永登枸杞鮮果晾曬過程中霉腐病原真菌的分離鑒定

袁惠君,李虎軍,賈鴻震,鞏慧玲,馮再平

(蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730050)

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永登枸杞鮮果晾曬過程中霉腐病原真菌的分離鑒定

袁惠君,李虎軍,賈鴻震,鞏慧玲,馮再平

(蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730050)

以永登枸杞鮮果晾曬過程中產(chǎn)生的霉腐果為材料,分離、純化、鑒定了導(dǎo)致霉腐病發(fā)生的病原真菌。結(jié)果表明,枸杞鮮果鋪在曬床上2～4 d內(nèi)出現(xiàn)霉腐病初期癥狀,發(fā)病部位常在果柄端或擦傷處。鏈格孢(Alternariaalternata)和戴爾凱氏有孢圓酵母(Torulasporadelbrueckii)是導(dǎo)致霉腐病發(fā)生的病原真菌。

枸杞,鏈格孢,戴爾凱氏有孢圓酵母,鑒定

枸杞(LyciumbarbarumL.)是一種在西北地區(qū)廣泛栽培的、有重要經(jīng)濟價值的多年生落葉灌木,其成熟果實作為一種名貴中藥和滋補品[1],已有3000多年的藥用和食用歷史[2],具有補腎養(yǎng)肝、潤肺明目,增強免疫力、防衰老、降血壓、降血脂、抗腫瘤、抗氧化等多方面的藥用和保健價值,在國內(nèi)外享有盛譽[3-4]。但是,枸杞鮮果不耐貯藏,常溫下3～5 d內(nèi)即有30%～90%的鮮果霉爛。目前枸杞鮮果采收后主要的加工方法是晾曬干制[5]。由于鮮果晾曬周期較長,一般夏果需要4～5 d,秋果7～9 d才能達到干制成品的要求[5],所以晾曬過程中常發(fā)生大面積霉腐,特別在陰雨天溫度低、濕度大的情況下,可導(dǎo)致60%～100%霉爛,造成巨大經(jīng)濟損失,已成為制約枸杞產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵問題之一。研究表明:導(dǎo)致新疆枸杞鮮果采后霉腐的病原真菌主要有青霉屬(Penicilliumsp.)、鏈格孢屬(Alternariasp.)、木霉屬(Trichodermasp.)、曲霉屬的黑曲霉(Aspergillusniger)、黃曲霉(Aspergillusflavus)[6]。由于不同地域的氣候、濕度等條件存在差異,同一個作物品種導(dǎo)致霉腐的病原微生物類群可能不同。永登枸杞鮮果干制過程中霉腐病原菌方面的研究未見報道。

本研究分離、鑒定了永登枸杞鮮果晾曬過程中導(dǎo)致霉腐的病原真菌,將為科學(xué)防治枸杞果實霉腐,降低枸杞子加工的成本,提高成品品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枸杞霉腐果實 2014年8月采自甘肅省蘭州市永登縣上川鎮(zhèn)枸杞生產(chǎn)合作社曬床,置于無菌安倍瓶中當(dāng)天運至本校實驗室進行處理;次氯酸鈉(10%) 上海普瑞生物研究所;無水乙醇(≥99.0%)分析純(AR) 天津市大茂化學(xué)試劑廠;葡萄糖 分析純(AR),天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;瓊脂粉 生化試劑(BR),天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

MGC-1000HP-2型人工氣候箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;SW-CJ-1FD型超凈工作臺 吳江市凈化設(shè)備總廠;GZX-9030MBE型烘箱 上海博訊醫(yī)療設(shè)備廠;YX-24LDJ型手提式高壓滅菌鍋 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司;AB104-N型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;BCD-551WKM型冰箱 美的集團有限公司;日立HITACHI S-3400N型掃描電鏡 日本Hitach公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 永登枸杞果實霉腐癥狀及病原菌的分離和純化 隨機選取枸杞鮮果,每10粒一組置于無菌培養(yǎng)皿中,在露天自然通風(fēng)條件下晾曬2、4、6 d后觀察霉腐癥狀。

病原菌的分離和純化采用組織分離法[7],選擇晾曬3 d病斑典型的發(fā)病果實沖洗干凈后,在病健交界處剪下5 mm×5 mm的小塊組織,先用2%的次氯酸鈉表面消毒8 min,無菌水洗5遍,再用75%的酒精消毒30 s,無菌水洗8遍后,移至滅菌培養(yǎng)皿中加1 mL無菌水搗碎,用接種環(huán)蘸取含菌組織液在PDA平板上劃線,28 ℃培養(yǎng)并挑取單菌落,連續(xù)純化3次后的純培養(yǎng)物保存于PDA斜面培養(yǎng)基上置于4 ℃冰箱貯存?zhèn)溆肹8-9]。

1.2.2 病原真菌的形態(tài)學(xué)鑒定 將代表菌株分別置于不同的培養(yǎng)基上。霉菌在馬鈴薯胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基(PCA)25 ℃下培養(yǎng)5～7 d,酵母菌在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基28 ℃下培養(yǎng)3 d,觀察記載菌落培養(yǎng)性狀。挑取霉菌菌絲和酵母制成水裝片,在普通光學(xué)顯微鏡下觀察形態(tài);挑取霉菌菌絲和酵母,粘在樣品臺上,置于液氮中速凍后在掃描電鏡下觀察孢子、細胞等形態(tài)特征。

1.2.3 病原真菌的分子生物學(xué)鑒定 將供試菌株接種到PDA培養(yǎng)基上于25 ℃培養(yǎng)3～5 d后送至大連寶生物工程有限公司進行菌株基因組DNA提取、PCR擴增和測序,將所得序列與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)進行比對。并用MEGA 5.1進行系統(tǒng)發(fā)育分析和進化樹構(gòu)建,用Neighbor joining法構(gòu)建進化樹,自展次數(shù)為1000次。

1.2.4 致病性測定 25 ℃條件下,純化的培養(yǎng)物在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～5 d后用打孔器鉆取直徑5 mm菌餅備用。挑選健康完整的永登縣上川鎮(zhèn)枸杞生產(chǎn)合作社生產(chǎn)的枸杞干果,用無菌水浸泡1 h復(fù)水模擬晾曬3 d的枸杞果實,用2%的次氯酸鈉表面消毒8 min,無菌水洗5遍,再用75%的酒精消毒30 s,無菌水洗8遍后,用無菌解剖針刺傷果實,將直徑5 mm菌餅覆蓋在傷口處置于無菌培養(yǎng)皿中在25 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 d后觀察并記載發(fā)病情況[10],以傷口處覆蓋瓊脂餅的果實為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 永登枸杞晾曬過程中果實霉腐病癥狀

從53份發(fā)病枸杞果實樣品中共分離得到107個菌落。根據(jù)菌落特征主要為霉菌和酵母兩類真菌,各霉菌菌落形態(tài)上沒有顯著差異,酵母菌菌落為白色。從出現(xiàn)頻率來看,霉菌菌落92個,占菌落總數(shù)的86%;白色酵母菌菌落15個,占菌落總數(shù)的14%。枸杞鮮果干制過程中的霉腐主要發(fā)生在鮮果鋪在曬床上2～4 d內(nèi)。發(fā)病初期,常在果柄端或擦傷、破皮處長出白色至灰白色菌絲,果實病變部位由鮮紅色轉(zhuǎn)為暗紅色至黑色(圖1B、圖1C);嚴重時病斑不斷擴大,深入果實內(nèi)部,使局部或整粒果實軟腐變黑,表面被霉菌菌絲包裹,并擴散感染鄰近的健康果實(圖1D)。

圖1 果實的霉腐病癥狀Fig.1 Rot symptoms of the Yongdeng barbary wolfberry fruits注:A:永登枸杞鮮果;B:晾曬2 d(B)、 C:晾曬4 d、D:晾曬6 d后果實。

圖2 霉腐病原菌鏈格孢的菌落(A,B)、 分生孢子和分生孢子梗(C,D)形態(tài)特征Fig.2 Colony(A,B),conidia and conidiophores (C,D)of the pathogen A. alternata 注:A、B:霉腐病原菌鏈格孢的菌落; C、D:分生孢子和分生孢子梗。

2.2 病原真菌的形態(tài)特征及分子生物學(xué)鑒定

從92個霉菌菌落中隨機挑選g7菌株和g16菌株作為代表菌株,25 ℃條件下,在PCA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d形成直徑為54～57 mm的圓形菌落。菌落平展,灰色至暗青褐色,表面密絨狀,邊緣整齊背面灰白色至黑褐色,有同心輪紋(圖2A,B)。菌絲有分隔,多分枝;分生孢子梗單生或分枝,直立,直或微彎曲;分生孢子單生或形成短鏈,倒棒形,卵形,倒梨形或近橢圓形,黃褐色,表面光滑或有微刺,具有3～7個橫膈,0～3個縱或斜隔膜,主分隔處不隘縮或略隘縮,孢身長10～40 μm,寬5～12 μm;短喙柱狀或錐狀(圖2C,D)。用 rDNA-ITS區(qū)引物對g7和g16菌株進行PCR擴增,得到481 bp的rDNA-ITS序列,與GenBank中收錄的序列進行BLAST比對,結(jié)果表明:該菌與鏈格孢(Alternariaalternata)和細極鏈格孢菌(Alternariatenuissima)的rDNA-ITS序列相似性均達100%,但是細極鏈格形成超過10個孢子連成的無分支孢子鏈,而本研究中g(shù)7和g16菌株分生孢子單生或形成短鏈(圖2),與鏈格孢分生孢子形態(tài)和產(chǎn)孢表型相符[11]。根據(jù)上述菌株的形態(tài)特征和ITS序列分析結(jié)果(圖3),將g7和g16菌株鑒定為鏈格孢(Alternariaalternata)。

圖3 以ITS-rDNA 基因序列 為分子標記的g7和g16菌株系統(tǒng)進化樹Fig.3 The phylogenetic tree of g7 and g16 strain based on ITS-rDNA sequence

鏈格孢寄主范圍廣泛,是多種鮮果采后貯藏期間的病原菌[12-14]。蘭璞等[6]的研究結(jié)果表明鏈格孢屬(Alternariasp.)真菌是導(dǎo)致新疆枸杞采后霉腐病的主要病原菌之一,與本研究結(jié)果相符。鏈格孢屬(Alternariasp.)真菌也是寧夏枸杞(Lyciumbarbarum)莖和果實內(nèi)生真菌的優(yōu)勢種群[15-16]。干制過程中可能由于溫度、濕度、創(chuàng)傷、離體果實抗病能力下降等原因,引發(fā)鏈格孢快速生長,導(dǎo)致霉腐病爆發(fā),揭示其中的機理將為下一步有效地控制病原菌的生長繁殖、抑制病害發(fā)生、提高枸杞子品質(zhì)提供理論依據(jù)。

從形成白色酵母菌菌落的菌株中隨機挑選g22W菌株為代表在28 ℃、麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d形成直徑為0.5～1 cm的白色菌落,表面凸起,光滑,不透明;油鏡和掃描電鏡下單個菌體均為球形或近球形,直徑約2.5～5 μm,多邊芽殖(圖4)。用rDNA-ITS區(qū)引物進行PCR擴增,得到該菌株717 bp的rDNA-ITS序列,與GenBank中收錄的戴爾凱氏有孢圓酵母菌(Torulasporadelbrueckii)rDNA-ITS序列進行BLAST比對,序列相似度均達99%～100%。根據(jù)上述形態(tài)和分子生物學(xué)特征(圖5),將g22W菌株鑒定為戴爾凱氏有孢圓酵母(Torulasporadelbrueckii)。

圖4 霉腐病原菌戴爾凱氏有孢圓酵母的 菌落(A)和細胞(B,C)形態(tài)Fig.4 Colony(A)and cell morphology(B,C)of the pathogen T. delbrueckii

圖5 以ITS-rDNA 基因序列為 分子標記的g22W菌株系統(tǒng)進化樹Fig.5 The phylogenetic tree of g22W strain based on ITS-rDNA sequence

枸杞鮮果富含多糖類物質(zhì)[1,4],擦傷、破皮處和果肉暴露在空氣中的果柄端都極易受酵母菌侵染,導(dǎo)致果實發(fā)酵腐壞。

2.3 致病性測定

用針刺法接種病原真菌5 d后,果實傷口處均發(fā)病。在接種鏈格孢的針孔處形成圓形灰黑色小菌落,果實病變部位由鮮紅色轉(zhuǎn)為暗紅色至黑色(圖6);在接種戴爾凱氏有孢圓酵母的針孔處形成白色酵母菌菌落(圖6)。在接種部位取發(fā)病組織分離純化后再次獲得了接種菌。根據(jù)柯赫氏法則,表明鏈格孢(Alternariaalternata)和戴爾凱氏有孢圓酵母(Torulasporadelbrueckii)是永登枸杞晾曬過程中果實霉腐病的致病菌。

圖6 針刺法接種病原真菌后傷口發(fā)病情況Fig.6 Symptoms of the diseased fruit after inoculation

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,永登枸杞鮮果在晾曬過程中的霉腐病主要在鮮果鋪床后2～4 d內(nèi)發(fā)生,發(fā)病部位常在果柄端或擦傷、破皮處,并能擴散感染鄰近的健康果實。鏈格孢(Alternariaalternata)和戴爾凱氏有孢圓酵母(Torulasporadelbrueckii)是永登枸杞鮮果在晾曬過程中導(dǎo)致霉腐病發(fā)生的病原真菌。鏈格孢菌能產(chǎn)生毒素[17],本研究中從枸杞霉腐果中分離的鏈格孢菌是否產(chǎn)生毒素及其對人體的危害有待進一步研究,但具有潛在的食品安全風(fēng)險。戴爾凱氏有孢圓酵母是果酒釀造中的常見酵母,能影響果酒的香氣[18-19],但在枸杞鮮果晾曬中出現(xiàn)可能影響枸杞子成品風(fēng)味和營養(yǎng)價值。因此,應(yīng)當(dāng)全面制定在枸杞鮮果干制過程中主要霉腐菌污染的限量指標,保證食品安全和品質(zhì)。

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Isolation and identification of the pathogen causing mildew rot of the Yongdeng barbary wolfberry in the air-drying process

YUAN Hui-jun,LI Hu-jun,JIA Hong-zhen,GONG Hui-ling,FENG Zai-ping

(College of Life Science and Engineering,Lanzhou University of Technology,Lanzhou 730050,China)

Thepathogen,causingYongdengbarbarywolfberrymildewrotintheair-dryingprocess,wasisolatedfromdiseasedfruits.Theresultsshowedthatinitialsymptomsofthediseaseappearedwhenfruitswasputonbamboomattwoorfourdayslater.Themainpathogenicsiteswascarpopodiumsidesorscratches.Basedontheresultofpathogenicitytesting,Alternaria alternataandTorulaspora delbrueckiiwasthepathogenofYongdengbarbarywolfberrymildewrot.

barbarywolfberry;Alternaria alternata;Torulaspora delbrueckii;identification

2016-05-10

袁惠君(1974- )，女，碩士，副教授，主要從事果蔬生理及抗逆性研究，E-mail:gsyhj@163.com。

蘭州市科技發(fā)展計劃項目(2012-2-161) ；國家自然科學(xué)基金(31460629) 。

TS255.36

A

1002-0306(2016)21-0135-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.018