β?七葉皂甙鈉對(duì)脊髓損傷大鼠脊髓組織水通道蛋白4與水通道蛋白9表達(dá)的影響

陳勇，赤仁杰

（沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院骨三科，沈陽(yáng) 110024）

β?七葉皂甙鈉對(duì)脊髓損傷大鼠脊髓組織水通道蛋白4與水通道蛋白9表達(dá)的影響

陳勇，赤仁杰

（沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院骨三科，沈陽(yáng) 110024）

目的探討β?七葉皂甙鈉對(duì)脊髓損傷大鼠水通道蛋白（AQP）4與AQP9表達(dá)的影響。方法成年雌性SD大鼠150只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、脊髓損傷組和β?七葉皂甙鈉組，每組50只。用改良的Allen’s法建立急性脊髓損傷模型后，術(shù)后行BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分及斜板實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)大鼠后肢功能，免疫組化和Western blotting方法檢測(cè)各組大鼠脊髓組織AQP4與AQP9的表達(dá)變化。結(jié)果相比于假手術(shù)組，各時(shí)間點(diǎn)脊髓損傷組和β?七葉皂甙鈉組運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分及斜板實(shí)驗(yàn)評(píng)分均顯著降低（P＜0.05）；但是第7天開始，各時(shí)間點(diǎn)β?七葉皂甙鈉組大鼠后肢功能恢復(fù)情況明顯優(yōu)于脊髓損傷組（P＜0.05）。相比于假手術(shù)組，各時(shí)間點(diǎn)脊髓損傷組和β?七葉皂甙鈉組大鼠脊髓組織AQP4與AQP9的含量顯著升高（P＜0.05）；但是與同時(shí)間點(diǎn)脊髓損傷組相比，β?七葉皂甙鈉組大鼠脊髓組織AQP4與AQP9的含量顯著降低（P＜0.05）。結(jié)論β?七葉皂甙鈉能夠通過降低AQP4與AQP9蛋白表達(dá)對(duì)脊髓損傷大鼠的神經(jīng)功能發(fā)揮保護(hù)作用。

脊髓損傷；β?七葉皂甙鈉；水通道蛋白4；水通道蛋白9；大鼠

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脊髓損傷是一種非常嚴(yán)重的外傷，隨著交通業(yè)和建筑業(yè)的發(fā)展，其發(fā)生率逐年上升，常常導(dǎo)致患者終身癱瘓，而且其繼發(fā)性損傷也會(huì)引起各種并發(fā)癥，甚至死亡［1］。研究［2］發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后，脊髓損傷區(qū)的水通道蛋白（aquaporin，AQP）表達(dá)增加，水分子會(huì)大量地進(jìn)入損傷部位，使脊髓壓力迅速升高，繼而引起脊髓水腫的發(fā)生，加重脊髓內(nèi)微循環(huán)障礙，加重脊髓繼發(fā)性損傷。目前對(duì)脊髓損傷后引起的水腫研究甚少，脊髓水腫發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制尚不十分清楚，但猜測(cè)AQP與組織水腫關(guān)系密切。本研究通過Allen’s法制作脊髓損傷模型，免疫組化和Western blotting方法檢測(cè)β?七葉皂甙鈉處理后，脊髓損傷大鼠大脊髓組織AQP4和AQP9的表達(dá)，探討β?七葉皂甙鈉參與脊髓損傷后水腫形成的機(jī)制。

1　材料與方法

1.1試劑和儀器

β?七葉皂甙鈉（山東綠葉制藥股份有限公司生產(chǎn)），羊抗大鼠AQP4、AQP9購(gòu)于美國(guó)Chemico公司，兔抗羊IgG購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。SP免疫組化染色試劑盒與DAB顯色試劑盒購(gòu)于福州邁新公司。

1.2動(dòng)物分組及模型制備

150只成年健康SD大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分為隨機(jī)分為假手術(shù)組、脊髓損傷組和β?七葉皂甙鈉組，每組50只。脊髓損傷模型制備：用10%水合氯醛麻醉大鼠，充分暴露T9～11椎板，暴露脊髓，用自制改良的Allen’s打擊器，以重量為3 g的平頭撞擊器，從3 cm高處自由落體的致傷能量，造成脊髓急性損傷，假手術(shù)組僅進(jìn)行單純椎板摘除。β?七葉皂甙鈉組在脊髓損傷動(dòng)物模型制備后腹腔注射β?七葉皂甙鈉，5 mg/（kg·d）。術(shù)后1、3、7、14、21 d每組各取10只動(dòng)物進(jìn)行檢測(cè)。

1.3大鼠后肢功能行為學(xué)測(cè)試

運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分：將動(dòng)物置于測(cè)試平臺(tái)持續(xù)觀察4 min，記錄其后肢活動(dòng)。0分表示后肢完全癱瘓無(wú)活動(dòng)能力，21分表示運(yùn)動(dòng)能力正常。斜板實(shí)驗(yàn)：將表面粗糙的橡膠墊固定于斜板上，逐漸增加斜板與水平面之間的角度，直至大鼠剛好可在板上停留5 s，記錄這一角度值，每只大鼠測(cè)3次，取平均值。

1.4免疫組織化學(xué)染色

將大鼠以0.8%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，打開胸腔，暴露心臟，剪開右心耳，先以0.9%生理鹽水灌流，4%多聚甲醛固定，然后打開椎管，剝離脊髓，置于4%多聚甲醛后固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，切片（5 μm）。按SP試劑盒說明書測(cè)定AQP4和AQP9的表達(dá)，以平均光密度值為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各組目標(biāo)蛋白進(jìn)行評(píng)定。

1.5Western blotting檢測(cè)

將大鼠以0.8%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，冰上取脊髓組織，然后將組織超聲粉碎，低溫離心1 h，棄去沉淀取上清，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算每個(gè)泳道的上樣量。沸水浴將樣品變性，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，4℃封閉過夜，一抗、二抗室溫孵育2 h，暗室內(nèi)曝光，顯影、定影，對(duì)結(jié)果進(jìn)行掃描，然后對(duì)結(jié)果進(jìn)行圖像分析，以平均光密度值為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各組目標(biāo)蛋白進(jìn)行評(píng)定。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用表示，各組比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1行為學(xué)評(píng)價(jià)

各時(shí)間點(diǎn)脊髓損傷組和β?七葉皂甙鈉組組BBB評(píng)分及斜板實(shí)驗(yàn)評(píng)分均顯著低于假手術(shù)組（P＜0.05）；但是自7d開始，各時(shí)間點(diǎn)β?七葉皂甙鈉組大鼠后肢功能恢復(fù)情況明顯優(yōu)于脊髓損傷組（P＜0.05），見表1、2。

2.2免疫組化檢測(cè)結(jié)果

表1　3組大鼠運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分比較（n=10，x±s）Tab.1　Comparison of BBB scores among three groups（n=10，x±s）

表2　3組大鼠斜板試驗(yàn)評(píng)分比較（n=10，x±s）Tab.2　Comparison of inclined plane test scores among 3 groups（n=10，x±s）

免疫組化結(jié)果顯示，AQP4與AQP9在假手術(shù)組大鼠脊髓組織僅有微量陽(yáng)性表達(dá)，與相同時(shí)間點(diǎn)的假手術(shù)組相比，脊髓損傷組AQP4與AQP9的陽(yáng)性表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與相同時(shí)間點(diǎn)的脊髓損傷組相比，β?七葉皂甙鈉組大鼠脊髓組織AQP4與AQP9的陽(yáng)性表達(dá)則明顯降低（P＜0.01）。見圖1、2。

2.3Westernblotting檢測(cè)

圖1　免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)脊髓損傷7 d后AQP4與AQP9的表達(dá) ×400Fig.1　The expression of AQP4 and AQP9 were detected by immunohistochemical staining at 7 days after SCI×400

圖2　各組大鼠AQP4和AQP9蛋白的平均光密度值Fig.2　Mean optic density values of AQP4 and AQP9 in each group

Western blotting結(jié)果顯示，與相同時(shí)間點(diǎn)的假手術(shù)組相比，脊髓損傷組AQP4與AQP9的蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與相同時(shí)間點(diǎn)的脊髓損傷組相比，β?七葉皂甙鈉組大鼠脊髓組織AQP4與AQP9的蛋白表達(dá)則明顯降低（P＜0.01）。見圖3、4。

3　討論

脊髓損傷具有很高的發(fā)病率和致殘率，而且脊髓一旦發(fā)生損傷、壞死，恢復(fù)的可能性較小，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。目前對(duì)脊髓損傷的治療仍然是一個(gè)世界性的醫(yī)學(xué)難題［3?4］。

圖3　Western blotting方法檢測(cè)AQP4與AQP9的表達(dá)Fig.3　The expression of AQP4，AQP9 and β?actin detected by Western blotting

七葉皂苷鈉是娑羅子果實(shí)的提取物，研究［5］發(fā)現(xiàn)其具有消腫、抗炎、抗?jié)B出和改善微循環(huán)的作用。目前臨床主要用于各種原因引起的腦水腫及伴發(fā)的腦功能失調(diào)、創(chuàng)傷、骨折、手術(shù)后引起的腫脹與血腫。研究［6］發(fā)現(xiàn)七葉皂苷鈉具有很強(qiáng)的穩(wěn)定血管內(nèi)皮細(xì)胞和消除自由基的作用，另有研究［7］發(fā)現(xiàn)，N?甲基?D?天門冬氨酸受體拮抗劑和七葉皂苷鈉聯(lián)合應(yīng)用對(duì)脊髓細(xì)胞具有保護(hù)作用，能使脊髓組織損害明顯減輕，而且在脊髓牽拉損傷前應(yīng)用七葉皂苷鈉對(duì)脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡有抑制作用［8］。綜上可知，七葉皂苷鈉對(duì)脊髓損傷的神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用。本研究對(duì)脊髓損傷大鼠和β?七葉皂甙鈉組大鼠進(jìn)行BBB評(píng)分及斜板實(shí)驗(yàn)評(píng)分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，自7 d開始，相同時(shí)間點(diǎn)β?七葉皂甙鈉組大鼠后肢功能恢復(fù)情況明顯優(yōu)于脊髓損傷組，提示β?七葉皂甙鈉有助于脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，這與之前的研究一致。但是七葉皂苷鈉具有多種藥理作用，其對(duì)脊髓細(xì)胞保護(hù)作用機(jī)制尚不十分清楚。

圖4　各組大鼠AQP4和AQP9蛋白的平均光密度值Fig.4　Mean optic density values of AQP4 and AQP9 in each group

AQPs是存在于微生物、動(dòng)植物和人體內(nèi)的一組小分子蛋白質(zhì)，是一種膜通道蛋白，與水電解質(zhì)的運(yùn)輸平衡密切相關(guān)，根據(jù)其化學(xué)性質(zhì)又細(xì)分為水通道和水甘油通道。AQP4，又名汞不敏感水通道蛋白，在哺乳動(dòng)物腦和脊髓的星形膠質(zhì)細(xì)胞有廣泛表達(dá)，在腦水腫、水鹽代謝、腦脊液的生成、吸收等方面發(fā)揮著重要作用［9?10］。研究［11?12］發(fā)現(xiàn)，降低脊髓損傷部位AQP4的表達(dá)能夠使急性缺血性損傷時(shí)脊髓灰質(zhì)后角深層的滲透膨脹率明顯減少，減輕脊髓水腫的水平，結(jié)果提示AQP4與脊髓損傷后的引起的脊髓水腫密切相關(guān)。AQP9主要表達(dá)于腦和脊髓白質(zhì)部分的星形膠質(zhì)細(xì)胞，與神經(jīng)組織中水的轉(zhuǎn)運(yùn)、中樞滲透壓的形成和腦脊液的形成密切相關(guān)，還可能與鉀離子的代謝、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和腦細(xì)胞的能量代謝有關(guān)［13］。本研究檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相比于假手術(shù)組，脊髓損傷組大鼠脊髓組織AQP4與AQP9的表達(dá)顯著升高，提示脊髓損傷后，AQP4與AQP9很可能參與了脊髓水腫的形成，但是，但是，β?七葉皂甙鈉能否通過抑制AQP4與AQP9減輕脊髓水腫，對(duì)脊髓損傷后的神經(jīng)提供保護(hù)作用是一個(gè)值得思考的問題。本研究建立脊髓損傷模型后，對(duì)脊髓損傷大鼠腹腔注射β?七葉皂甙鈉，然后在不同的時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，利用免疫組織化學(xué)方法和Western blotting方法檢測(cè)損傷部位脊髓組織AQP4與AQP9的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與相同時(shí)間點(diǎn)的脊髓損傷組相比，β?七葉皂甙鈉組大鼠脊髓組織AQP4與AQP9的蛋白表達(dá)則明顯降低。結(jié)果提示，下調(diào)AQP4與AQP9蛋白的表達(dá)很可能是β?七葉皂甙鈉對(duì)脊髓損傷大鼠提供神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制之一。

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（編輯于溪）

Effect of β?sodium Aescinate on the Expression of Aquaporin?4 and Aquaporin?9 in Rats with Spinal Cord Injury

CHEN Yong，CHI Renjie
（Department of Orthopedic，Central Hospital Affiliated to Shenyang Medical College，Shenyang 110024，China）

ObjectiveTo study the effect of β?sodium aescinate on the expressions of aquaporin?4 and aquaporin?9 in rats with spinal cord inju?ry.MethodsA total of 150 rats were randomly divided into 3 groups：sham group（n=50），spinal cord injury（SCI）group（n=50）and β?sodi?um aescinate group（n=50）.The experimental animal models was established by modified Allen’s model.The Basso，Beattie and Bresnahan（BBB）locomotor rating scale and inclined plane test were used to evaluate rat behavioral consequences after injury.The immunohistochemical staining and western blotting assay were performed to observe the expressions of aquaporin?4 and aquaporin?9.ResultsCompared with sham group，BBB score and inclined plane test score of SCI group and β?sodium aescinate group were significantly lower at each time point（P＜0.05）；however，the functional recovery was significantly better in β?sodium aescinate group than in SCI group at each time point from 7 d after SCI（P＜0.05）.The aquaporin?4 and aquaporin?9 positive expressions of rats in sham group were lower significantly than rats in SCI group and β?sodium aescinate group（P＜0.05）；however，the aquaporin 4 and aquaporin 9 positive expressions of rats in β?sodium aescinate group was lower signifi?cantly than rats in SCI group at each time point（P＜0.05）.Conclusionβ?sodium aescinate can protect the neurologic function in rats with spi?nal cord injury by decreasing aquaporin?4 and aquaporin?9 protein expression.

spinal cord injury；β?sodium aescinate；aquaporin?4；aquaporin?9；rat

R651.2

A

0258-4646（2016）12-1124-04

10.12007/j.issn.0258?4646.2016.12.015

陳勇（1973-），男，副主任醫(yī)師，碩士. E-mail：cy730729@sohu

2016-06-17

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