Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌患者外周血CD4+CD25+FOXP3+細(xì)胞分析

鐘運(yùn)超，黃靜靜，張騫予，張康廣西梧州市人民醫(yī)院腫瘤科，廣西梧州543000

Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌患者外周血CD4+CD25+FOXP3+細(xì)胞分析

鐘運(yùn)超，黃靜靜，張騫予，張康
廣西梧州市人民醫(yī)院腫瘤科，廣西梧州543000

目的探討Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌患者外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg（Treg）細(xì)胞的百分比情況。方法選擇本院腫瘤科收治的33例Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌患者和16例健康對照組人群，均在接受治療前空腹抽取外周血樣本并在流式細(xì)胞儀上做Treg細(xì)胞的測定。結(jié)果Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌患者外周血Treg細(xì)胞百分比水平為（10.16±7.43）%，健康對照組為（11.93±4.78）%，兩者比較無明顯差異（P＞0.05）；若以患者的Treg細(xì)胞百分比平均值10%為基線，發(fā)現(xiàn)全組病例只有39.39%（13/33）的患者外周血Treg細(xì)胞百分比高于基線水平。結(jié)論Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌患者外周血Treg細(xì)胞整體水平并不高于健康人群；但部分病例存在百分比增高現(xiàn)象?？蔀榕R床提供資料。

非小細(xì)胞肺癌；外周血；CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞；Ⅳ期

肺癌的發(fā)生，發(fā)展與機(jī)體免疫平衡有關(guān)，其中T淋巴細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫在其中起重要作用；而T淋巴細(xì)胞亞群中CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是一群具有免疫抑制活性細(xì)胞，參與肺癌微環(huán)境中抑制機(jī)體免疫應(yīng)答作用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［1-2］肺癌患者外周血的CD4+ CD25+FOXP3+細(xì)胞數(shù)量明顯增多，且隨腫瘤進(jìn)展及分期升高而逐漸升高，導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸。但也有不同的文獻(xiàn)報(bào)道［3］肺癌患者外周血的Treg細(xì)胞數(shù)量雖然增多，但肺癌Ⅰ期-Ⅳ期間沒有明顯差異。為了深入了解這種情況，本文就Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌患者外周血CD4+ CD25+FOXP3+細(xì)胞的分布問題也作研究。擬為臨床提供資料。

1　資料與方法

1.1一般資料

取2013年1月～2014年12月在我院腫瘤科住院的Ⅳ期（TNM分期）非小細(xì)胞肺癌患者33例。男27例，女6例。中位年齡53歲。全部病例均取得病理診斷，其中鱗癌29例，腺癌3例。其他1例。每1病例均在首次治療前空腹抽外周血6 mL送檢。同時(shí)收集16例正常人群空腹抽外周血6 mL作為對照組。

1.2方法

1.2.1試劑和儀器CD4 percp（BD Bioscences），CD25 FITC（BD Bioscences），F(xiàn)OXP3（BD Bioscences），F(xiàn)ACSTMPermeabilizing Solution2（10×）（BD Bioscences），BD FACSTMlysing Solution（10×）（BD Bioscences），PBS由博士德生物工程有限公司生產(chǎn)，臺(tái)式離心機(jī)Labofuge 400R Thermo Fisher產(chǎn)品；BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀（BECTON DICKNSON），漩渦混均儀（VORTEX-GENIE）。

1.2.2檢測方法依據(jù)實(shí)驗(yàn)Panel為樣本管編號，將待用抗體置于冰盒上備用。在試管中按Panel加入試劑規(guī)格要求的膜表面抗；根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果加入適量的樣本量；低速混勻3 s，室溫孵育20 min；向每個(gè)試管中加入紅細(xì)胞裂解液2 mL，混勻，在室溫避光10 min；溫育后立即在室溫離心1500 r/min，5 min；棄上清，加2 mLPBS重懸，低速混勻3 s，室溫離心1500 r/min，5 min，倒掉上清；加入1 mL破膜劑室溫避光10 min，室溫離心1500 r/ min，5 min，棄上清；加2 mL PBS洗滌，低速混勻3 s，室溫離心1500 r/min，5 min，棄上清；加入細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記抗體，低速混勻3 s，室溫孵育30 min；向試管中加2 mLPBS重懸，低速混勻3 s，室溫離心1000 r/min，5 min，倒掉上清；最后加入0.5 mL含1%多聚甲醛PBS重懸，上機(jī)檢測。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理。計(jì)數(shù)資料用百分比表示，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間用兩均數(shù)t檢驗(yàn)比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌患者外周血CD4+CD25+ FOXP3+Treg占CD4+CD25+細(xì)胞百分比水平與健康對照組的無明顯差異（P＞0.05），兩組方差齊性分析：F= 1.176，P=0.284；說明兩組方差齊。檢測組與健康對照組比較，t=0.868，P=0.39，t檢驗(yàn)95%區(qū)間為（-2.335，5.878）。若以檢測組Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌患者外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg占CD4+CD25+細(xì)胞平均值10%為基線，將全組病例細(xì)分為低于基線和高于基線水平兩組，結(jié)果顯示：全組病例外周血CD4+CD25+ FOXP3+Treg占CD4+CD25+細(xì)胞百分比低于基線占60.61%（20/33）；而高于基線水平占39.39%（13/33）。

3　討論

自身免疫性疾病是自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞在一定條件下針對自身組織所起的免疫反應(yīng)，引起組織損傷的一組疾病。而腫瘤是正常組織在一定的條件下出現(xiàn)的細(xì)胞突變而成的。同時(shí)會(huì)表達(dá)一些腫瘤相關(guān)抗原，如CEA等。一般認(rèn)為腫瘤相關(guān)抗原是機(jī)體的自身抗原成分，因此腫瘤免疫從某種程度上說是一種自身免疫。理論上腫瘤患者體內(nèi)也存在自身反應(yīng)性T細(xì)胞，它能識(shí)別這些相關(guān)抗原，并引起適宜的反應(yīng)，消除這些腫瘤細(xì)胞。但實(shí)際上，臨床并沒有觀察到免疫排斥腫瘤組織的現(xiàn)象，而是促進(jìn)腫瘤產(chǎn)生，增大和轉(zhuǎn)移等。增多的Treg細(xì)胞在腫瘤局部與CD8+T細(xì)胞之間相互作用抑制殺傷性T細(xì)胞的作用。因此雖然腫瘤患者體內(nèi)有一定數(shù)量的CTL細(xì)胞存在，卻不能誘導(dǎo)有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答來抑制腫瘤生長［4］。說明在腫瘤生長過程中，Treg細(xì)胞增多總是伴隨抗腫瘤免疫的存在的［5］。肺癌患者外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞表面也表達(dá)CTLA-4標(biāo)記，CTLA-4是Treg表面的免疫治療的靶點(diǎn)［6］。Ipilimumab單抗為針對CTLA-4人源化抗體，可以封閉CTLA-4信號通路，阻斷CTLA-4與APC表面的協(xié)調(diào)刺激分子B7結(jié)合介導(dǎo)的抑制性信號，從而激活T細(xì)胞，提高特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)［7］。肺癌患者外周血的CD4+ CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞數(shù)量較正常人群明顯增多；且隨腫瘤進(jìn)展逐漸升高，使Ⅳ期比Ⅰ期肺癌患者外周血的CD4+CD25+FOXP3+細(xì)胞數(shù)量明顯升高（P＜0.05）［1-2］。理論上，這些肺癌患者如果用Ipilimumab單抗封閉CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞，就會(huì)提高機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)，取得很好縮小腫瘤的效果。然而臨床上用Ipilimumab單抗免疫治療晚期惡性黑色素瘤患者，取得客觀有效率也只有10%～15%［8］。在肺癌方面，據(jù)2014 年ASCO年會(huì)數(shù)據(jù)顯示：聯(lián)合應(yīng)用nivolumab和Ipilimumab治療非小細(xì)胞肺癌患者后，其客觀應(yīng)答率也只有22%，疾病穩(wěn)定率33%［9］。但大部分患者沒有取得客觀效果。原因值得研究。而本研究結(jié)果顯示：Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌患者外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞的數(shù)量百分比并沒有比正常對照組人群的為高，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［10］相似。這可能與本研究病例數(shù)較少，或者可能與晚期腫瘤增大誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）增多有關(guān)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［11-12］VEGF對CD34+造血干細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞（DC）的分化具有強(qiáng)烈的抑制作用。不但可以抑制DC成熟，還可以阻斷DC的抗原遞呈作用，抑制DC等抗原遞呈細(xì)胞的分化，進(jìn)一步影響細(xì)胞毒T細(xì)胞的擴(kuò)增，活化及免疫殺傷作用。推測由于晚期腫瘤增大，VEGF也伴隨增多，對DC細(xì)胞活化受到抑制也會(huì)增強(qiáng)，DC細(xì)胞就沒有能力遞呈腫瘤抗原通過雙信號激活T細(xì)胞。沒有活化的T細(xì)胞，就不會(huì)伴隨負(fù)反饋的Treg細(xì)胞出現(xiàn)，可以部分解釋Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌患者外周血CD4+CD25+FOXP3+ Treg細(xì)胞的數(shù)量百分比并沒有比正常對照組人群的高的現(xiàn)象。

就腫瘤個(gè)體化精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)而言，可將本研究病例的外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg占CD4+CD25+細(xì)胞平均值10%為基線分層分析，發(fā)現(xiàn)本研究組的39.39%的病例存在CD4+CD25+FOXP3+細(xì)胞的數(shù)量百分比增高的現(xiàn)象。那么這部分病例采用Ipilimumab單抗或其他方法抑制或清除CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞就可以提高機(jī)體抗癌功能，通過恢復(fù)機(jī)體抗腫瘤免疫使肺癌患者腫瘤縮小，達(dá)到延長生存期的目的。因此這項(xiàng)研究結(jié)果可能為臨床選擇免疫治療合適的對象提供指導(dǎo)參考。值得進(jìn)一步研究。

［1］郭凈，劉忠達(dá)，張尊敬.非小細(xì)胞肺癌患者外周血CD4+CD25+ FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的研究［J］.中國基層醫(yī)藥，2015，22（4）:510-3.

［2］李莎，李巖，梁婧，等.非小細(xì)胞肺癌患者外周血FOXP3+調(diào)節(jié)T細(xì)胞和Th17的檢測與臨床意義［J］.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2012，32（7）:642-6.

［3］梁晶.肺癌患者外周血Treg細(xì)胞與IL-10，TGF-b檢測及其臨床意義［J］.臨床肺科雜志，2015，20（11）:1980-3.

［4］李京有，姜乃德，林樂勝.轉(zhuǎn)錄因子FOXP3在肺癌患者中的表達(dá)及其臨床意義［J］.臨床醫(yī)學(xué)工程，2010，17（1）:31-3.

［5］Prestwich RJ，Errington F，Hatfield P，et al.The immune system-is it relevant to Cancer development，progression and treatment［J］.Clin Oncol（R Coll Radiol），2008，20（2）:101-12.

［6］王平章，馬大龍.調(diào)節(jié)性T細(xì)胞免疫治療策略［J］.中國醫(yī)藥生物技術(shù)，2015，10（1）:53-8.

［7］Hodi FS，O'day SJ，Mcdermott DF，et al.Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma［J］.N Engl J Med，2010，363（8）:711-23.

［8］任軍，黃紅艷.靶向免疫檢查點(diǎn)的腫瘤免疫現(xiàn)狀及趨勢［J］.中國腫瘤臨床，2014，41（7）:415-9.

［9］Johnson DB，Rioth MJ，Horn L.Immune checkpoint inhibitor in NSCLC［M］.New york:springer science+Bussiness media，2014.

［10］張康，鐘運(yùn)超，黃靜靜.Ⅳ期惡性腫瘤患者外周血CD4+CD25+ FOXP3+Treg細(xì)胞的測定［J］.右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，37（5）: 713-4.

［11］Jackson MW，Roberts JS，Heckford SE，et al.A potential autocrine role for vascular endothelial growth factor in prostate Cancer［J］. Cancer Res，2002，62（3）:854-9.

［12］Takahashi A，Kono K，Itakura J，et al.Correlation of vascular endothelial growth factor-C expression with tumor-infiltrating dendritic cells in gastric Cancer［J］.Oncology，2002，62（2）:121-7.

2016-03-11

鐘運(yùn)超，主治醫(yī)師，本科，E-mail:214878684@qq.com

張康，主任醫(yī)師，碩士研究生，E-mail:zlk2827120@126.com