霍山石斛擬原球莖生長及植株再生過程中微觀結(jié)構(gòu)與元素的變化

楊 靜 何 芳 王 紀(jì) 方炎明 戴 斌

(1. 南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)創(chuàng)新中心，生物與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037；2. 南京林業(yè)大學(xué)現(xiàn)代分析測試中心，江蘇 南京 210037；3. 焦作大學(xué)化工與環(huán)境工程學(xué)院，河南 焦作 454000；4. 南京曉莊學(xué)院，江蘇 南京 210017；5. 皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院， 安徽 六安 237012)

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霍山石斛擬原球莖生長及植株再生過程中微觀結(jié)構(gòu)與元素的變化

楊 靜1,2何 芳3王 紀(jì)4方炎明1戴 斌5

(1. 南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)創(chuàng)新中心，生物與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037；2. 南京林業(yè)大學(xué)現(xiàn)代分析測試中心，江蘇 南京 210037；3. 焦作大學(xué)化工與環(huán)境工程學(xué)院，河南 焦作 454000；4. 南京曉莊學(xué)院，江蘇 南京 210017；5. 皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院， 安徽 六安 237012)

采用SEM/EDS技術(shù)，研究霍山石斛擬原球莖生長及植株再生過程中結(jié)構(gòu)和元素的變化，分析其發(fā)育過程及藥效成分。結(jié)果表明：適當(dāng)?shù)慕M培條件會使外植體表層具有分生能力的細(xì)胞不斷分裂和增殖形成擬原球莖和次擬原球莖。其中擬原球莖分化出芽和根，完成幼苗的形態(tài)發(fā)育。30 d后幼苗的根無明顯的根毛和根被組織；莖表皮多縱向皺褶，橫切面邊緣具波狀棱角，細(xì)胞內(nèi)含物黏液狀，外韌有限維管束散生；等面葉，四列型氣孔只分布于下表皮，保衛(wèi)細(xì)胞腎形。擬原球莖形成期，含有較多的Na、S、K、Al、Si、Fe，分化期P、Cl、Mn、Ca增多，幼苗所含K、Ca增幅較大，其他元素減少或變化不明顯。

霍山石斛；擬原球莖；植株再生；微觀結(jié)構(gòu)；元素

霍山石斛 (Dendrobiumhuoshanense) 是蘭科石斛屬多年生附生草本植物，具有極高的藥用及觀賞價值[1-2]，但因其對生長環(huán)境要求苛刻，加之繁殖困難、人為過度采挖，資源已瀕臨滅絕[2-5]。因此，研究霍山石斛資源的可持續(xù)開發(fā)和利用迫在眉睫。

國內(nèi)外關(guān)于霍山石斛的報道主要集中在快繁、移栽馴化以及藥理藥效等方面[6-18]。擬原球莖再生植株途徑是霍山石斛重要的快繁方式，具有遺傳性狀穩(wěn)定、高效的優(yōu)點。擬原球莖 (PLBs) 由Morel于1960年在蘭屬植物的莖尖培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，其類似于原球莖的生長與結(jié)構(gòu)特征。蝴蝶蘭的擬原球莖發(fā)育研究，證實了擬原球莖形成過程即為體胚發(fā)生過程[19]。詹忠根等[20]綜述了蘭科植物擬原球莖的形態(tài)建成，張啟香等[21]、金青等[22]也分別報道過鐵皮石斛和霍山石斛擬原球莖誘導(dǎo)及發(fā)育并進行了光學(xué)顯微觀察，均未涉及元素成分的變化。本試驗擬采用掃描電鏡 (SEM) 進一步觀察霍山石斛擬原球莖生長及植株再生的動態(tài)過程，并結(jié)合X射線能譜儀 (EDS) 技術(shù)，對機體所含元素成分進行分析，一方面為霍山石斛的快速繁殖和工廠化生產(chǎn)提供形態(tài)學(xué)依據(jù)，另一方面也了解其所含元素成分與形態(tài)建成過程以及藥用價值的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料來源與培養(yǎng)條件

霍山石斛試管苗取自皖西學(xué)院生物與制藥工程系石斛組培室，在南京林業(yè)大學(xué)植物組培室進行培養(yǎng)。以 MS和1/2MS為基本培養(yǎng)基，120 ℃高壓滅菌20 min，冷卻凝固后備用。培養(yǎng)條件為：溫度 (25 ± 1) ℃，光照強度1 600～2 500 lx，光照16 h/d。

經(jīng)過反復(fù)試驗，最終采用1/2MS + 0.5 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA+20%土豆汁誘導(dǎo)擬原球莖，分化培養(yǎng)采用1/2MS + 2.0 mg/L 6-BA + 1.5 mg/L NAA + 0.03 mg/L TDZ + 20%土豆汁，誘導(dǎo)生根選用1/2MS + 0.5 mg/L IBA，pH均為5.6。分3個不同發(fā)育時期采集樣品：擬原球莖形成 (形成期)，擬原球莖有莖、葉分化 (分化期)，完整植株形成 (幼苗)。

1.2 試驗方法

1.2.1 擬原球莖生長及植株再生過程中的微觀形貌觀察

獲取形成期及分化期的擬原球莖，分別切取5塊適當(dāng)大小 (長 × 寬 × 高 ≤ 10 mm × 10 mm × 10 mm) 的樣本，幼苗根、莖、葉樣本來自5株生長較為一致的植株，分別取10 mm長的主根中部，5 mm長的莖中部，最末端一片葉的中心部位切取5 mm × 5 mm大小。樣本裝在鋁盒里迅速投入液氮速凍固定[23]，約1.5 min后取出樣本立即進行真空冷凍干燥48 h，干燥后的材料，表面經(jīng)日本HITACHI E1010離子濺射儀噴鍍黃金30 s，電流10 mA，使用美國FEI Quanta 200型掃描電鏡觀察微觀形貌 (加速電壓15～20 kV)。

1.2.2 擬原球莖生長及植株再生過程中的微區(qū)元素分析

擬原球莖形成期及有莖、葉分化期：用于掃描電鏡觀察的組織塊，可同時使用英國OXFORD INCA X-Act 能譜儀進行微區(qū)元素分析，加速電壓20 kV，分別選取5個不同部位，最終結(jié)果取平均值 (元素含量用質(zhì)量百分比表示)[23]。

完整植株 (幼苗)：自然晾干后研磨成粉末狀，經(jīng)日本HITACHI E1010離子濺射儀噴鍍黃金30 s，電流10 mA，使用能譜儀進行微區(qū)元素分析，加速電壓20 kV，分別選取5個不同部位，最終結(jié)果取平均值 (元素含量用質(zhì)量百分比表示)[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬原球莖生長及植株再生過程中的微觀特征

霍山石斛擬原球莖誘導(dǎo)和再生植株不同發(fā)育時期的掃描電鏡觀察結(jié)果見圖1。

無菌側(cè)芽在經(jīng)過篩選的培養(yǎng)基 (1/2MS + 0.5 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA+20%土豆汁) 上進行誘導(dǎo)，部分表層及表層下具有分生能力的細(xì)胞經(jīng)多次分裂形成愈傷組織，愈傷組織最外層的薄壁細(xì)胞再分裂形成胚性細(xì)胞團，表面看上去結(jié)構(gòu)致密，具球形顆粒 (圖1-1)。隨后，胚性細(xì)胞團的基部細(xì)胞開始分化伸長、增大，逐步失去分生能力，而頂端的細(xì)胞仍有活躍的分裂能力，持續(xù)不斷地分裂和生長，使組織形成一些不規(guī)則的突起，這些突起逐漸長成卵圓形，形成擬原球莖 (圖1-2)，在繼代過程中，擬原球莖表面或內(nèi)部薄壁組織中的一些胚性細(xì)胞分裂形成胚性細(xì)胞團后又可繼續(xù)發(fā)育形成次生擬原球莖 (圖1-3)。

1. 胚性愈傷組織；2. 胚性愈傷產(chǎn)生擬原球莖；3. 擬原球莖上產(chǎn)生次生擬原球莖；4. 葉原基的分化；5. 擬原球莖上分化的管狀結(jié)構(gòu)；6. 芽；7. 幼苗的根表面；8. 幼苗的根剖面；9. 幼苗的莖表面；10. 幼苗的莖剖面；11. 幼苗的葉表面；12. 幼苗的葉剖面。

圖1 霍山石斛擬原球莖生長及植株再生

Fig.1 The development ofD.huoshanensePLBs and plantlet regeneration

隨后的生長發(fā)育事件是極性的形成。擬原球莖逐漸呈現(xiàn)結(jié)構(gòu)上的兩極性，在靠近頂端處，其結(jié)構(gòu)類似于莖，并在頂端形成葉原基后長出莖尖 (圖1-4)。擬原球莖部分區(qū)域的表皮細(xì)胞形成不規(guī)則束狀分布的管狀突起 (圖1-5)，其中一部分突起可以直接發(fā)育成芽 (圖1-6)。經(jīng)誘導(dǎo)生根形成完整植株，幼根直徑在400～500 μm，沒有發(fā)現(xiàn)根毛 (圖1-7)，橫剖面未見明顯的根被組織，皮層、中柱結(jié)構(gòu)清晰，皮層組織的薄壁細(xì)胞內(nèi)含有豐富的顆粒物質(zhì)，初生木質(zhì)部和初生韌皮部排列緊密 (圖1-8)。莖肉質(zhì)，圓柱狀，分節(jié)，每節(jié)中間稍粗，直徑為800～1 500 μm，表面有較多縱向凹陷 (圖1-9)，橫剖面顯示3部分構(gòu)成：表皮，基本組織和維管束，周緣波浪狀，細(xì)胞排列疏松，基本組織細(xì)胞腔清晰可見，細(xì)胞內(nèi)含物黏液狀，外韌有限維管束散生在基本組織中，呈不規(guī)則分布 (圖1-10)。而葉沒有觀察到表皮毛結(jié)構(gòu)，不具角質(zhì)層，氣孔只分布于下表皮，微突，多數(shù)張開，氣孔平均密度約68.18個/mm2，氣孔橢圓形，屬四列型，保衛(wèi)細(xì)胞腎形 (圖1-11)，橫剖面顯示葉肉細(xì)胞呈近圓形或橢圓形，沒有海綿組織和柵欄組織的分化，為等面葉，主脈處凹陷，葉的平均厚度193.49 μm，大小不等的葉脈維管束，相間排列于葉肉中，上表皮細(xì)胞柱形，下表皮細(xì)胞扁長，大小約為上表皮細(xì)胞的1/2，葉肉細(xì)胞腔內(nèi)含有較多貯藏物質(zhì) (圖1-12)。

霍山石斛組織培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)擬原球莖在不同發(fā)育階段，微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生一系列特征性變化，不同時期具有不同的功能，體現(xiàn)出結(jié)構(gòu)與功能的相互呼應(yīng)，也為胚性細(xì)胞到完整植株的發(fā)育機制提供一定的理論依據(jù)。

2.2 擬原球莖生長及植株再生過程中的元素分析

應(yīng)用能譜儀結(jié)合掃描電鏡利用特征X射線對霍山石斛擬原球莖形成期、分化期及幼苗期 (完整植株) 3個時期體內(nèi)一些元素進行原位的定性定量分析，具體數(shù)值見表1。

表1 元素含量比較

總體來說，由表1可知在擬原球莖發(fā)生初期、芽及完整植株的元素成分種類豐富，并且差異顯著，均含有較多的Na、P元素，Na含量分別可達到12.00%、5.15%、6.19%，P元素次之，3個時期依次為7.60%、10.38%、3.14%，說明Na和P應(yīng)該與擬原球莖的發(fā)生發(fā)育關(guān)系密切；而Mg元素在3個時期的含量均最少，隨著生長發(fā)育依次僅為0.03%、0.03%、0.04%，并且差異不顯著。

同一種元素在不同時期的含量變化也各不相同。Na、S、K 3種元素在發(fā)育初期含量較高，芽的分化期含量分別減少57.08%、17.95%、38.46%，生根幼苗的Na、S含量略有回升，但K含量增長幅度較大，為初期含量的1.65倍；而P、Cl、Mn 3種元素則在分化期含量增多，增幅分別為36.58%、137.5%、57.14%，Cl元素尤為顯著，幼苗期P、Cl下降，Mn則繼續(xù)增長了45.45%；Al、Si、Fe 3種元素的含量隨著生長發(fā)育而呈現(xiàn)遞減的態(tài)勢；Ca元素在芽期比擬原球莖發(fā)育初期增長了50%，而幼苗期高達0.99%，比芽期又增長了43.48%。

總之，在擬原球莖發(fā)生初期，組織含有較多的Na、S、K、Al、Si、Fe，芽分化期P、Cl、Mn、Ca增多，Na、S、K、Al、Si、Fe減少，而形成完整植株后， K、Ca、Mn大量增多，分別比初期增長了65.38%、115.22%、128.57%，其他元素減少或者變化不明顯。

3 結(jié)論與討論

3.1 擬原球莖生長及植株再生過程中微觀結(jié)構(gòu)的生理性變化

現(xiàn)已報道多種石斛，如鼓槌石斛 (Dendrobiumchrysotoxum)[24]、鐵皮石斛 (Dendrobiumcandidum)[25]和霍山石斛[26]等，其快速繁殖都經(jīng)歷3個階段：愈傷組織再生、胚胎發(fā)生和器官發(fā)生，即從愈傷組織經(jīng)擬原球莖到植株形成的過程。石斛組織培養(yǎng)的外植體通常選擇種子、假鱗莖段、莖節(jié)、莖尖、苗端等，在適當(dāng)條件下，一方面可以獲得大批叢生苗；一方面利用擬原球莖的分化與增殖進行大量培養(yǎng)[14]。蘭科植物組織培養(yǎng)中通過誘導(dǎo)適宜的外植體產(chǎn)生的擬原球莖類似于原球莖結(jié)構(gòu)，也即體細(xì)胞胚胎，具有和植株同樣的物質(zhì)代謝和形態(tài)發(fā)育潛能，且生長速度快[27]。

許多報道一致認(rèn)為PLBs是由外植體薄壁細(xì)胞經(jīng)脫分化而形成的分生組織細(xì)胞發(fā)育成的胚性細(xì)胞進一步形成，其繼續(xù)增殖分化長成幼苗[20-22]。本課題在研究過程中也發(fā)現(xiàn)外植體部分表層及表層下具有分生能力的細(xì)胞經(jīng)多次分裂形成愈傷組織，而愈傷組織胚性細(xì)胞團頂端的細(xì)胞不斷分裂和生長使整個組織形成不規(guī)則的突起，這些突起逐漸長成圓形或卵圓形的結(jié)構(gòu)，即為PLBs。SEM的觀察同時也驗證了PLBs強大的增殖能力，PLBs在繼代過程中會不斷分裂增殖產(chǎn)生新的PLBs，與Hossain等[27]報道的原球莖一樣，可以不斷增殖產(chǎn)生次生原球莖 (secondary protocorms)。PLBs隨著發(fā)育會逐漸顯示出它結(jié)構(gòu)上的兩極性，莖尖先突起，形成具有莖葉系統(tǒng)的幼芽后，頂端分生組織下方的原形成層分化成維管柱，表皮薄壁細(xì)胞分化出不定根，完成幼苗的形態(tài)建成[26]。PLBs到幼苗的形成過程中，通過電鏡觀察還發(fā)現(xiàn)PLBs部分區(qū)域的表皮細(xì)胞會形成不規(guī)則束狀分布的管狀突起, 其中一部分突起直接發(fā)育成芽，這點與詹忠根等[20]描述的中國蘭極為相似。

誘導(dǎo)生根后的完整植株，經(jīng)過30 d的壯苗培養(yǎng)，通過SEM的觀察，根表皮沒有發(fā)現(xiàn)根毛，剖面顯示無髓，并且沒有根被，而楊靜等通過SEM觀察發(fā)現(xiàn)霍山石斛試管苗在移栽后才具備明顯的根被組織[28]。根被由厚壁死細(xì)胞組成，細(xì)胞壁木栓化，主要起保護、吸水、透氣和儲藏水分的功能[29]，Morris[30]的研究表明附生蘭根被細(xì)胞的層數(shù)和厚度明顯會受環(huán)境濕度變化的影響，所以本研究認(rèn)為試管苗的根由于處于形成發(fā)育的早期，并且生長在水分充足的環(huán)境中，不具備形成根被的條件。莖表皮多有縱向皺褶，橫切面為圓形，邊緣具波狀棱角，維管束為外韌有限維管束，散生，葉為等面葉，氣孔只分布于下表皮，四列型，保衛(wèi)細(xì)胞腎形，這些與黎明等[31]對霍山石斛營養(yǎng)器官解剖結(jié)構(gòu)的報道完全一致。在SEM下，從切面發(fā)現(xiàn)根細(xì)胞內(nèi)含物呈分散的顆粒狀，莖細(xì)胞腔內(nèi)物質(zhì)卻明顯呈黏液狀，而同時期生理指標(biāo)測定顯示莖內(nèi)含有大量多糖，根內(nèi)較少，因此推測內(nèi)含物的存在形態(tài)與物質(zhì)種類有關(guān)。

對于霍山石斛來說，組織培養(yǎng)獲得幼苗固然重要，但試管苗能否正常發(fā)育以及是否適合脫瓶移栽依然是資源能否得到良好保存的關(guān)鍵步驟，本試驗通過對微觀結(jié)構(gòu)的觀察，以期為試管苗的正常發(fā)育以及成功移栽提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

3.2 擬原球莖生長及植株再生過程中所含元素的變化

自然界中的非生物及生物均由化學(xué)元素構(gòu)成。生物體含有多種元素，它們有些是機體進行生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)，有些是組成細(xì)胞的重要成分。本試驗測得霍山石斛從擬原球莖時期發(fā)育到完整植株，最基本的C、O除外，每個時期均含有Na、Mg、S、P、K、Al、Si、Fe、Mn、Ca元素。Fe、Mn為人體所需的微量元素，Mn參與肌體的代謝，F(xiàn)e是構(gòu)成過氧化氫酶的重要成分，也是很多酶的活性部分[32]。Na、Mg、S、K、Al、Si、Ca屬于人體的常量元素，在體內(nèi)所占比例較大，是構(gòu)成有機體的必備元素，其中Mg、K 還有利于提高氨基酸的含量[33]，C、O、S、P等元素組成人體糖類、蛋白質(zhì)、脂肪、生長因子、輔酶以及激素等物質(zhì)，可謂重要的基本組成元素。在中草藥藥理活性物質(zhì)的研究中，人們發(fā)現(xiàn)元素在不同程度上協(xié)同發(fā)揮抗氧化、抗衰老、提高免疫力等各種功效[34]。因此推測某些元素成分很可能會與霍山石斛的神奇藥效有著密切的關(guān)系。

隨著霍山石斛擬原球莖的發(fā)育，機體所含元素的種類及含量呈現(xiàn)動態(tài)變化。在擬原球莖發(fā)生初期，組織含有較多的Na、S、Mg、K、Al、Si、Fe，而芽分化期P、Cl、Mn、Ca含量顯著增多。報道[33,35]認(rèn)為適量的金屬元素，如Ca、Fe、Mn等將利于擬原球莖的生長或擬原球莖多糖和生物堿的生成。因此其元素的變化不僅體現(xiàn)出不同發(fā)育時期的生理需要，而且可能會間接促進一些有效成分的積累，從而奠定藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。完成幼苗的形態(tài)建成之后，K含量回升并且遠高于擬原球莖發(fā)生初期，Ca、Mn持續(xù)增多。K有助于神經(jīng)系統(tǒng)傳達信息，并且與Na、Cl一起能使體液維持接近中性，決定組織中水分的多少，屬于機體生命所需的大量元素，Ca為生物必需，是含量最多的無機鹽組成元素，參與新陳代謝，其含量不足則嚴(yán)重影響生長發(fā)育[36]。Mn是人體必需的微量元素，盡管在人體內(nèi)含量極少，但對人體健康起著不可替代的重要作用[32,36-37]。許多研究者把中藥功效的物質(zhì)基礎(chǔ)分為二大類，一類是生物活性成分，另一類則是微量元素，認(rèn)為藥物達到歸經(jīng)部位是通過微量元素向病變部位的遷移、富集和親和運動來實現(xiàn)的[38]。因此，幼苗期Mn元素的大幅度增加可能關(guān)系到幼苗的藥用價值，當(dāng)然這些還有待進一步驗證。

通過比較霍山石斛擬原球莖生長及植株再生過程中所含元素的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)某些元素成分與其形態(tài)建成存在一定的聯(lián)系，也許可以作為調(diào)控形態(tài)建成的重要因素，同時了解到不同發(fā)育時期一些有益元素的積累特征，下一步將結(jié)合機體內(nèi)多糖、生物堿、氨基酸、蛋白質(zhì)等重要有效成分的變化進行綜合分析，從而為監(jiān)測霍山石斛擬原球莖植株再生過程中藥用價值的研究提供理論參考。如果能夠探索到與野生苗藥效相當(dāng)?shù)慕M培產(chǎn)物，對于瀕危藥用資源的利用將具有長遠的意義。

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(責(zé)任編輯 張 坤)

Changes in Micro-structure and Elements of Protocorm Like Bodies fromDendrobiumhuoshanenseDuring the Development and Plantlet Regeneration

Yang Jing1,2, He Fang3, Wang Ji4, Fang Yanming1, Dai Bin5

(1. Co-innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China, College of Biology and the Environment, Nanjing Forestry University,Nanjing Jiangsu 210037, China; 2. Advanced Analysis and Testing Center, Nanjing Forestry University, Nanjing Jiangsu 210037, China;3. College of Chemical and Enviromental Engineering, Jiaozuo University, Jiaozuo Henan 454000, China; 4. Nanjing Xiaozhuang University,Nanjing Jiangsu 210017, China; 5. College of Biology and Pharmaceutical Engineering, West Anhui University, Lu′an Anhui 237012, China)

In order to get better understanding of the growth and officinal components during the development of protocorm like bodies (PLBs) fromDendrobiumhuoshanenseand plantlet regeneration，changes in micro-structure and micro-area elements were analyzed by means of SEM and EDS. Cells which have the ability to divide from the surface of explants formed embryogenic callus in tissue culture when conditions were suitable. Embryogenic cells grew into PLBs and secondary PLBs after constant division. PLBs showed bipolarity gradually and produced buds and roots to form complete plants. After 30 days, root hair or velamina were not found in roots. Stems were characterized by several features such as surface longitudinal depressions, round cross sections with wavy edges, scattered external ductile finite vascular bundle and mucinous cells contents. Quadrilateral stomata only distributed in the lower epidermis of isobilateral leaves and the guard cells were like kidneys. And more Na, S, K, Al, Si and Fe were in PLBs, then the contents of P, Cl, Mn and Ca increased in differentiated PLBs, and the contents of Na, S, K increased in the complete plants while other elements were less or not changed significantly.

Dendrobiumhuoshanense, Protocorm Like Bodies (PLBs), plantlet regeneration, micro-structure, element

10. 11929/j. issn. 2095-1914. 2016. 06. 001

2016-03-02

江蘇省林業(yè)三新工程項目 (lysx[2013]07) 資助；國家自然科學(xué)基金 (31200233) 資助。

方炎明 (1962—)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：植物發(fā)育生物學(xué)與環(huán)境生物學(xué)。Email: jwu4@njfu.com.cn。

S723

A

2095-1914(2016)06-0001-07

第1作者：楊靜 (1980—)，女，博士，講師。研究方向：植物發(fā)育生物學(xué)與生物電鏡技術(shù)。Email: yjnjfu@126.com。