綠茶提取物對紅曲黃酒釀造特性的影響

林曉婕，黃飛，何志剛，梁璋成，李維新

福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所，福建省農(nóng)產(chǎn)品（食品）加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350003

綠茶提取物對紅曲黃酒釀造特性的影響

林曉婕，黃飛，何志剛*，梁璋成，李維新

福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所，福建省農(nóng)產(chǎn)品（食品）加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350003

研究了綠茶提取物（Green tea extract, GTE）對紅曲黃酒釀造過程中紅曲霉和酵母菌的生物量、產(chǎn)酶特性及其釀造特性的影響。在傳統(tǒng)紅曲黃酒釀造工藝的基礎(chǔ)上，添加不同濃度醇提取的GTE共發(fā)酵，研究GTE對紅曲霉和酵母的生長代謝產(chǎn)酶總量及紅曲黃酒出酒率的影響。結(jié)果表明，添加2%的GTE進(jìn)行共發(fā)酵，純水提取的GTE和15%的乙醇溶液提取的GTE，其EGCG、ECG含量較低，對紅曲霉和酵母菌的生長、代謝產(chǎn)酶均有促進(jìn)作用，與對照相比紅曲霉生物量分別提高2.4%和5.0%，產(chǎn)酶總量分別提高26.4%和47.8%，淀粉酶酶活分別提高了6.3%和11.8%；酵母菌生物量分別提高了9.4%和10.4%，產(chǎn)酶總量分別提高了21.2%和30.5%；出酒率分別提高了10.67和13.87百分點(diǎn)。75%的乙醇溶液提取的GTE，其EGCG、ECG含量較高，對紅曲霉產(chǎn)酶和酵母菌的生長、代謝產(chǎn)酶有抑制作用，與對照相比出酒率降低了9.28百分點(diǎn)。

綠茶提取物；紅曲黃酒；紅曲霉；酵母菌

福建紅曲黃酒以糯米為主要原料，紅曲米為糖化劑，用山泉精釀而成。傳統(tǒng)黃酒存在熱性高，易“上火”，色澤不穩(wěn)定等問題[1-3]。為此，本課題組研究了影響紅曲黃酒寒熱性的相關(guān)因子，通過綠茶共發(fā)酵技術(shù)，研制出了溫和清爽型的紅曲茶黃酒。前期研究結(jié)果表明，在紅曲黃酒釀造過程中，添加綠茶共發(fā)酵，不但顯著降低了黃酒的熱度，而且有利于黃酒紅色、黃色色價(jià)的保持，同時(shí)可明顯提高黃酒的出酒率[4]，但添加綠茶共發(fā)酵對紅曲黃酒釀造特性的影響尚不明確。

紅曲霉、酵母菌是紅曲黃酒發(fā)酵過程中起到糖化發(fā)酵的關(guān)鍵微生物。紅曲霉是一種小型絲狀腐生真菌，能代謝產(chǎn)生淀粉酶、糖化酶、酯化酶等，其中，淀粉酶在紅曲黃酒釀造過程中起到液化作用。紅曲霉生長及產(chǎn)酶能力直接影響糯米的液化水平[5-7]。酵母是酒精發(fā)酵的關(guān)鍵菌，能夠在無氧條件下代謝糖產(chǎn)生酒精，其生長與產(chǎn)酶能力顯著影響釀酒過程中酒精發(fā)酵生成效率和最終產(chǎn)品品質(zhì)[8]。因此，紅曲霉及酵母的生長及發(fā)酵能力將直接影響到出酒率。

本文研究不同濃度醇提取的綠茶提取物對紅曲霉、酵母菌的生物量、酶學(xué)及釀造特性的影響，以期為優(yōu)化黃酒釀制工藝參數(shù)等提供理論依據(jù)，在溫和型黃酒釀造的深入開發(fā)和應(yīng)用方面提供技術(shù)支持。

1 試驗(yàn)材料

1.1原料

天山綠茶，寧德蕉城區(qū)市購；紅曲霉L-25、酵母菌JH301，由本實(shí)驗(yàn)室自主選育、保存；古田平湖紅曲米，市購。

1.2儀器與試劑

1.2.1儀器

E2695型高效液相色譜儀及2998型光電二極管陣列檢測器，美國Waters公司；DHG-9070型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；GX-04多功能粉碎機(jī)，上海高翔食品機(jī)械廠；KQ-300VDE型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋，上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；BS224S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；UV-1750紫外分光光度計(jì)，島津儀器有限公司；SPX智能型生化培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；YXQ-LS-505II立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2.2試劑

標(biāo)準(zhǔn)品均購自美國sigma公司；淀粉酶試劑盒購自南京建成生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)AR級。

1.2.3培養(yǎng)基

（1）紅曲霉活化培養(yǎng)基：NaNO30.2%、KH2PO40.2%、MgSO40.1%，葡萄糖6%，蛋白胨2%，pH自然，加玻璃珠，121℃滅菌20min備用。

（2）紅曲產(chǎn)酶培養(yǎng)基：蛋白胨0.5%、酵母膏0.5%、可溶性淀粉3%、CaCl2·2H2O 0.05%、MnCl2·4H2O 0.05%、MgSO4·7H2O 0.05%、KH2PO40.1%、pH 7.0～7.2、121℃滅菌20min備用。

（3）麥芽培養(yǎng)基：10%麥芽汁1 L，pH 5.4，121℃滅菌20min備用。

（4）酒精發(fā)酵培養(yǎng)基：稱取一定量的糯米，浸泡過夜后瀝干、蒸煮、冷卻至60℃左右，添加1.5倍的無菌水，再分別加入420 U·g-1的α-淀粉酶和3 360 U·g-1糖化酶，于60℃條件下酶解2 h，冷卻，配制成固形物含量約30%的糖化液，以乳酸調(diào)整pH值為4.0，離心后分裝于各發(fā)酵瓶中，煮沸10min，然后冷卻備用。

2 試驗(yàn)方法

2.1綠茶提取物制備

為了模仿黃酒發(fā)酵過程中溶劑對綠茶活性物質(zhì)的提取模式，因此選擇了發(fā)酵初期溶劑模式（即純水）和發(fā)酵終產(chǎn)物溶劑模式（即15%的乙醇溶液）分別提取綠茶活性物質(zhì)，并參考多酚提取方式[9-10]選擇75%的乙醇溶液提取綠茶酚類物質(zhì)。

綠茶用多功能粉碎機(jī)打成粉末，精確稱取適量粉末，固液比1∶20，分別加50mL的純水、15%的乙醇溶液、75%的乙醇溶液，超聲波100 Hz，40℃提取40min，分別得到純水提取的GTE（GTE1）、15%的乙醇溶液提取的GTE（GTE2）和75%的乙醇溶液提取的GTE（GTE3）[9-10]，分別分析其多酚含量。

2.2紅曲霉生長與產(chǎn)酶水平試驗(yàn)

將紅曲霉接入活化培養(yǎng)基，30℃，150 r·min-1搖床培養(yǎng)6 d，備用。產(chǎn)酶培養(yǎng)基中分別添加2%綠茶提取物GTE1、GTE2、GTE3，以添加2%的無菌水為對照（CK），接入活化好的紅曲霉，接種量5%，30℃，150 r·min-1搖床培養(yǎng)6 d，檢測紅曲霉生長量、產(chǎn)酶情況[11]。

2.3酵母菌生長、產(chǎn)酶水平及發(fā)酵試驗(yàn)

將酵母菌接入麥芽培養(yǎng)基，25℃恒溫培養(yǎng)24 h，備用。另取麥芽培養(yǎng)基，分別添加2%綠茶提取物GTE1、GTE2、GTE3，以添加2%的無菌水為對照（CK），接入活化的酵母菌，25℃過夜培養(yǎng)24 h，考察酵母菌的生長、產(chǎn)酶情況。

酒精發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加2%綠茶提取物GTE1、GTE2、GTE3，以添加2%的無菌水為對照（CK），接入活化好的酵母菌，接種量為5%，25℃下恒溫發(fā)酵，至發(fā)酵結(jié)束后，取發(fā)酵液4 800 r·min-1離心10min，取上清液，檢測酒精度、殘?zhí)侵笜?biāo)[12]。

2.4綠茶提取物對出酒率的影響

取5 kg容量酒壇，加入2.4 kg水，100g古田紅曲米，浸泡過夜。加入經(jīng)浸泡、蒸煮、攤涼的糯米飯1.6 kg，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1‰的綠茶（GT）、2%的GTE1、GTE2、GTE3，攪拌均勻后在室溫下發(fā)酵，以加入2%的無菌水為對照（CK），發(fā)酵結(jié)束后檢測酒精度、出酒率和總酸。

2.5檢測方法

2.5.1酚類的測量方法

采用高效液相色譜法[13]測定多酚含量，采用GB/T 21733—2008茶飲料[14]中的方法測定總酚含量。

2.5.2氨基酸的測定

采用GB/T 5009.124—2003食品中氨基酸的測定[15]中所列方法測定氨基酸含量。

2.5.3菌體生物量的測定

霉菌生物量的測定：發(fā)酵液的菌絲體經(jīng)過濾，60℃烘干，稱重，以重量法表示[11]；酵母生物量的測定：采用濁度計(jì)法[16]，發(fā)酵液稀釋10倍后，在660nm下檢測吸光度，扣除綠茶提取物的吸光度，以濁度增量OD600表示酵母生長量。

2.5.4霉菌、酵母菌產(chǎn)酶總量的測定

發(fā)酵液離心取上清液，分別以添加2%的無菌水、GTE1、GTE2、GTE3的培養(yǎng)基為空白，采用考馬斯亮藍(lán)法[17]測定上清液蛋白質(zhì)含量，以蛋白質(zhì)含量表示產(chǎn)酶總量。

2.5.5淀粉酶酶活的測定

采用試劑盒法測定上清液淀粉酶酶活力[18]。淀粉酶酶活定義：樣品的淀粉酶酶活力單位即1g紅曲米在40℃、pH 6.0的條件下，1 h液化1 mg可溶性淀粉，即為1個(gè)淀粉酶酶活力單位（U·g-1）。

2.5.6酒精度及總糖的測定

酒精度：采用高效液相色譜法測定[19]；殘?zhí)恰⒖偹釡y定：參考GB/T 13662—2008 黃酒[20]中總糖、總酸的檢測；出酒率：以成品酒15°計(jì)，按以下公式計(jì)算：出酒率%=酒精度%×出酒量（kg）/大米用量（kg）/15%

2.6數(shù)據(jù)分析

采用DPS數(shù)據(jù)軟件進(jìn)行顯著性分析。

3 結(jié)果與分析

3.1綠茶提取物的主要生化成分

由圖1可知，隨著提取溶劑中乙醇濃度的增大，總酚得率明顯上升，當(dāng)提取液為75%乙醇水溶液時(shí)，總酚含量高達(dá)2.022 mg·mL-1。這可能是因?yàn)轺焚|(zhì)、酚類具有較強(qiáng)的極性，易溶于乙醇等極性溶劑。圖1和表1說明，提取物中含有豐富的蛋白質(zhì)、糖類和氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)。從表2中可以看出，提取物GTE3中EGCG和ECG含量分別為1.243 mg·mL-1和0.263 mg·mL-1，隨著提取溶劑中乙醇濃度的增大，酯型兒茶素EGCG、ECG含量明顯增加，這與劉湘、王增盛等的研究[21-22]相符。

圖1　綠茶提取物的主要營養(yǎng)成分Fig. 1 Essential nutrient ingreen tea extracts

表1　綠茶提取物的氨基酸含量Table 1 Amino acids ingreen tea extracts

表2　綠茶提取物的多酚含量Table 2 Polyphenols ingreen tea extracts

3.2綠茶提取物對紅曲霉生長及產(chǎn)酶特性的影響

綠茶提取物對紅曲霉生長代謝相關(guān)指標(biāo)的影響結(jié)果如表3所示。從表中可以看出，與CK相比，添加GTE1的紅曲霉生物量提高了2.4%，達(dá)顯著水平（P＜0.05），產(chǎn)酶總量和淀粉酶酶活分別較CK提高了26.4%和6.3%，達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。添加GTE2的紅曲霉生物量、產(chǎn)酶總量和淀粉酶酶活分別較CK提高了5.0%、47.8%和11.8%，三者均達(dá)極顯著水平（P＜0.01）?？梢哉f明，水和低濃度醇溶劑提取的GTE1和GTE2中EGCG、ECG含量都較低，對紅曲霉生長、代謝產(chǎn)酶有促進(jìn)作用。這也間接說明，在發(fā)酵后期，隨著酒體的變化，綠茶浸出物內(nèi)溶物質(zhì)的改變，提取物對紅曲霉生長和產(chǎn)酶代謝的促進(jìn)作用逐漸加大。GTE3對紅曲霉的生長雖然沒有明顯的抑制作用，但產(chǎn)酶總量較CK下降10.4%，達(dá)顯著水平（P＜0.05），可以說明，GTE3對紅曲霉的產(chǎn)酶代謝有抑制作用，這可能是因?yàn)檩^高濃度的茶多酚能夠下調(diào)曲霉相關(guān)基因的表達(dá)[23-24]。

3.3綠茶提取物對酵母菌生長及產(chǎn)酶總量的影響

綠茶提取物對酵母菌生長代謝的相關(guān)指標(biāo)測定結(jié)果如表4所示。表4表明，與CK相比，添加GTE1和GTE2處理的生物量分別提高了9.4%和10.4%，產(chǎn)酶總量分別較CK提高了21.2%和30.5%，均達(dá)極顯著水平（P＜0.01）；酒精度分別較CK高0.18和0.25百分點(diǎn)，殘?zhí)墙档土?3.8%和26.0%，可以說明，GTE1和GTE2中EGCG、ECG含量較低，對酵母菌生長和產(chǎn)酶總量有促進(jìn)作用，進(jìn)而促進(jìn)了酵母代謝糖類產(chǎn)生酒精。與CK相比，添加GTE3處理的生物量和產(chǎn)酶總量分別下降了7.4%和8.5%，酒精度下降了0.42百分點(diǎn)，殘?zhí)翘岣吡?.9倍，可以說明，GTE3中EGCG、ECG含量較高，對酵母菌生長和產(chǎn)酶代謝有抑制作用，因此，降低了糖類的轉(zhuǎn)化率，降低了發(fā)酵產(chǎn)物的酒精度。付慧等[25-27]在茶多酚對酵母等真菌生長代謝影響的研究中表明，茶多酚對真菌無抑制作用。Yongli Wang[28]等研究表明，在茶多酚低添加量（100mg·kg-1）的條件下，培根中酵母菌的微生物總數(shù)較空白對照增加；在高添加量（＞200mg·kg-1）的條件下，培根中酵母菌微生物總量下降。這可能是因?yàn)榈蜐舛鹊腅GCG、ECG促進(jìn)了酵母菌的生長，而高濃度的EGCG、ECG抑制了酵母菌的生長，與本文研究結(jié)果相符。

表3　綠茶提取物對紅曲霉生長及產(chǎn)酶特性的影響Table 3 Effects ofgreen tea extracts on thegrowth of monascus and productivity of enzymes

表4　綠茶提取物對酵母菌生長及產(chǎn)酶總量的影響Table 4 Effects ofgreen tea extracts on thegrowth of yeasts and productivity of enzymes

3.4綠茶提取物對出酒率的影響

分別將綠茶和3種提取物加入紅曲黃酒進(jìn)行共發(fā)酵，考察綠茶與各提取物對黃酒品質(zhì)的影響，發(fā)酵結(jié)束后檢測結(jié)果如表5所示。由表5可知，紅曲黃酒CK的酒精度和出酒率分別為11.03%和218.33%。添加綠茶、GTE1、GTE2的紅曲黃酒酒精度分別較CK高0.52、0.50和0.52百分點(diǎn)，出酒率分別較CK高15.4、10.67和13.87百分點(diǎn)，均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），三者之間無顯著差異，可以說明，三者對紅曲黃酒的出酒率均有顯著的促進(jìn)作用，GTE1和GTE2對紅曲黃酒釀造產(chǎn)物的影響和綠茶的影響較為接近。添加GTE3的紅曲黃酒酒精度和出酒率分別較CK降低了0.35和9.28百分點(diǎn)。在試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，添加綠茶、GTE1和GTE2的紅曲黃酒總酸較CK低了1.0g·L-1左右，添加GTE3的紅曲黃酒總酸較CK低約1.5g·L-1，可以說明，綠茶及其提取物都能抑制酒體產(chǎn)酸。當(dāng)添加的提取物總酚含量超過2mg·L-1時(shí)，酒體的抑制酸化效果大大增加。付慧[25]等在茶多酚對細(xì)菌生長代謝的影響研究中發(fā)現(xiàn)，茶多酚對細(xì)菌有較強(qiáng)的抑制活性。由于茶多酚抑制了細(xì)菌的生長代謝，抑制了細(xì)菌對營養(yǎng)物質(zhì)的競爭利用，從而抑制了黃酒酸化。

表5　綠茶提取物對紅曲黃酒釀造出酒率的影響Table 5 Effects ofgreen tea extracts on alcohol yield of hongquglutinous rice wine

4 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，GTE1和GTE2能促進(jìn)紅曲霉和酵母菌的生長代謝和產(chǎn)酶，從而提高紅曲黃酒的出酒率，原因可能有以下三點(diǎn)，第一，GTE中茶多酚主要為酯型兒茶素EGCG和ECG，釀酒酵母和曲霉能以之為碳源進(jìn)行代謝[29]，在發(fā)酵過程中，霉菌或酵母菌產(chǎn)生單寧酶，水解酯型兒茶素[30]；第二，GTE1和GTE2中微量的EGCG、ECG等兒茶素，提高了微生物的抗氧化能力[31]，有利于保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)[19]，延長酵母菌和霉菌的時(shí)序壽命（Chronological life span，CLS），從而促進(jìn)了霉菌的代謝和酵母菌的生長代謝；第三，GTE1和GTE2的提取溶劑為強(qiáng)極性溶劑，提取液中含有種類豐富的糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，為酵母提供了生長所需的碳、氮源[32]。Helena Orozco等[33]研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸能補(bǔ)充酵母新陳代謝中的氨基酸不足，延長酵母最長壽命（Maximum life span），并在酒類發(fā)酵后期保持細(xì)胞完整性。高醇濃度溶劑提取的GTE3中EGCG、ECG含量較高，反而起抑制作用，EGCG、ECG能附著于酵母細(xì)胞膜上，與蛋白質(zhì)結(jié)合降低酵母細(xì)胞膜的透性，與糖蛋白結(jié)合降低細(xì)胞膜的流動性，并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[33]，從而抑制了酵母菌的生長代謝和產(chǎn)酶。GTE3對紅曲霉代謝產(chǎn)酶的影響可能類似于酵母菌，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

添加綠茶提取物能抑制黃酒酸化，主要原因可能是茶多酚能引起細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜損傷，降低細(xì)菌細(xì)胞膜穩(wěn)定性，增加細(xì)菌細(xì)胞膜通透性，致使細(xì)胞周質(zhì)和胞內(nèi)酶等組分發(fā)生泄漏，使細(xì)菌內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸、能量轉(zhuǎn)化、信息傳遞等生理代謝發(fā)生紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌活性下降，引起細(xì)菌死亡[34-35]在發(fā)酵過程中，黃酒中的大部分有機(jī)酸主要由乳酸菌等細(xì)菌產(chǎn)生，釀造過程中添加茶多酚，使產(chǎn)有機(jī)酸的乳酸菌得到抑制。

由于綠茶種類很多，不同產(chǎn)地、不同加工工藝的綠茶，其EGCG、ECG、氨基酸等物質(zhì)含量也有差別。不同來源綠茶的提取物，以及EGCG、ECG純品對紅曲黃酒釀酒品質(zhì)的影響也有差別，對發(fā)酵關(guān)鍵微生物紅曲霉、酵母菌和乳酸菌等作用機(jī)制的研究還有待進(jìn)一步深入。

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Effects of Green Tea Extracts on Brewing Characteristics of Hongqu Glutinous Rice Wine

LIN Xiaojie, HUANG Fei, HE Zhigang*, LIANG Zhangcheng, LI Weixin
Institute of Agricultural Engineering Technology, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fujian Key Laboratory of Agricultural Product (Food) Processing, Fuzhou 350003, China

The effects ofgreen tea extracts on the biomass of monascus and yeasts, productivity of enzymes and brewing characteristics were investigated. Based on traditional fermentation technology for hongquglutinous rice wine,green tea extracts by different ethanol solvents were added for fermentation and their effects ongrowth and metabolites of monascus and yeasts as well as alcohol yield were studied. The results showed that when 2% GTE was added for fermentation,green tea extracts by water or 15% ethanol-water solution resulted in relatively low EGCG and ECG. Moreover, they also exhibited promoting effects ongrowth of monascus, yeasts and the metabolites of enzymes. For example, the biomass of monascus increased by 2.4% and 5.0%, the productivity of enzymes increased by 26.4% and 47.8%, diastase activity increased by 6.3% and 11.8%, the biomass of yeasts increased by 9.4% and 10.4%, the productivity of enzymes increased by 21.2% and 30.5%, the enzyme activity increased by 6.3% and 11.8%, the alcohol yield increased by 10.67 and 13.87 percent point with the control. Extracts ofgreen tea by 75% ethanol-water solution led to the highest EGCG and ECG, which exhibited negative effects on thegrowth of monascus and yeasts and the productivity of enzymes in monascus. The alcohol yield also decreased by 9.28 percent point.

green tea extracts, hongquglutinous rice wine, monascus, yeast

TS272.5+1；TS261.4

A

1000-369X（2016）06-631-08

2016-06-15

2016-08-23

福建省屬公益類科研院所基本科研專項(xiàng)（2014R1015-5、2016R1014-7）、福州市科技項(xiàng)目（2015-G-75）。

林曉婕，女，碩士，助理研究員，主要從事食品資源開發(fā)與利用研究，E-mail：njgzx@163.com。*通訊作者