīng)生長因子的分泌量

檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值，得出回歸方程，將各實(shí)驗(yàn)組的OD值代入回歸方程中。與對(duì)照組相比，PRF組和CGF組細(xì)胞上清液中的神經(jīng)生長因子分泌量明顯升高（P＜0.05），PRF組與CGF組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

2.4流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期

與對(duì)照組相比，PRF組和CGF組處于S+G2M期的細(xì)胞明顯增多（P＜0.01），但PRF組與CGF組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4。

3　討論

圖3　3 d和5 d時(shí)血清中3組的神經(jīng)生長因子分泌情況Fig.3　Secretion of nerve growth factor in supernatant in 3 groups on 3 d and 5 d

周圍神經(jīng)損傷后遠(yuǎn)端髓鞘崩解，施萬細(xì)胞和軸突間的聯(lián)系消失，大量增殖的施萬細(xì)胞吞噬損傷末端的髓鞘碎片后形成細(xì)胞索，使軸突能夠沿其生長并分泌神經(jīng)生長因子，誘導(dǎo)損傷的神經(jīng)元分泌相應(yīng)蛋白使軸突進(jìn)一步延長；在此過程中施萬細(xì)胞包裹軸突形成髓鞘，傳遞神經(jīng)沖動(dòng)。由此可見，施萬細(xì)胞在周圍神經(jīng)損傷后的修復(fù)過程中起著非常重要的作用［10］。

圖4　3組流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果Fig.4　Cell cycle detected by flow cytometry in 3 groups

PRF屬于第2代血小板濃縮制品，制備過程簡(jiǎn)單，含有大量的纖維蛋白原、高濃縮血小板及多種生長因子。PRF中的生長因子在其降解過程中逐步緩慢釋放，具有相對(duì)長效的特點(diǎn)。KUMAR等［11］的研究指出，PRF能夠明顯改善軟骨組織的愈合。還有報(bào)道［12］指出，PRF在兒童牙髓再生治療中發(fā)揮了很好的療效。CGF是由SACCO首先研發(fā)出來的，CGF的制備過程與PRF略有不同，CGF的生物學(xué)作用主要依賴其含有的各種生長因子與纖維蛋白原形成的纖維網(wǎng)狀支架。CGF與PRF的不同主要在于其變速制備過程中血小板α顆粒釋放出的各種生長因子。CGF可以促進(jìn)施萬細(xì)胞的增殖以及神經(jīng)生長因子的分泌［13］，HONDA等［14］的研究指出，CGF提取物可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和成熟。

本研究通過MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖能力發(fā)現(xiàn)，PRF組和CGF組均可以提高施萬細(xì)胞的增殖能力，但2組間的差異不明顯。而用ELISA法檢測(cè)神經(jīng)生長因子分泌量時(shí)，PRF組和CGF組細(xì)胞上清液中神經(jīng)生長因子的分泌量均高于對(duì)照組，但2組間的差異不明顯。在流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的實(shí)驗(yàn)中，PRF組和CGF組處于S+G2M期的細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯增多，但2組間的差異不明顯。

總之，PRF和CGF均可以促進(jìn)施萬細(xì)胞增殖并增加神經(jīng)生長因子的分泌量，但就改善細(xì)胞增殖能力、促進(jìn)神經(jīng)生長因子分泌來看，二者無明顯差異。

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（編輯陳姜）

Comparison of Effects of Platelet Rich Fibrin and Concentrated Growth Factor on Schwann Cells

WU Jingyang1，2，BAI Yanjie2，WANG Zhiying1
（1.Center of Dental Implant，The Second Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University，Jinzhou 121001，China；2.Department of Stomatology，F(xiàn)ushun Hospital，Shengjing Hospital Group of China Medical University，F(xiàn)ushun 113000，China）

ObjectiveTo compare the effects of platelet rich fibrin（PRF）and concentrated growth factors（CGF）using Schwann cells as a pe?ripheral nerve model.MethodsA total of 10 healthy volunteers aged 18 to 55 were randomly selected，and 10 mL venous blood was collected un?der aseptic conditions to prepare PRF and CGF.The cells were randomly divided into three groups，control group，PRF group and CGF group.The cell morphology was observed by inverted phase contrast microscope.The cell proliferation was analyzed by MTT assay.The secretion of nerve growth factor in supernatant was detected by enzyme?linked immunosorbent assay.Cell cycle was detected by flow cytometry.ResultsThere was no significant difference of the morphology of cells in each group as observed under inverted phase contrast microscope.MTT results showed that the absorbance values of PRF group and CGF group were significantly higher than those of the control group（P＜0.05）.The secretion of nerve growth factor in the supernatant were significantly increased（P＜0.05）.The number of cells in S+G2M phase was significantly increased（P＜0.01），but there was no significant difference between PRF group and CGF group.ConclusionBoth PRF and CGF can promote proliferation of Schwann cells and increased the amount of nerve growth factor secretion，but there is no significant difference between PRF and CGF in terms of improving cell proliferation and promoting nerve growth factor secretion.

platelet rich fibrin；concentrated growth factor；Schwann cells；nerve growth factor；cell cycle

R782.12

A

0258-4646（2016）12-1089-05

10.12007/j.issn.0258?4646.2016.12.008

遼寧省科技廳優(yōu)秀人才培育項(xiàng)目（2014022025）

吳晶洋（1983-）女，碩士研究生.

王稚英，E-mail：bdwzy@126.com

2016-04-15

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