基于凝膠型陰離子交換樹(shù)脂的齊墩果酸純化工藝

楊裕啟，劉遠(yuǎn)河，王 燦，張南海，黃齊紅，黎云磊，吳一微

(1.湖北師范大學(xué)，湖北 黃石 435002；2.湖北理工學(xué)院，湖北 黃石 435001)

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基于凝膠型陰離子交換樹(shù)脂的齊墩果酸純化工藝

楊裕啟1，2，劉遠(yuǎn)河2，王 燦2，張南海2，黃齊紅2，黎云磊2，吳一微1

(1.湖北師范大學(xué)，湖北 黃石 435002；2.湖北理工學(xué)院，湖北 黃石 435001)

采用凝膠型陰離子交換樹(shù)脂純化從女貞子果皮中提取的齊墩果酸粗品，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)、正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了純化工藝條件。確定最優(yōu)純化工藝條件為：樹(shù)脂粒度100目、吸附和洗脫溫度30 ℃、洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，在此工藝條件下，所得齊墩果酸含量大于98%、回收率大于96%。

齊墩果酸；凝膠型陰離子交換樹(shù)脂；純化

齊墩果酸(oleanolicacid，OLA)，又名慶四素，是一種生物活性物質(zhì)，為一種五環(huán)三萜類(lèi)化合物[1]。由于具有調(diào)節(jié)免疫功能、消炎、保肝護(hù)腎、抑制血小板凝集、降低血脂、血糖和抗病毒等多種生物活性，齊墩果酸及其衍生物的開(kāi)發(fā)利用受到研究人員的關(guān)注，臨床上齊墩果酸被用于治療急性黃膽型和慢性中毒型肝炎，具有較好的療效[1-4]。

自然條件下，齊墩果酸廣泛存在于植物體內(nèi)，其中以女貞子果皮的含量較高。迄今，人們發(fā)明了一些較為成熟的齊墩果酸提取純化工藝，如乙醇浸提法[5]、大孔樹(shù)脂吸附法[6]和大孔陰離子交換樹(shù)脂提取法[7]。用乙醇浸提法從女貞子果皮中提取的齊墩果酸粗品，含有較多的脂溶性雜質(zhì)，需要經(jīng)過(guò)重結(jié)晶、酸堿處理等步驟進(jìn)一步純化，較為繁瑣。用大孔樹(shù)脂吸附法和在此基礎(chǔ)上發(fā)展的大孔陰離子交換樹(shù)脂法提取純化齊墩果酸的新方法，一步制備的齊墩果酸含量達(dá)98%，但大孔陰離子交換樹(shù)脂價(jià)格昂貴，且吸附性能不穩(wěn)定，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。因此，開(kāi)發(fā)一種效果穩(wěn)定、快速簡(jiǎn)便、成本較低的天然齊墩果酸純化工藝十分必要。凝膠型陰離子交換樹(shù)脂沒(méi)有空隙結(jié)構(gòu)，機(jī)械強(qiáng)度大，使用壽命長(zhǎng)，價(jià)格便宜，適合在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用。作者采用凝膠型陰離子交換樹(shù)脂取代大孔陰離子交換樹(shù)脂，對(duì)從女貞子果皮中提取的齊墩果酸粗品進(jìn)行純化，克服了現(xiàn)有方法的不足，收到了較好的效果。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

女貞子(Ligustrum lucidumAit)新鮮成熟果實(shí)采集于湖北理工學(xué)院校園內(nèi)。

201x7型強(qiáng)堿性苯乙烯系凝膠型陰離子交換樹(shù)脂，武漢金漢都化玻科教儀器有限公司；齊墩果酸對(duì)照品，98%，上海源葉生物科技有限公司；95%乙醇、石油醚、氫氧化鈉、鹽酸、酚酞試劑均為分析純。

RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；JA31002型精密電子天平、D2F-6050型真空干燥箱，上海申光儀器儀表有限公司；TENSOR27型傅立葉變換紅外光譜儀，德國(guó)布魯克科技有限公司；40～120目分樣篩，東西湖科宇化驗(yàn)設(shè)備行。

1.2 齊墩果酸粗品的制備

參照文獻(xiàn)[8]方法，將新鮮女貞子搗碎至皮仁分離后，用流水漂洗，收集果皮于80 ℃干燥后，按料液比1∶4(g∶mL)加入95%乙醇回流提取3次，每次1.0 h；合并提取液，按體積比1∶1加入石油醚萃取除去脂溶性雜質(zhì)，乙醇層減壓回收乙醇至漿狀，加入純化水洗滌，過(guò)濾，濾餅80 ℃干燥，即得齊墩果酸粗品。

1.3 齊墩果酸粗品的純化

1.3.1 樹(shù)脂的預(yù)處理

市售的凝膠型陰離子交換樹(shù)脂比表面積小，交換容量不足。為此，本實(shí)驗(yàn)先將凝膠型陰離子交換樹(shù)脂粉碎，使其顆粒變小，以提高其比表面積和離子交換容量。將粉碎的陰離子交換樹(shù)脂過(guò)篩分級(jí)，取25 mL裝柱，依次用10%氫氧化鈉溶液、10%鹽酸溶液、10%氫氧化鈉溶液浸泡1.0 h，用純化水沖洗至中性備用。

1.3.2 齊墩果酸的純化

取2.0000 g齊墩果酸粗品溶解于30 mL 95%乙醇，上柱吸附1.0 h，先用一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇洗滌至洗脫液無(wú)色，再用2.0%氫氧化鈉乙醇溶液洗脫(約30滴·min-1)，收集至洗脫液由亮黃色變成無(wú)色。洗脫液加10%鹽酸溶液調(diào)pH值至弱酸性(pH值6.5)，真空減壓濃縮成漿狀，純水洗滌后，減壓抽濾，濾餅于80 ℃干燥至恒重，即得齊墩果酸精品。

1.4 純化條件的優(yōu)化

1.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)

1)樹(shù)脂粒度的影響

取40目、60目、80目、100目、120目的陰離子交換樹(shù)脂顆粒，按1.3方法進(jìn)行齊墩果酸粗品的純化實(shí)驗(yàn)，過(guò)程中保持吸附和洗脫溫度為10 ℃，洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%，考察不同樹(shù)脂粒度對(duì)齊墩果酸回收率和含量的影響。

2)吸附和洗脫溫度的影響

用40目陰離子交換樹(shù)脂按1.3方法進(jìn)行純化實(shí)驗(yàn)，洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%，考察吸附和洗脫溫度分別為5 ℃、10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃條件下，齊墩果酸回收率和含量的變化。

3)洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響

用40目陰離子交換樹(shù)脂按1.3方法進(jìn)行純化實(shí)驗(yàn)，吸附和洗脫溫度為10 ℃，考察洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為60%、70%、80%、90%、95%條件下，齊墩果酸回收率和含量的變化。

1.4.2 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以樹(shù)脂粒度、吸附和洗脫溫度、洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)為影響因素設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)(表1)，進(jìn)一步優(yōu)化純化工藝條件。

表1 正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平

1.5 分析檢測(cè)

用化學(xué)法和紅外光譜法對(duì)齊墩果酸精品進(jìn)行定性檢測(cè)?；瘜W(xué)法：取樣品約50 mg，加2 mL氯仿溶解，滴加硫酸2滴，振蕩，靜置觀察。紅外光譜法：取少量樣品，與溴化鉀混合后壓片制樣，進(jìn)行紅外光譜測(cè)定。

參照衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)二部第三冊(cè)方法測(cè)定齊墩果酸含量。具體操作為：準(zhǔn)確稱(chēng)取樣品0.15 g，加30 mL乙醇振搖，微溫加熱溶解，冷卻至室溫，滴加酚酞3滴，用氫氧化鉀乙醇溶液滴定，并做空白實(shí)驗(yàn)校正。

2 結(jié)果與討論

2.1 齊墩果酸粗品的回收率和含量(表2)

表2 女貞子果皮中提取齊墩果酸粗品的回收率和含量

本實(shí)驗(yàn)提取的齊墩果酸粗品為淺黃綠色粉末。每千克女貞子鮮果可制成干果皮64.50 g。從表2可知，回收率以女貞子果皮計(jì)平均為17.52%，以女貞子鮮果計(jì)為1.13%，酸堿滴定法測(cè)定含量平均為70.20%，3次平行實(shí)驗(yàn)的回收率和含量無(wú)顯著差異。

2.2 齊墩果酸精品的定性檢測(cè)

化學(xué)鑒別反應(yīng)觀察到氯仿自無(wú)色逐漸變成淡紅色，與齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品的反應(yīng)現(xiàn)象相同。將樣品紅外光譜(圖1)顯示的羥基(3 424 cm-1)、飽和的CH(2 922 cm-1、2 850 cm-1)、羰基(1 686 cm-1)、甲基(1 468 cm-1、1 388 cm-1)、C-O伸縮振動(dòng)(1 030 cm-1)等特征吸收峰及指紋區(qū)精細(xì)圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果一致，因此，判斷樣品為齊墩果酸。

圖1 齊墩果酸精品的紅外光譜圖(KBr壓片法)

2.3 樹(shù)脂粒度對(duì)齊墩果酸回收率和含量的影響(表3)

表3 樹(shù)脂粒度對(duì)齊墩果酸回收率和含量的影響

從表3可知，隨著樹(shù)脂粒度的減小，齊墩果酸精品回收率升高，當(dāng)樹(shù)脂粒度為100目時(shí)，齊墩果酸回收率達(dá)到90%以上；當(dāng)樹(shù)脂粒度為120目時(shí)，樣品溶液和洗脫液難以通過(guò)樹(shù)脂層，實(shí)驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行。原因可能是樹(shù)脂粒度減小，交換面積和交換容量增大，使齊墩果酸精品回收率升高；當(dāng)樹(shù)脂粒度進(jìn)一步減小時(shí)，樹(shù)脂之間的空隙嚴(yán)重變小，使液體流動(dòng)速度減慢甚至停止。樹(shù)脂粒度對(duì)齊墩果酸精品含量的影響不明顯，說(shuō)明離子交換法有效而且產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定可控。

2.4 吸附和洗脫溫度對(duì)齊墩果酸回收率和含量的影響(表4)

表4 吸附和洗脫溫度對(duì)齊墩果酸回收率和含量的影響

從表4可知，隨著吸附和洗脫溫度的升高，齊墩果酸的回收率先降低后升高；而齊墩果酸含量先升高后降低。原因可能是齊墩果酸和雜質(zhì)的吸附-解吸行為在不同溫度下有不同表現(xiàn)?？紤]到吸附和洗脫一般在室溫下進(jìn)行，故沒(méi)有考察低于5 ℃和高于40 ℃的條件。

2.5 洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)齊墩果酸回收率和含量的影響(表5)

表5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)齊墩果酸回收率和含量的影響

從表5可知，隨著洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，齊墩果酸回收率逐漸升高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%以上時(shí)，齊墩果酸的回收率趨于穩(wěn)定；同時(shí)隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，齊墩果酸含量逐漸升高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%以上時(shí)，含量已達(dá)98%以上。原因可能是在體積分?jǐn)?shù)較高的乙醇中，齊墩果酸易于溶解并洗脫。綜合考慮，宜選用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液。

2.6 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析(表6)

從表6可知，7#實(shí)驗(yàn)得到的齊墩果酸回收率最高，為96.33%，含量98.78%；9#實(shí)驗(yàn)得到的齊墩果酸回收率較高，為96.31%，含量98.64%；5#實(shí)驗(yàn)得到的齊墩果酸含量最高，為99.86%，回收率65.21%。

表6 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

5#實(shí)驗(yàn)雖然齊墩果酸含量最高，但回收率卻相對(duì)較低，洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)較大，成本高；7#、9#實(shí)驗(yàn)回收率和產(chǎn)品含量都較高，但7#實(shí)驗(yàn)吸附和洗脫溫度低、乙醇體積分?jǐn)?shù)大，成本高。

綜合考慮，優(yōu)化的純化工藝條件采用9#實(shí)驗(yàn)的參數(shù)，即樹(shù)脂粒度100目、吸附和洗脫溫度30 ℃、洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)80%。

2.7 優(yōu)化條件下純化效果的穩(wěn)定性(圖2)

圖2 優(yōu)化工藝條件下連續(xù)10次純化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖2可知，同一批陰離子交換樹(shù)脂連續(xù)進(jìn)行10次純化實(shí)驗(yàn)，齊墩果酸回收率和含量無(wú)顯著變化，說(shuō)明樹(shù)脂的吸附性能穩(wěn)定。樹(shù)脂顏色由最初的微黃色變?yōu)樽厣?，可能是雜質(zhì)滲入樹(shù)脂內(nèi)部所致，但對(duì)實(shí)驗(yàn)效果無(wú)顯著影響。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，探討了凝膠型強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂對(duì)從女貞子果皮中提取的齊墩果酸粗品的純化效果。分別比較了樹(shù)脂粒度、吸附和洗脫溫度、洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)齊墩果酸回收率和含量的影響。確定最優(yōu)工藝條件為：樹(shù)脂粒度100目、吸附和洗脫溫度30 ℃、洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)80%。在此條件下，凝膠型強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂純化齊墩果酸的精品純度達(dá)98%以上，且質(zhì)量穩(wěn)定；齊墩果酸回收率可達(dá)96%以上。

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Purification Technology of Oleanolic Acid Based on a Gel-Type Anion Exchange Resin

YANG Yu-qi1，2，LIU Yuan-he2，WANG Can2，ZHANG Nan-hai2，HUANG Qi-hong2，LI Yun-lei2，WU Yi-wei1

(1.HubeiNormalUniversity，Huangshi435002，China；2.HubeiPolytechnicUniversity，Huangshi435001,China)

ThecrudeoleanolicacidfromthepeelofLigustrum lucidumAitwaspurifiedusingagel-typeanionexchangeresins,andthepurifiedconditionswereoptimizedbyasinglefactorexperimentandorthogonalexperiment.Theoptimalconditionswereasfollowing:theparticlesizeofresinof100meshes,theadsorptionandelutiontemperatureof30 ℃,andtheethanolvolumefractionof80%.Thecontentandyieldofoleanolicacidwereover98%and96%,respectively.

oleanolicacid；gel-typeanionexchangeresin；purification

湖北省高等學(xué)校優(yōu)秀中青年創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(201317)

2016-09-29

楊裕啟(1975-)，男，湖北黃石人，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：天然藥物提取和分析；通訊作者：吳一微，教授，E-mail：chemwuyiwei@163.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.11.007

楊裕啟，劉遠(yuǎn)河，王燦，等.基于凝膠型陰離子交換樹(shù)脂的齊墩果酸純化工藝[J].化學(xué)與生物工程，2016，33(11)：36-39.

R 284

A

1672-5425(2016)11-0036-04