HW236-5發(fā)酵產(chǎn)品
——納豆激酶的酶學(xué)特性研究

孫建華，曲曉軍，王金英，于沖，夏海華，原韜，潘鈺，姜宏宇，于麗萍

（1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱 150010；2.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，哈爾濱 150020）

HW236-5發(fā)酵產(chǎn)品
——納豆激酶的酶學(xué)特性研究

孫建華，曲曉軍，王金英，于沖，夏海華，原韜，潘鈺，姜宏宇，于麗萍

（1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱 150010；2.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，哈爾濱 150020）

本次試驗(yàn)所用納豆激酶是由本所分離并命名的HW236-5納豆芽孢桿菌，發(fā)酵大豆經(jīng)提取分離獲得，主要對(duì)納豆激酶的酶學(xué)特性進(jìn)行研究。采用SDS-PAGE法以及Zeta電位法分別測(cè)得納豆激酶的分子量為28 kDa，等電點(diǎn)為8.58，納豆激酶的酶活為62520 U/g。納豆激酶在不同的加熱溫度時(shí)，溫度越高，其酶活越低。NaCl在濃度低于1.35 mol/L時(shí)，對(duì)納豆激酶的酶活起到促進(jìn)作用，但是高于此濃度時(shí)，納豆激酶的酶活明顯受到了抑制。

HW236-5納豆芽孢桿菌；納豆；納豆激酶

納豆激酶最早來(lái)源于日本的一種傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品納豆，它是由275個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽的絲氨酸蛋白酶，其酶活性質(zhì)容易變性失活［1］。1987年，由日本的須見(jiàn)洋行［2］等人發(fā)現(xiàn)并命名。其實(shí)納豆是起源于中國(guó)傳統(tǒng)的發(fā)酵豆制品——豆豉，后被僧人傳入日本［3］。因?yàn)樗莵?lái)源于傳統(tǒng)食品中的一種藥物，并且其毒副作用小，因而具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景并極有可能成為新一代的溶栓藥物［4，5］。但納豆激酶的缺點(diǎn)也限制了其發(fā)展，比如納豆激酶的純酶穩(wěn)定性差、容易失活、不利于儲(chǔ)存以及運(yùn)輸?shù)?，故而引起人們?duì)其酶學(xué)特性的研究［6，7］。

本次試驗(yàn)主要是研究本單位分離自納豆的納豆芽孢桿菌B.Subtlis HW236-5,經(jīng)中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心鑒定并保藏，發(fā)酵大豆［3］提取的納豆激酶在不同條件下的酶學(xué)穩(wěn)定性，采用纖維蛋白-瓊脂糖平板法測(cè)定納豆激酶的酶活。在不同加熱溫度、pH、加熱時(shí)間以及不同NaCl離子強(qiáng)度時(shí)，對(duì)納豆激酶酶活穩(wěn)定性的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

納豆激酶：以黑龍江省科學(xué)院微生物研究所篩選的納豆芽孢桿菌HW236-5發(fā)酵大豆經(jīng)提取獲得。

試劑：實(shí)驗(yàn)涉及的試劑均采用分析純、生化純。

設(shè)備：電子分析天平、電熱恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)等。

1.2 方法

1.2.1 納豆激酶的基礎(chǔ)性質(zhì)

納豆激酶的分子量及等電點(diǎn)。

A.分子量的測(cè)定：采用SDS-PAGE電泳法

SDS-PAGE電泳法操作步驟：

a.將模具準(zhǔn)備好，并用適量的水溶液檢測(cè)其是否漏水，如果漏水，做相應(yīng)的調(diào)整至不漏水，然后進(jìn)行下面的操作。

b.在小燒杯中配制所需濃度的分離膠，配置溶液所需體積按表1，用玻璃棒攪拌使溶液混勻，用移液槍吸取適量的凝膠溶液，并小心加入到不漏水的模具內(nèi)，避免氣泡的出現(xiàn)。加入分離膠結(jié)束后，并在其上層加入一層水或者乙醇，既隔絕空氣又消除氣泡，保證凝膠表面的平整。

c.待分離膠凝結(jié)后，在模具上層插入梳子，并配制濃縮膠，配置溶液所需體積按表1，輕輕攪拌混勻后，加至分離膠的上層。

d.將凝膠模具放入到電泳槽內(nèi)備用，并將配好的電泳緩沖液先加入到內(nèi)部的電泳槽中，使其沒(méi)過(guò)最低的那個(gè)平板，再往外部電泳槽中倒入電泳緩沖液，從而使所制得的凝膠無(wú)論是加樣的部位，還是遠(yuǎn)離加樣的部位，都能夠浸泡在電泳緩沖溶液中。

e.將納豆激酶樣品與配置好的放置在4℃冰箱中備用的樣品緩沖液按1∶5的比例，在帶蓋的試管中混合，然后置于沸水浴中，煮沸5 min后取出，待混合液冷卻后，取10 μL混合樣品加入到樣品位置處。

f.通電，直至樣品線跑至凝膠的底端為止。

g.將凝膠取下，放入培養(yǎng)皿中，倒入染色液，染色1.5 h；最后進(jìn)行脫色處理。

h.將脫色處理后的凝膠，用凝膠成像儀或者相機(jī)進(jìn)行拍照記錄。

表1 SDS-不連續(xù)體系凝膠配置Tab.1 SDS-discontinuous gel system prepared

B等電點(diǎn)的測(cè)定：采用Zeta電位測(cè)定法

納豆激酶的等電點(diǎn)在8.6±0.3的范圍內(nèi)，故用酸堿溶液對(duì)納豆激酶溶液調(diào)節(jié)pH，使pH的范圍在8.4～8.9，并測(cè)定每一個(gè)pH下的Zeta電位。等電點(diǎn)為Zeta電位為零的點(diǎn)。

1.2.2 納豆激酶的酶學(xué)特性研究

納豆激酶酶活性質(zhì)的測(cè)定是參照Astrup法制備纖維蛋白——瓊脂糖平板，并依據(jù)《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部WS2011（X2005）95》中“尿激酶瓊脂糖-纖維蛋白平板法”進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2.1 試劑配制

A.磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mmol/LpH=7.75）。取磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O），磷酸二氫鈉（NaH2PO4· 2H2O）混合制備0.01 mol/L、pH=7.75的磷酸鹽緩沖溶液。

B.工作液。取磷酸鹽緩沖液（0.01 mmol/L）與0.9%氯化鈉（即生理鹽水）按照1:17的體積比混勻即可。

C.1%的瓊脂糖溶液。取瓊脂糖1 g，加工作液100 mL，放置在微波爐中，用中火加熱3 min后，即可溶解得到瓊脂糖溶液。

D.纖維蛋白原溶液。取纖維蛋白原148mg，加工作液配成0.3%的溶液，便為纖維蛋白原溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

E.凝血酶溶液。取凝血酶20 BP單位（5.24 mg），加生理鹽水20 mL，配成1 BP/mL的凝血酶溶液。

1.2.2.2 纖維蛋白——瓊脂糖平板的制備

取經(jīng)過(guò)微波爐加熱溶解后的瓊脂糖溶液16.2 mL置于燒杯中，放入45℃水浴中保溫，同時(shí)將纖維蛋白原液16.2 mL、凝血酶液1.3 mL亦在45℃水浴中加熱和保溫，待溫度平衡后，將三種液體混勻，然后迅速倒入平皿中，室溫下放置30 min凝固即成。之后儲(chǔ)存于4℃層析柜中待用，并在使用之前對(duì)平板進(jìn)行打孔處理，用于納豆激酶的酶活測(cè)定。

1.2.2.3 納豆激酶活性測(cè)定方法

用移液槍吸取經(jīng)過(guò)處理的酶液10 μL滴在平板上，加蓋，在恒溫培養(yǎng)箱37℃中培育18 h，到時(shí)間后，取出平板，用千分尺測(cè)量平板溶解圈的兩垂直直徑，以垂直兩直徑的乘積為酶的酶活。

1.2.2.4 納豆激酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)纖維蛋白——瓊脂糖平板測(cè)定方法，以尿激酶作為標(biāo)準(zhǔn)品，并以其相應(yīng)的濃度作為橫坐標(biāo)，經(jīng)游標(biāo)卡尺測(cè)量的相對(duì)直徑的乘積，所得的面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.5 納豆激酶的最適反應(yīng)溫度

用0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.4）配制一定酶活力的納豆激酶溶液。將酶液分別置于40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃的水浴中保溫30 min，用纖維蛋白-瓊脂糖平板法測(cè)定其相對(duì)酶活。并以25℃的酶活力為100%，其他溫度下的酶活與其比值為該溫度下的相對(duì)酶活。

1.2.2.6 納豆激酶的最適反應(yīng)pH

用磷酸——檸檬酸緩沖液（pH=3~8）、碳酸鈉緩沖液（pH=9~10）及NaOH溶液（pH=11）配制酶液（pH值取的間隔為0.5），并在溫度為40℃的水浴中保溫30 min，然后用纖維蛋白-瓊脂糖平板法測(cè)定其相對(duì)酶活。以其中最高酶活時(shí)的pH值相對(duì)應(yīng)的納豆激酶的酶活力為100%，其余pH下的酶活與其的比值為該pH下的相對(duì)酶活。

1.2.2.7 納豆激酶的保溫時(shí)間穩(wěn)定性

用pH為6.5的緩沖溶液配置相應(yīng)濃度的納豆激酶溶液，在40℃的水浴中保溫不同的時(shí)間（30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min)，然后用纖維蛋白-瓊脂糖平板法測(cè)定其相對(duì)酶活。以其中最高的殘余酶活為相對(duì)酶活100%，其他時(shí)間的殘余酶活與其的比值為該時(shí)間下的相對(duì)酶活。

1.2.2.8 NaCl濃度對(duì)納豆激酶酶學(xué)性質(zhì)的影響

在40℃水浴中、溶液為pH=6.5以及加熱時(shí)間為60 min條件下，在酶的水溶液中添加不同濃度的NaCl，測(cè)定納豆激酶在離子強(qiáng)度分別為0.15 mol/L、0.55 mol/L、0.95 mol/L、1.35 mol/L、1.75 mol/L時(shí)的酶活。以不含金屬的相應(yīng)納豆激酶溶液的殘余酶活為相對(duì)酶活100%，其他相應(yīng)的含有不同濃度NaCl的納豆激酶溶液的殘余酶活與其的比值為該NaCl濃度下的相對(duì)酶活。

2 結(jié)果與分析

納豆激酶的分子量：

圖1 納豆激酶的電泳圖Fig.1 The electrophore gram of natto kinase

將制備的納豆激酶樣品，經(jīng)過(guò)Sephadex G-75凝膠層析純化后，利用SDS-PAGE法測(cè)定納豆激酶的分子量，并使所得到的樣品與凝膠中的蛋白標(biāo)品進(jìn)行比較，從而得到樣品的分子量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，第一條條帶的是蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，分別顯示不同的分子量，從下往上依次為14.4 kDa、22 kDa、31 kDa、43 kDa、66.2 kDa、97.4 kDa。所得到的納豆激酶的條帶在22 kDa～31 kDa。經(jīng)測(cè)定納豆激酶的分子量為28 kDa。

納豆激酶等電點(diǎn)，納豆激酶在不同pH下的Zeta電位，并選擇zeta電位接近零時(shí)的pH，進(jìn)行相應(yīng)的細(xì)分，以能得到Zeta電位為0時(shí)的pH，該pH即為納豆激酶的等電點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 納豆激酶的Zeta電位圖Fig.2 The picture of zeta about nattokinase

由圖2可知，在pH=8.58時(shí)，納豆激酶所帶的電荷為零，故此納豆激酶的等電點(diǎn)為8.58。

納豆激酶的酶活測(cè)定，根據(jù)纖維蛋白-瓊脂糖平板測(cè)定方法，以尿激酶作為標(biāo)準(zhǔn)品，并以其相應(yīng)的濃度作為橫坐標(biāo)，經(jīng)游標(biāo)卡尺測(cè)量溶解圈的相對(duì)直徑，并以兩直徑的乘積為縱坐標(biāo)，繪制酶活的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖3所示。

圖3 納豆激酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3Standard of nattokinase's enzyme activity concentration

得到納豆激酶酶活的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為：y=1.5695 x+157.06，其中R2=0.9805。表明此方法用于測(cè)定納豆激酶的活性，在濃度為20~100 U/mL時(shí)，線性關(guān)系良好。

由纖維蛋白一瓊脂糖平板法測(cè)定樣本中的納豆激酶的酶活，經(jīng)由游標(biāo)卡尺測(cè)量后得到納豆激酶的溶解圈面積為255.19 mm2，并由圖3中的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算可得，樣品中納豆激酶的基本酶活為62 520 U/g。

以25℃時(shí)的納豆激酶的殘余活性為相對(duì)酶活100%，其他溫度下的納豆激酶的殘余酶活與之的比值為該溫度下的相對(duì)酶活。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4 溫度對(duì)納豆激酶酶學(xué)性質(zhì)的影響Fig.4 The temperature influence on nattokinase's enzyme activity

由圖4可知，隨著溫度的逐漸上升，納豆激酶的相對(duì)酶活是逐漸下降的趨勢(shì)。在低溫的環(huán)境下，納豆激酶的酶活受到的影響較小，穩(wěn)定性能夠得到較好的保存；且納豆激酶的酶活在40℃~55℃下降趨勢(shì)明顯；高溫條件下，納豆激酶的酶活會(huì)完全失活，喪失了其溶解血栓的能力。故而，在對(duì)納豆激酶的儲(chǔ)存或者使用時(shí)，都應(yīng)該控制溫度在40℃以下，從而使納豆激酶能夠有較高的酶活。

不同pH對(duì)納豆激酶酶活性質(zhì)的影響，實(shí)驗(yàn)條件為：水浴溫度40℃、加熱時(shí)間30 min、pH為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0。并以其中最高的納豆激酶殘余酶活為相對(duì)酶活100%，其他pH下的納豆激酶殘余酶活與之的比值為該pH下的相對(duì)酶活。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

圖5 pH對(duì)納豆激酶酶學(xué)性質(zhì)的影響Fig.5The pH influence on nattokinase's enzyme activity

由圖5可知，隨著pH值的增加，納豆激酶的相對(duì)酶活會(huì)逐漸升高然后再下降，最后納豆激酶的相對(duì)酶活幾乎為零，也表示納豆激酶在此pH的區(qū)間內(nèi)，完全失去活性。納豆激酶的最適pH為6.5，并且其可以在pH=4.5~8.0時(shí)維持較高的酶活。

溫度對(duì)酶活的影響具有不可逆性，在高溫下失活變性后，酶的結(jié)構(gòu)被破壞。酶在pH=6.5、水浴溫度40℃下進(jìn)行保溫處理，保溫的時(shí)間對(duì)酶活穩(wěn)定性的影響如圖6。

圖6 保溫時(shí)間對(duì)納豆激酶酶活性質(zhì)的影響Fig.6 The heat-time influence on nattokinase's enzyme activity

在保溫時(shí)間較短時(shí)，對(duì)酶活起到了激發(fā)的作用，促使酶活逐漸上升；當(dāng)保溫時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，酶活隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低。故在以后對(duì)酶進(jìn)行應(yīng)用研究時(shí)，盡量控制酶反應(yīng)的時(shí)間在60 min以內(nèi)，以保證在反應(yīng)期間酶活能夠保持較高的活性。

不同NaCl濃度對(duì)納豆激酶酶活穩(wěn)定性的影響，實(shí)驗(yàn)條件是：加熱溫度40℃、加熱時(shí)間為60 min，以不含金屬的相應(yīng)納豆激酶溶液的殘余酶活為相對(duì)酶活100%，其他相應(yīng)的含有不同濃度NaCl的納豆激酶溶液的殘余酶活與其的比值為該NaCl濃度下的相對(duì)酶活，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。

圖7 NaCl濃度對(duì)納豆激酶酶學(xué)性質(zhì)的影響Fig.7The concentration of Na+influence on nattokinase's enzyme activity

由圖7可知，隨著NaCl溶液濃度的逐漸加大，納豆激酶的相對(duì)酶活呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。低濃度的NaCl對(duì)納豆激酶的活性有相應(yīng)的促進(jìn)作用；但當(dāng)濃度較高時(shí)，又會(huì)對(duì)納豆激酶的相對(duì)酶活有一定的抑制作用。當(dāng)NaCl的濃度低于1.35 mol/L時(shí)，納豆激酶的相對(duì)酶活都有相應(yīng)程度的升高，尤其是當(dāng)NaCl的濃度為0.95 mol/L時(shí)，納豆激酶的相對(duì)酶活為最高，其相對(duì)酶活為127.87%，激活作用相對(duì)明顯；但當(dāng)NaCl的濃度高于1.35 mol/L時(shí)，納豆激酶的相對(duì)酶活受到一定程度的抑制，從而導(dǎo)致其相對(duì)酶活降低。

3 結(jié)論

通過(guò)本次試驗(yàn)研究，測(cè)得經(jīng)菌號(hào)HW236-5的納豆芽孢桿菌發(fā)酵大豆提取的納豆激酶的酶學(xué)特性，納豆激酶的分子量為28 kDa，等電點(diǎn)為8.58，酶活為62 520 U/g；納豆激酶的酶活穩(wěn)定性隨著溫度的升高而逐漸降低；并且當(dāng)溫度足夠高時(shí)，納豆激酶會(huì)徹底失活，納豆激酶應(yīng)該在40℃以下進(jìn)行儲(chǔ)存以及應(yīng)用；納豆激酶在中性pH時(shí)，能保持較高的活性；但當(dāng)pH值偏向酸或者堿的情況下，納豆激酶的相對(duì)活性會(huì)相應(yīng)降低。當(dāng)pH=6.5~8.0時(shí)，納豆激酶的相對(duì)酶活相對(duì)較高；但當(dāng)pH＜6.5或者pH＞8.0時(shí)，納豆激酶的酶活急劇下降；納豆激酶的酶活穩(wěn)定性隨著保溫時(shí)間的延長(zhǎng)，會(huì)受到一定的損失；NaCl在低濃度時(shí)對(duì)納豆激酶的酶活起到相應(yīng)的促進(jìn)作用；但在高濃度時(shí)，其對(duì)納豆激酶的酶活起到一定的抑制作用。人體中的NaCl濃度為0.155 mol/L，處于對(duì)納豆激酶的酶活起促進(jìn)作用的濃度范圍內(nèi)。因此，在使用或者食用納豆激酶時(shí)，應(yīng)該注意對(duì)NaCl濃度的控制，因?yàn)楫?dāng)NaCl濃度超過(guò)1.35 mol/L時(shí)，對(duì)納豆激酶的酶活是起到相應(yīng)的抑制作用的，故應(yīng)合理控制NaCl濃度的大小，從而使酶能最大化的發(fā)揮其作用。

［1］張玉巖.多功能保健食品納豆的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［J］.湖南農(nóng)機(jī)（學(xué)術(shù)版），2013，40（2）：237.

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［3］黑龍江省科學(xué)院應(yīng)用微生物研究所.發(fā)酵大豆-納豆及其成分的保健功能［M］.哈爾濱：黑龍江人民出版社，2005.

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［5］關(guān)海琳.藥食兩用納豆激酶的研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)世界，2014，（02）：82.

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［7］Kwon E Y，Kim K M，Kim M K，et al.Production of nattokinase by high cell density fed-batch culture of Bacillus subtilis［J］.Bioprocess and Biosystems Engineering，2011，34（7）：789-793.

Research of enzymology characteristics of natto kinase

SUN Jian-Hua,QIU Xiao-jun,WANG Jin-Ying，YU Chong，XIA Hai-Hua,YUAN Tao，PAN Yu，JIANG Hong-Yu,YU Li-Ping
（1.Iistitute of Microbiology,Heilongjiang Academy of ciences,Harbin 150010,China;
2.Iistitute of Advanced Technology，Heilongjiang Academy of Sciences,Haerbin 150020,China)

The main study of this experiment focuses on enzymology characteristics of natto kinase,by use of Bacillus natto HW236-5 isolated and named by Institute of Microbiology.Bacillus natto HW236-5 was obtained from extraction and separation of fermented soybean.By methods of SDS-PAGE and Zeta Potentiometry,it respectively measured that the molecular weight of natto kinase is 28 kDa,isoelectric point is 8.58, enzyme activity of natto kinase is 62520 U/g.When natto kinase is in different temperature,it finds out that the higher is the temperature,the lower is its enzyme activity.When NaCl concentration is lower than 1.35 mol/L,it plays promoting effects on enzyme activity of natto kinase.On the contrary,it is higher than 1.35 mol/L,the enzyme activity of natto kinas is inhibited.

Bacillus natto HW236-5；Natto；Nattokinase

Q55

A

1674-8646（2016）01-0004-04

2015-10-20

兼具整腸、調(diào)脂及調(diào)節(jié)免疫力的納豆軟膠囊保健食品的研制（KY14BSJH07）

孫建華（1961-），女，黑龍江哈爾濱人，學(xué)士，研究員，主要從事醫(yī)學(xué)微生物、免疫制劑及保健食品研究。

于麗萍（1962-），女，黑龍江大慶人，學(xué)士，高級(jí)工程師，主要從事微生物研究及科研管理工作。