綠茶天然茶湯納米聚集體的分離與分析

李 斌,康雨婷,陳忠正,張媛媛,羅 維,林曉蓉

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642)

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綠茶天然茶湯納米聚集體的分離與分析

李 斌,康雨婷,陳忠正,張媛媛,羅 維,林曉蓉*

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642)

為建立快速、有效分離天然茶湯納米聚集體的方法,分析其基本理化組成,本研究以茶水比1∶50的云南大葉種綠茶湯為材料,采用超濾離心技術(shù)分離茶湯納米膠粒,利用動(dòng)態(tài)光散射和激光多普勒測(cè)速技術(shù)分析其直徑、表面電荷等物理化學(xué)特性,比較超濾膜孔徑、離心力、離心時(shí)間對(duì)膠粒分離效果的影響;利用高效液相色譜等技術(shù)分析其茶多酚等理化組分的濃度、比例等分布特性。結(jié)果表明:綠茶天然茶湯(25 ℃)存在大量平均直徑約300 nm、表面帶負(fù)電荷的納米聚集體,其可經(jīng)截留分子量為100 ku的超濾膜、4000×g離心20 min成功分離,該膠粒以蛋白質(zhì)、可溶性糖和茶多酚為主體成分,各兒茶素、生物堿等單體均參與其理化構(gòu)成。結(jié)論:超濾離心技術(shù)是快速分離綠茶天然茶湯納米聚集體的有效手段,該膠粒以蛋白質(zhì)、可溶性糖和茶多酚為主要組分。

綠茶,納米聚集體,超濾,物理化學(xué)特性,理化組成

茶葉[Camelliasinensis(L). O. Kuntze]起源于中國(guó),被譽(yù)為“大自然賜予人類的天然保健飲料”,具有預(yù)防腫瘤、心血管、代謝綜合癥和神經(jīng)組織退化疾病等健康功效[1]。茶多酚、生物堿等是茶葉功效發(fā)揮的化學(xué)基礎(chǔ),其單一組分的功能活性及其作用機(jī)制等已廣泛大量研究[2]。然而在天然茶湯中,茶多酚、生物堿等組分間并非完全以游離化合物的形式存在,各組分的分子間存在復(fù)雜的相互作用[3-5]。納米聚集體是化合物分子自發(fā)結(jié)合形成的納米級(jí)膠粒,廣泛存在于藥物、中藥、食物等單組份或多組分體系,具有強(qiáng)化多組分協(xié)同增效/拮抗競(jìng)爭(zhēng)等相互作用[6]、非特異性吸附可溶性蛋白質(zhì)、可逆抑制酶活性等特性[7],且與化合物的生物利用率、靶向運(yùn)輸?shù)扔嘘P(guān)[8],已成為當(dāng)前中藥、食物等多組分綜合功能特性研究的新方向[9-11]。早在1995年,Gr?ning等已證實(shí)紅茶天然茶湯存在大量平均直徑為200 nm、表面帶負(fù)電荷的球型納米聚集體[12]。2014年,Yi等首次利用截留分子量(MWCO,molecular weight cut-off)為300 ku的透析袋從綠茶湯分離獲得直徑100～300 nm、表面帶負(fù)電荷的納米膠粒,并指出該膠粒以蛋白質(zhì)和糖為主體成分、不含兒茶素與生物堿[13]。但該研究所采用的長(zhǎng)時(shí)間純水透析很可能導(dǎo)致一些結(jié)合作用較弱的組分游離出來(lái),難以還原綠茶天然茶湯納米聚集體的真實(shí)特性,限制了對(duì)茶湯納米聚集體的形成機(jī)制與功能特性等深入研究。目前,納米聚集體的分離方法主要包括以膠粒尺寸大小為分離依據(jù)的凝膠色譜、超濾、透析、場(chǎng)流分離色譜等技術(shù),以及根據(jù)膠粒的比重實(shí)現(xiàn)分離的高速、超速離心等方法。其中,超濾離心技術(shù)以其效率高、耗時(shí)短、不易因稀釋效應(yīng)而改變膠粒組成等優(yōu)勢(shì),已成功運(yùn)用于分離復(fù)方中藥麻杏石甘湯的納米聚集體[14]。

為建立快速、有效的天然茶湯納米聚集體分離方法,分析茶湯納米聚集體的基本理化組成,本研究以云南大葉種綠茶為原料,采用超濾離心技術(shù)分離茶湯(茶水比1∶50)納米聚集體,采用DLS、激光多普勒測(cè)速(LDV,laser Doppler Velocimetry)技術(shù)分析納米聚集體的總光強(qiáng)、平均直徑、Zeta電位和電導(dǎo)率等物理化學(xué)參數(shù),比較超濾膜孔徑、離心力、離心時(shí)間對(duì)納米聚集體分離效果的影響,確定茶湯納米聚集體的超濾離心分離條件;在此基礎(chǔ)上,采用高效液相色譜(HPLC,high performance liquid chromatography)、紫外可見(jiàn)光譜等技術(shù)系統(tǒng)分析茶湯茶多酚、蛋白質(zhì)、可溶性糖、兒茶素、生物堿等組分在納米聚集體的分布特性,初步探討納米聚集體的理化組成特性,以期為深入研究茶湯納米聚集體的形成機(jī)制與功能特性提供必要的技術(shù)方法與初步的理論研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

云南大葉種蒸青綠茶 廣東省華海糖業(yè)發(fā)展有限公司,磨碎篩取20～30目粒徑茶樣;表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG,≥95%)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG,≥98%)、表沒(méi)食子兒茶素(EGC,≥98%)、表兒茶素(EC,≥98%)、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(GCG,≥98%)、兒茶素沒(méi)食子酸酯(CG,≥98%)、沒(méi)食子兒茶素(GC,≥98%)、兒茶素(C,≥98%)、茶堿(TP,≥99.0%)、可可堿(TB,≥99.0%)、色譜純甲酸(≥98%) Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司;咖啡堿(CAF,99.9%) 上海生工生物工程有限公司;色譜純甲醇 美國(guó)Spectrum公司;福林酚試劑(2 mol/L)、牛血清蛋白組分Ⅴ 北京普博欣生物科技有限公司;實(shí)驗(yàn)用水 Milli-Q超純水(電阻率≥18.2 MΩ·cm,電導(dǎo)率約為0.055 μS/cm)。

Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Agilent 1200高效液相系統(tǒng)(包括G1322A真空脫氣裝置、G1311A四元泵、G1329A標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)進(jìn)樣器及G1315D二極管陣列檢測(cè)器) 美國(guó)Agilent公司;Milli-Q Integral 3超純水系統(tǒng)、Amicon Ultra-4離心過(guò)濾器(PES濾膜) Merk-Millipore公司;Centrifuge 5804R冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf A G公司;UV-2102C紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海尤尼科有限公司;Zetasizer Nano ZS 90納米粒度儀 英國(guó)Malvern公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 茶葉浸提與納米聚集體分離 稱取適量磨碎綠茶樣,按1∶50茶水比加入100 ℃預(yù)熱超純水,沸水浴浸提30 min,浸提結(jié)束后,定量濾紙分離茶渣,茶湯冷卻備測(cè)。

取4 mL茶湯,按如下操作分離納米聚集體:采用MWCO為3、10、100 ku的超濾膜,以4000×g離心20 min,并以相同離心條件的常速離心為對(duì)照;采用MWCO為100 ku的超濾膜,以1000、2000、3000、4000×g離心20 min;采用MWCO為100 kDa超濾膜,以4000×g離心10、20、30、40 min。收集上清、納米聚集體部分,茶湯、上清稀釋2倍,備測(cè)。

1.2.2 納米聚集體物理化學(xué)特性分析 參考Lin等方法[15],采用DLS、LDV技術(shù)(25 ℃)測(cè)定綠茶的原始茶湯及納米聚集體的總光強(qiáng)、平均水合直徑(DH,hydrodynamic diameter)和Zeta電位值、電導(dǎo)率。體系總光強(qiáng)是膠粒直徑與數(shù)目的綜合體現(xiàn),在相同條件下,體系總光強(qiáng)與膠粒直徑六次方成正比,與膠粒數(shù)目成正比,即膠粒直徑越大、粒子越多,總光強(qiáng)越大。膠粒Zeta電位的正負(fù)號(hào)代表膠粒表面所帶正電荷或負(fù)電荷,但無(wú)論是正或負(fù)電荷,Zeta電位越大、膠粒間靜電排斥作用越強(qiáng)、膠粒越穩(wěn)定。電導(dǎo)率反映體系帶電離子的濃度。

1.2.3 納米聚集體理化組成分析 參考Lin等方法[15],茶湯、上清和納米聚集體的茶多酚濃度采用福林酚試劑比色法測(cè)定,可溶性蛋白質(zhì)濃度采用Bradford考馬斯亮藍(lán)G-250比色法測(cè)定,可溶性糖濃度采用硫酸-蒽酮比色法測(cè)定。茶湯等樣液經(jīng)0.45 μm膜過(guò)濾后,采用HPLC技術(shù)測(cè)定其EGCG、ECG、EGC、EC、GCG、CG、GC、C等8種兒茶素單體和咖啡堿、可可堿、茶堿3種生物堿單體濃度,采用Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 nm×250 nm,5 μm)進(jìn)行分離,柱溫為40 ℃,以純甲醇(A)和pH2.5、0.2%甲酸(B)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫(0～25 min,流動(dòng)相A比例由19%升至44%),流速為1.0 mL/min,進(jìn)樣量為5 μL,檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm,采用外標(biāo)法計(jì)算各組分濃度。

根據(jù)同一理化組分在茶湯納米聚集體的分布濃度占其原始茶湯濃度的比例計(jì)算其分布比例,以同一組份在原始茶湯的濃度為100%,依次扣除其在常速離心和MWCO為100、10、3 ku的超濾膜所截留納米聚集體的分布比例,分析各組分在不同粒徑范圍的納米聚集體的分布特性。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 所有實(shí)驗(yàn)含3次平行,重復(fù)2次以上,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用SAS 9.0統(tǒng)計(jì)軟件,根據(jù)Fisher最小顯著性差異法進(jìn)行多重比較,分析各樣品的組間差異顯著性,組間差異顯著者用不同上標(biāo)字母表示(p<0.05),并按字母次序依據(jù)數(shù)值由大到小編號(hào),相同字母表示組間差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 超濾膜孔徑對(duì)納米聚集體分離效果的影響

超濾膜孔徑是決定超濾離心技術(shù)選擇性分離納米膠粒的關(guān)鍵因素,為探究超濾膜孔徑對(duì)綠茶納米聚集體的分離效果,本研究首先比較綠茶的原始茶湯及其經(jīng)MWCO為3、10、100 ku超濾膜離心處理、相同離心條件的常速離心處理所得上清的總光強(qiáng),結(jié)果如圖1所示。

圖1 綠茶湯經(jīng)常速離心、超濾離心前后的總光強(qiáng)Fig.1 Total intensity of green tea infusions with or without centrifugation and ultrafiltration assisted with centrifugation

由圖1可知:經(jīng)常速離心后,綠茶原始茶湯總光強(qiáng)下降近30%,說(shuō)明綠茶部分納米膠粒可經(jīng)常速離心分離;但經(jīng)超濾離心處理后,綠茶湯總光強(qiáng)降低幅度超過(guò)99%,MWCO為3、10、100 ku的超濾膜處理后,上清的總光強(qiáng)依次為2.5、2.7、5.2 kcps,說(shuō)明超濾離心可分離綠茶湯絕大部分納米聚集體。

為進(jìn)一步比較不同孔徑超濾膜對(duì)綠茶納米膠粒的分離效果,本文分析了原始茶湯和常速離心、超濾離心分離所得納米膠粒的總光強(qiáng)和平均直徑,結(jié)果如圖2所示。

圖2 綠茶原始茶湯及其常速離心、超濾離心所得 納米膠粒的總光強(qiáng)、平均直徑(A)和Zeta電位、電導(dǎo)率(B)Fig.2 Total intensity and average diameter(A)and Zeta potential and conductivity(B)of nano-colloidal particles separated via centrifugation or ultrafiltration assisted with centrifugation from green tea infusions

由圖2A可知:原始茶湯納米聚集體的平均直徑約300 nm,經(jīng)常速離心分離所得的納米膠粒的平均直徑顯著增大,超過(guò)原始茶湯納米聚集體平均直徑的3倍,但其總光強(qiáng)僅為原始茶湯的25%。說(shuō)明常速離心所得納米膠粒的直徑大、但數(shù)量極少,只能分離茶湯中少量平均直徑約900 nm的大粒子。采用超濾離心分離所得納米聚集體的平均直徑與原始茶湯相當(dāng),但其中僅MWCO為100 ku的超濾膜所分離納米聚集體的總光強(qiáng)與原始茶湯無(wú)顯著差異,說(shuō)明采用MWCO為100 ku的超濾膜能較完全分離在綠茶原始茶湯中占主體的納米聚集體,且超濾過(guò)程不易引起膠粒間聚集等變化。

由圖2B可知:原始茶湯納米聚集體表面帶負(fù)電荷,其Zeta電位約-20 mV;采用常速離心和MWCO為100 ku超濾膜離心所得納米膠粒的Zeta電位均超過(guò)-30 mV,顯著高于原始茶湯,但兩種處理間無(wú)顯著差異;采用MWCO為10、3 ku超濾膜離心所得膠粒的Zeta電位值均顯著高于原始茶湯,但均不超過(guò)-25 mV;超濾膜孔徑越大,其所截留納米聚集體的Zeta電位值越大。原始茶湯的電導(dǎo)率約1.02 mS/cm,但常速離心所得納米膠粒的電導(dǎo)率不到其2%;超濾離心分離的納米膠粒電導(dǎo)率均顯著低于原始茶湯、高于常速離心所得膠粒,且超濾膜孔徑越大,其截留納米膠粒的電導(dǎo)率越小。結(jié)合Zeta電位和電導(dǎo)率分析,初步說(shuō)明綠茶原始茶湯的Zeta電位是由其帶負(fù)電荷的納米聚集體和上清部分帶電離子的共同體現(xiàn),采用MWCO為100 ku的超濾膜可有效分離茶湯納米聚集體,減少上清帶電離子的干擾。

上述結(jié)果說(shuō)明,MWCO為100 ku的超濾膜比3、10 ku的超濾膜更適于分離綠茶天然茶湯納米聚集體,后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用此孔徑的超濾膜。本團(tuán)隊(duì)前期分析發(fā)現(xiàn),綠茶沉淀顆粒的平均直徑為(910.50±100.76) nm、Zeta電位為(-26.67±0.79) mV[16],說(shuō)明本研究中常速離心分離的納米膠粒主要是沉淀顆粒。

2.2 離心力對(duì)納米聚集體分離效果的影響

離心是本研究中超濾膜截留綠茶納米聚集體的主要?jiǎng)恿?故離心力的大小會(huì)直接影響茶湯納米聚集體的分離效果,但本文所用超濾離心裝置只能承受不超過(guò)4000×g的離心力。因此,為探究離心力對(duì)綠茶納米聚集體分離效果的影響,本論文采用MWCO為100 ku的超濾膜,以1000、2000、3000、4000×g離心20 min,處理綠茶湯,比較超濾離心所得納米膠粒的總光強(qiáng)、平均直徑和Zeta電位、電導(dǎo)率,結(jié)果如圖3所示。

圖3 綠茶湯經(jīng)不同離心力超濾離心所得納米膠粒的 總光強(qiáng)、平均直徑(A)和Zeta電位、電導(dǎo)率(B)Fig.3 Total intensity and average diameter(A)and Zeta potential and conductivity(B)of nano-colloidal particles separated via ultrafiltration assisted with different centrifugal forces

由圖3A可知:離心力由1000×g增至2000×g時(shí),所得納米膠粒的總光強(qiáng)顯著增大、但平均直徑無(wú)顯著變化,說(shuō)明將離心力由1000×g增大至2000×g可顯著提高所分離納米膠粒的數(shù)目;繼續(xù)增大離心力,膠?？偣鈴?qiáng)和平均直徑均無(wú)顯著變化。由圖3B可知:隨離心力由1000×g增至2000×g,所分離膠粒的Zeta電位值顯著增大;但繼續(xù)增大離心力至3000×g,膠粒Zeta電位值無(wú)顯著變化;當(dāng)離心力增至4000×g時(shí),膠粒Zeta電位值達(dá)到最大。隨離心力增大,納米膠粒的電導(dǎo)率逐漸減小。上述結(jié)果說(shuō)明,離心力不低于2000×g時(shí),均可分離獲得在原始茶湯中占主體的納米聚集體,但僅當(dāng)離心力達(dá)到4000×g時(shí),才能有效去除上清帶電離子的干擾。因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用4000×g為超濾處理的離心力。

2.3 離心時(shí)間對(duì)納米聚集體分離效果的影響

在初步確定超濾膜孔徑、離心力基礎(chǔ)上,為進(jìn)一步分析離心時(shí)間對(duì)綠茶納米聚集體分離效果的影響,本文采用MWCO為100 ku的超濾膜,固定離心力為4000×g,比較離心時(shí)間為10、20、30、40 min條件下,所分離綠茶納米膠粒的總光強(qiáng)、平均直徑和Zeta電位、電導(dǎo)率,結(jié)果如圖4所示。

圖4 綠茶湯經(jīng)不同超濾離心時(shí)間所得納米膠粒的 總光強(qiáng)、平均直徑(A)和Zeta電位、電導(dǎo)率(B)Fig.4 Total intensity and average diameter(A) and Zeta potential and conductivity(B)of nano-colloidal particles separated via ultrafiltration assisted with centrifugation for different time

由圖4A可知:當(dāng)離心時(shí)間由10 min延長(zhǎng)至20 min時(shí),所分離綠茶湯納米膠粒的總光強(qiáng)和平均直徑均顯著提高;繼續(xù)延長(zhǎng)離心時(shí)間至30 min,納米膠?？偣鈴?qiáng)無(wú)顯著變化,但其平均直徑顯著減小,說(shuō)明所分離納米膠粒的數(shù)量增多,這可能與離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、導(dǎo)致少量納米膠粒解聚有關(guān),但具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證;繼續(xù)將離心時(shí)間由30 min延至40 min,納米膠?？偣鈴?qiáng)和平均直徑均無(wú)顯著變化。由圖4B可知,隨離心時(shí)間延長(zhǎng),納米膠粒的Zeta電位值顯著增大、電導(dǎo)率顯著減小,說(shuō)明延長(zhǎng)離心時(shí)間有利于去除所分離納米膠粒中的帶電離子。綜合圖4A和4B的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,為快速分離茶湯納米膠粒,后續(xù)實(shí)驗(yàn)固定離心時(shí)間為20 min。

2.4 綠茶主要理化組分在納米聚集體的分布特性

納米聚集體是茶湯各理化組分自發(fā)分子結(jié)合的結(jié)果,在上述物理化學(xué)分析的基礎(chǔ)上,為從植物化學(xué)角度初步探討綠茶天然茶湯主要理化組分在不同孔徑超濾膜所分離的納米聚集體中的分布特性,本文分析并比較常速離心和三種不同MWCO超濾膜分離所得納米膠粒中茶多酚、酯型兒茶素、非酯型兒茶素、生物堿、蛋白質(zhì)、可溶性糖等理化組分的濃度,并在此基礎(chǔ)上計(jì)算綠茶原始茶湯(100%)各組分分布于各組納米聚集體的比例,結(jié)果如圖5所示。

圖5 綠茶湯經(jīng)常速離心、超濾離心所得納米聚集體中 主要理化組分的濃度(A)及分布比例(B)Fig.5 Concentrations(A)and percentages(B)of major chemicals in green tea infusions distributed in their nano-aggregates separated via centrifugation or ultrafiltration assisted with centrifugation

由圖5A可知:常速離心分離所得納米聚集體中茶多酚等理化組分濃度最低,隨超濾膜MWCO減小,所截留納米聚集體中茶多酚等理化組分濃度逐漸增大;除采用MWCO為3 ku超濾膜截留的納米聚集體蛋白質(zhì)濃度與原始茶湯相當(dāng)外,其他各處理的蛋白質(zhì)濃度和所有超濾、離心處理的其他組分濃度均顯著低于原始茶湯。各處理所截留納米聚集體的理化組成不同于原始茶湯,原始茶湯各組分濃度大小依次為:茶多酚>酯型兒茶素>非酯型兒茶素>生物堿>蛋白質(zhì)>可溶性糖,但經(jīng)常速離心和超濾處理所得納米聚集體中蛋白質(zhì)、可溶性糖的比重逐漸增大,且隨超濾膜MWCO增大、該特性越突出,而經(jīng)常速離心分離的納米聚集體蛋白質(zhì)濃度更高于茶多酚濃度。

由圖5B可知:綠茶各理化組分在采用常速離心、不同孔徑超濾膜分離的納米聚集體中,均以蛋白質(zhì)的分布比例最高,其次是可溶性糖,茶多酚、兒茶素、生物堿等組分分布在各組納米聚集體的比例相對(duì)較低。以MWCO為100 ku超濾膜分離的占綠茶湯主體的納米聚集體中,各組分的分布比例均未超過(guò)20%,說(shuō)明茶水比為1∶50的綠茶湯中僅部分理化組分參與其主體納米聚集體的形成,大部分理化組分分布在粒徑更小的膠粒、或以游離分子形式存在。

超濾膜孔徑大小的差異是選擇性分離茶湯不同粒徑納米聚集體的前提,但孔徑較小的超濾膜所分離的納米聚集體必然包含大孔徑超濾膜分離的那部分膠粒,因此,為初步分析綠茶主要理化組分在不同粒徑納米聚集體的分布特性,本文在上述分析基礎(chǔ)上,在不同孔徑超濾膜分離的納米聚集體中,減去各組分分布于常速離心所分離的沉淀顆粒及更大一級(jí)孔徑的超濾膜所截留納米膠粒的部分,初步比較綠茶原始茶湯中各組分在各粒徑范圍納米聚集體的分布比例,結(jié)果如表1所示。

由表1可知:茶多酚、酯型兒茶素、非酯型兒茶素、生物堿在各粒徑納米聚集體的分布特性類似,均主體分布在直徑約3～30 nm的小粒子部分;其次是小于3 nm部分(包括以游離形式的化合物);其分布于占茶湯主體的直徑約30～900 nm的納米聚集體的比例均不到10%;而分布在常速離心分離所得的直徑大于900 nm的沉淀顆粒的比例最低(≤2.5%)。蛋白質(zhì)主體分布于直徑約3～30 nm的納米聚集體,但其超過(guò)20%分布在茶湯主體納米聚集體和沉淀顆粒部分,分布在直徑小于3 nm部分的比例最低?？扇苄蕴侵黧w分布于直徑3～30 nm的納米聚集體,其次分布于直徑30～900 nm的納米聚集體和直徑小于3 nm部分,分布于沉淀顆粒的比例較低。

表1 綠茶主要理化成分在茶湯 各部分納米膠粒的分布比例(%)Table 1 Percentages of major chemicals in green tea infusions distributed in their nano-aggregates of different diameter(%)

注:MWCO為10 ku的超濾膜,其截留孔徑約1 nm,理論上可截留直徑大于3 nm的膠粒;MWCO為100 ku的超濾膜,其截留孔徑約10 nm,理論上可截留直徑在30 nm以上的膠粒。

上述結(jié)果說(shuō)明,茶水比為1∶50的綠茶湯中,茶多酚等理化組分均主體分布在直徑約3～30 nm的小粒子中,蛋白質(zhì)、可溶性糖和茶多酚對(duì)占茶湯主體的直徑約30～900 nm的納米聚集體形成可能起關(guān)鍵作用,但兒茶素、生物堿等小分子組分均參與綠茶納米聚集體的構(gòu)成。本研究結(jié)果與Yi等采用透析法分離所得綠茶納米聚集體的理化組成存在明顯差異,該研究發(fā)現(xiàn)綠茶納米聚集體主要含蛋白質(zhì)(54%)和可溶性糖(19%),并未檢測(cè)到兒茶素、生物堿[13]。本團(tuán)隊(duì)采用相同透析條件處理云南大葉種綠茶(茶水比1∶50),茶湯納米聚集體的茶多酚隨純水透析時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸游離到透析袋外部,透析24 h后,被截留的茶多酚僅剩不到2.5%,說(shuō)明綠茶天然茶湯中的茶多酚等小分子組分很容易在長(zhǎng)時(shí)間的純水透析中游離出來(lái),這可能是Yi等經(jīng)純水透析72 h所分離綠茶納米聚集體中未檢測(cè)到兒茶素和生物堿的主要原因。

3 結(jié)論

本研究初步證實(shí)茶水比為1∶50的綠茶天然茶湯中,存在大量平均直徑約300 nm、表面帶負(fù)電荷的納米聚集體,并利用超濾離心技術(shù)(MWCO為100 ku的超濾膜,4000×g離心20 min)成功分離該納米膠粒,揭示其以茶多酚、蛋白質(zhì)和可溶性糖為主體成分,兒茶素、生物堿等組分亦參與該納米聚集體的構(gòu)成,為未來(lái)深入探究天然茶湯納米聚集體的形成機(jī)制與功能特性提供技術(shù)保障和前期研究基礎(chǔ)。

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Separation and characterization of spontaneously assembled nano-aggregates in natural green tea infusions

LI Bin,KANG Yu-ting,CHEN Zhong-zheng,ZHANG Yuan-yuan,LUO Wei,LIN Xiao-rong*

(College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China)

Forthefastandefficientseparationofspontaneouslyassemblednano-aggregatesfromnaturalteainfusionsandforthepreliminarycharacterizationoftheirphysicochemicalandphytochemicalprofiles,ultrafiltrationwasperformedtoseparatenano-aggregatesnaturallyexistedingreenteainfusionsof1∶50tea-waterratiofromCamellia sinensis,assistedwithcentrifugation.Initially,theimpactsofmolecularweightcut-offofultrafiltrationmembranes,centrifugalforcesandcentrifugaltimeonthescatteringintensity,averagediameterofteanano-aggregatesseparatedwereanalyzedbydynamiclightscattering,whiletheirZetapotentialsandconductivitiesweredeterminedvialaserDopplerVelocimetry.Onthisbasis,teapolyphenols,proteins,carbohydrates,catechinsandmethylxanthinesinnano-aggregatesseparatedwithultrafiltrationmembranesofdifferentMWCOweredetectedwithhighperformanceliquidchromatographyandultravioletandvisiblespectrophotometer,inordertoelucidatethechemicalcompositionofgreenteanano-aggregatesandtocharacterizethedistributionfeaturesofvariouschemicalcomponentsinnano-aggregates.Alargenumberofnegatively-chargednano-aggregatesof300nmindiameterwereconfirmedindrinkablegreenteainfusionsat25 ℃.Inaddition,thesecolloidalparticlesweresuccessfullyobtainedbyultrafiltrationmembranesof100kuinMWCOassistedwithcentrifugationof4000×gfor20min.Furthermore,proteins,carbohydratesandteapolyphenolswereindicatedtoconstructthemainbodyofgreenteanano-aggregates,thoughcatechinsandmethylxanthineswerealsofoundintheseparticles.Inconclusion,acombinationbetweenultrafiltrationandcentrifugationprovidedaneffectivemethodfortheseparationofgreenteanano-aggregates.Thesepeculiarnano-colloidalparticleswerecomposedofteapolyphenols,proteinsandcarbohydrates.

greentea;nano-aggregates;ultrafiltration;physicochemicalcharacteristics;chemicalcomposition

2016-05-10

李斌(1960-)，女，博士，教授，研究方向：茶飲料加工與飲料植物功能活性研究，E-mail:bli@scau.edu.cn。

*通訊作者:林曉蓉(1986-)，女，博士，講師，研究方向：茶飲料加工與茶葉多組分互作研究，E-mail:xiaoronglin@scau.edu.cn。

農(nóng)業(yè)部現(xiàn)代茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金(CARS-23)；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金聯(lián)合資助項(xiàng)目(20124404110015)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)21-0105-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.012