宮頸腺癌細(xì)胞中HPV18-E7與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系研究

米合日尼沙·買買提，阿比丹·吐爾汗江，韓莉莉

（新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院婦科，烏魯木齊830000）

論著

宮頸腺癌細(xì)胞中HPV18-E7與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系研究

米合日尼沙·買買提，阿比丹·吐爾汗江，韓莉莉

（新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院婦科，烏魯木齊830000）

目的：探究宮頸腺癌細(xì)胞中HPV18-E7與上皮間質(zhì)化(EMT)之間的關(guān)系。方法:針對(duì)HPV18-E7的siRNA轉(zhuǎn)染入人宮頸腺癌HeLa細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并運(yùn)用Real-time PCR技術(shù)、免疫印跡實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)在mRNA水平和蛋白水平檢測(cè)E7、EMT相關(guān)的標(biāo)記因子的表達(dá)及定位變化；應(yīng)用細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)及Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力。結(jié)果:特異性沉默HPV18-E7表達(dá)后HeLa-SIE7細(xì)胞間連接變得疏松，細(xì)胞中E7與間質(zhì)性標(biāo)記物的mRNA及蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組細(xì)胞顯著下降，上皮性標(biāo)記因子較對(duì)照組細(xì)胞明顯增加（P<0.01）；隨著HeLa細(xì)胞E7表達(dá)的下調(diào)，E-cadherin在細(xì)胞膜上的表達(dá)增加，間質(zhì)性標(biāo)記因子在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的表達(dá)隨之下降。HeLa-SIE7細(xì)胞遷移及侵襲能力明顯低于對(duì)照組（P<0.01）；沉默HPV18-E7表達(dá)的HeLa細(xì)胞其增殖能力也明顯減弱。結(jié)論：宮頸腺癌細(xì)胞中HPV18-E7能夠引起EMT，促進(jìn)腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移。

宮頸腺癌；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化；HPV18-E7

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一。在發(fā)展中國(guó)家，由于高危型人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染增多、篩查程序混亂，宮頸癌的發(fā)病率和病死率增加并出現(xiàn)年輕化傾向[1]。目前，雖然早期篩查和手術(shù)聯(lián)合放化療的防治模式已有效改善早期宮頸癌的預(yù)后，然而對(duì)于發(fā)生宮旁浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的宮頸癌的治療和預(yù)后的改善仍是棘手問(wèn)題[2]。因此尋找腫瘤進(jìn)展過(guò)程中的關(guān)鍵因子有助于我們建立腫瘤進(jìn)展的預(yù)測(cè)體系，開展個(gè)體化診治和靶向干預(yù)，從而為晚期宮頸癌患者爭(zhēng)取治療時(shí)機(jī)、改善預(yù)后。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial to Mesenchymal Transition，EMT）是指上皮細(xì)胞失去極性及細(xì)胞間連接,獲得浸潤(rùn)遷移的能力,成為具有間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和特性的細(xì)胞[3]。目前越來(lái)越多的研究證實(shí)EMT是腫瘤進(jìn)展及發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的重要過(guò)程[4]。近年來(lái)，在宮頸癌中也有研究證實(shí)其浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過(guò)程與EMT相關(guān)[5]。目前沒有文獻(xiàn)證實(shí)宮頸癌最主要的病因HPV感染與EMT的具體關(guān)系。直到2009年及2013年分別在人正常上皮細(xì)胞及鼻咽癌細(xì)胞中有研究指出HPV16-E6/E7能夠誘導(dǎo)EMT[6-7]，但是這些研究只是簡(jiǎn)單的證明HPV16-E6/E7可以誘導(dǎo)EMT，并沒有指出其誘導(dǎo)EMT后是否會(huì)促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。關(guān)于宮頸腺癌的最重要致癌基因HPV18-E6/E7至今仍無(wú)相關(guān)研究。為此，本研究以HPV18型陽(yáng)性的宮頸腺癌細(xì)胞HeLa為基礎(chǔ)，用針對(duì)HPV18-E7的小干擾RNA特異性的沉默E7的表達(dá)，運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR，免疫印跡實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞免疫熒光技術(shù)，細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)，Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)及檢測(cè)EMT特異性標(biāo)記因子的表達(dá)及定位變化，觀察其細(xì)胞遷移、侵襲能力，從而探索HPV18-E7與EMT的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞來(lái)源 HPV18陽(yáng)性的宮頸癌HeLa細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。

1.1.2 主要試劑 LipofectamineTM2000（Invitrogen，美國(guó)）；逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（Fermentas公司，美國(guó)）；Realtime PCR Master Mix（TOYOBO,日本）；HPV18-E7單克隆抗體（Santa Cruz Biotechnology,Inc.公司，美國(guó)）；E-cadherin單克隆抗體（EPITOMICS公司，美國(guó)）；Vimentin多克隆抗體（Proteintech公司，中國(guó)武漢）；N-cadherin單克隆抗體（EPITOMICS公司，美國(guó)）；FN1多克隆抗體（Proteintech公司，中國(guó)武漢）；GAPDH單克隆抗體（Anbo biotechnology，美國(guó)）；小干擾RNA（siRNAi）由廣州市銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成；引物由上海英駿公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

1.2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)：用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)人宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的狀態(tài)，按照細(xì)胞密度、狀態(tài)及實(shí)驗(yàn)安排進(jìn)行具體操作。一般2 d換液1次，4 d傳代1次。處理后的細(xì)胞放置于37℃、含5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.1.2 siRNA的轉(zhuǎn)染:待處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且狀態(tài)良好的HeLa細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)用上述細(xì)胞傳代的方法以每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)?？装逯屑?xì)胞匯合度達(dá)40%～50%面積時(shí)，分別用SIE7及對(duì)照SINC轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，具體操作步驟按照脂質(zhì)體lipofectamine2000及siRNA使用說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.2 Real-time PCR檢測(cè)mRNA的表達(dá) Trizol法提取細(xì)胞總RNA，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在BIO-RAD熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件:95℃30 s；95℃5 s，59℃5 s，39個(gè)循環(huán)；65℃5 s，95℃，讀取每個(gè)樣品相應(yīng)的CT值，采用熒光相對(duì)定量計(jì)算公式為：樣品/對(duì)照=2-ΔΔCт，計(jì)算出各基因的mRNA的表達(dá)量，選擇GAPDH作內(nèi)參，本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 蛋白免疫印跡雜交技術(shù)（western blot）檢測(cè)蛋白表達(dá) 12%SDS-PAGE分離上述蛋白質(zhì)，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜后，5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜1 h，4℃一抗孵育過(guò)夜，HRP標(biāo)記二抗室溫孵育1 h，ECL檢測(cè)目的蛋白條帶。

1.2.4 細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 待孔板中的細(xì)胞長(zhǎng)到幾近完全融合時(shí)，用10 μL的小槍頭在孔板的底面上沿直線輕輕劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜；加入含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0、12、24、36、48 h在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞劃痕愈合情況并拍照片記錄。記錄完成后，用Image J軟件測(cè)量細(xì)胞的遷移距離，SPSS13統(tǒng)計(jì)分析并應(yīng)用sigmaplot軟件作圖，用細(xì)胞劃痕愈合百分比判斷細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力（0 h的細(xì)胞劃痕愈合為0）。

1.2.5 Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn) 收取細(xì)胞后用含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至1×105/mL。取細(xì)胞懸液200μL加入Transwell小室(1×104個(gè)細(xì)胞)?？装逑率壹尤?00 μL趨化因子（趨化因子：胎牛血清=9∶1），37℃，5%CO2培養(yǎng)，48 h后結(jié)晶紫溶液染色，400倍顯微鏡下隨意挑選5個(gè)視野觀察細(xì)胞，并記數(shù)，取平均數(shù)。

1.2.6 細(xì)胞免疫熒光染色技術(shù) 胰酶消化細(xì)胞，按照細(xì)胞傳代的方法將細(xì)胞懸液加入事先備好的含有玻璃爬片的24孔板中。24 h后轉(zhuǎn)染siRNA，并置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。每孔內(nèi)加入適量4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞，用0.1%triton-X-100室溫通透細(xì)胞膜5min。1%BSA室溫封閉30min，4℃一抗孵育過(guò)夜。次日取出室溫復(fù)溫30 min，避光滴加二抗，37℃溫箱避光孵育30 min。DAPI染料避光染細(xì)胞核5 min，洗去染核液后，每孔加入1×PBS，熒光顯微鏡或激光共聚焦掃描顯微鏡觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 沉默HeLa細(xì)胞HPV18-E7基因表達(dá)并檢測(cè)EMT標(biāo)記物的表達(dá)變化 為證實(shí)HPV18-E7基因與EMT的誘導(dǎo)有相關(guān)性，本實(shí)驗(yàn)用針對(duì)HPV18-E7的siRNA轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞并應(yīng)用real-time PCR技術(shù)與免疫印跡實(shí)驗(yàn)分別在mRNA和蛋白水平檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)變化。如圖1A示，SIE7轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞后細(xì)胞間連接變得更加緊密；圖1B示SIE7轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞后48 h，細(xì)胞中E7與間質(zhì)性標(biāo)記物N-cadherin,Vimetin及fibronectin的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組細(xì)胞顯著下降，其下降幅度分別為（82.97±4.90）%、（66.58±1.78）%、（42.34±1.89）%和（32.47±1.67）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；然而上皮性標(biāo)記物E-cadherin mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組細(xì)胞明顯增加，其增加幅度為（95.25±3.40）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。采用Western印跡法檢測(cè)各指標(biāo)蛋白水平的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，HeLa-SIE7細(xì)胞E7和Vimentin表達(dá)與對(duì)照組相比顯著下降，降幅分別為（91.25±11.97）%和（61.09±3.40）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；E-cadherin與對(duì)照組相比增加幅度為（85.27±2.35）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，圖1C）。如圖1D示，隨著HeLa-SIE7細(xì)胞E7表達(dá)的下調(diào)，E-cadherin在細(xì)胞膜上的表達(dá)增加，然而間質(zhì)性標(biāo)記因子vimentin細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的表達(dá)隨之下降。以上數(shù)據(jù)表明，在HPV18陽(yáng)性的人宮頸腺癌細(xì)胞HeLa中特異性下調(diào)E7基因的表達(dá)可以導(dǎo)致EMT發(fā)生逆轉(zhuǎn)，即發(fā)生MET。

圖1 HeLa細(xì)胞沉默HPV18-E7表達(dá)后細(xì)胞形態(tài)及EMT標(biāo)記因子的表達(dá)變化Fig 1 HPV18-E7 depletion induced MET in HeLa cells

2.2 特異性沉默HeLa細(xì)胞HPV18-E7基因表達(dá)對(duì)細(xì)胞侵襲遷移能力的影響 運(yùn)用細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)及Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)特異性沉默HeLa細(xì)胞HPV18-E7基因（HeLa-SIE7細(xì)胞）后細(xì)胞遷移及侵襲能力的變化。在0、24、48 h時(shí)點(diǎn)對(duì)細(xì)胞遷移情況進(jìn)行對(duì)比顯示，HeLa-SIE7細(xì)胞遷移能力明顯低于對(duì)照組，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖2 A，B）。行Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)48 h后，對(duì)發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的細(xì)胞進(jìn)行染色計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)穿透Transwell小室基底膜的HeLa-SIE7細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組少，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖2 C，D）。以上結(jié)果表明，在HPV18陽(yáng)性的人宮頸腺癌細(xì)胞HeLa中特異性下調(diào)E7基因的表達(dá)可使細(xì)胞侵襲遷移能力明顯下降。

圖2 HeLa細(xì)胞下調(diào)HPV18-E7表達(dá)對(duì)細(xì)胞侵襲遷移能力的影響Fig 2 Down-regulation of HPV18-E7 inhibited invasion and migration of HeLa cells

3 討論

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，我國(guó)宮頸癌的發(fā)病率和死亡率持續(xù)增加并出現(xiàn)了年輕化趨勢(shì)?，F(xiàn)有的流行病學(xué)及分子生物學(xué)研究證實(shí)，HPV病毒（human papillomavirus，HPV）的感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的最主要病因，約97%的宮頸癌均伴有HPV的感染。臨床最為常見的宮頸癌有宮頸鱗狀細(xì)胞癌和宮頸腺癌兩大類，所占比例分別為75%～90%，10%～25%。近年來(lái)多項(xiàng)研究指出宮頸腺癌的發(fā)病率有上升及年輕化趨勢(shì)。宮頸腺癌易發(fā)生局部浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且病程進(jìn)展迅速，預(yù)后較鱗癌差。對(duì)3 471例宮頸癌患者進(jìn)行分類研究，指出宮頸腺癌發(fā)生卵巢轉(zhuǎn)移的比例較鱗癌高，分別是5.31%，0.79%。兩種病理類型的宮頸癌其感染HPV的類型也不同。流行病學(xué)顯示，宮頸鱗狀細(xì)胞癌多以HPV16、HPV58型感染為主，宮頸腺癌以HPV18、HPV45型感染為主，其中HPV18型所占比例高達(dá)34%～50%。在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，HPV的兩個(gè)重要癌蛋白E6/E7起著關(guān)鍵作用。現(xiàn)有研究表明E6/E7蛋白可分別與抑癌蛋白p53和pRb結(jié)合,使p53通路和Rb通路失去活性,導(dǎo)致其對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控發(fā)生異常,最終引起細(xì)胞增殖失控，抑癌基因?qū)NA的損傷修復(fù)功能喪失，導(dǎo)致癌前病變及癌癥的發(fā)生，與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此可以針對(duì)HPV18-E6/E7為靶點(diǎn)來(lái)研究宮頸腺癌發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制，從而解釋其預(yù)后差的原因，并以此找到改善其不良預(yù)后的治療方法。

EMT是哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育過(guò)程中的生理現(xiàn)象，也是維持生命體組織平衡的基本生理事件?，F(xiàn)在越來(lái)越多的證據(jù)證實(shí)EMT可以抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤耐藥性發(fā)生、促使腫瘤細(xì)胞具有干細(xì)胞特性、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等[8]。EMT是上皮標(biāo)記性物質(zhì)表達(dá)下調(diào)并發(fā)生再定位的同時(shí)間質(zhì)標(biāo)記性物質(zhì)表達(dá)上調(diào)最終導(dǎo)致細(xì)胞獲得侵襲遷移能力的一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程[9]，這一過(guò)程需細(xì)胞內(nèi)特定的因子及通路的協(xié)助與調(diào)控。目前證實(shí)的參與調(diào)控EMT過(guò)程的因子包括轉(zhuǎn)錄因子（Snail,Slug,ZEB1,ZEB2, Twist1，Twist2等），miRNAs（miR-200家族）及一些生長(zhǎng)因子（PDGF-D）等。近期，對(duì)人正常包皮細(xì)胞，犬腎上皮細(xì)胞（MDCK細(xì)胞），HPV16陽(yáng)性的SiHa細(xì)胞及頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中的研究證實(shí)HPV16-E6/E7能夠誘導(dǎo)EMT發(fā)生，然而HPV18陽(yáng)性表達(dá)的宮頸腺癌HeLa細(xì)胞中無(wú)相關(guān)研究。

本次研究首次在人宮頸腺癌HeLa細(xì)胞中探討HPV18-E7與EMT的關(guān)系。研究證實(shí)，宮頸腺癌中HPV18-E7能夠誘導(dǎo)EMT發(fā)生并使細(xì)胞處于間質(zhì)化狀態(tài)從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移。誘導(dǎo)EMT是HPV18-E7新發(fā)現(xiàn)的功能，此結(jié)果為HPV18-E7在宮頸腺癌中的作用添加了另一個(gè)標(biāo)簽：HPV18-E7不僅在宮頸腺癌發(fā)生中起作用，其還在宮頸腺癌的發(fā)展即侵襲遷移方面起重要作用，HPV18持續(xù)感染可誘導(dǎo)宮頸腺癌細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，影響其預(yù)后及治療效果。

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（2016-04-30收稿）

Study on the relationship between HPV18-E7 and epithelial-mesenchymal transition in cervical adenocarcinoma cells

Miherinisha Maimaiti,Abidan Tuerhanjiang,HAN Li-li
（Department of Gynecology,People’s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region,Wulumuqi 830000,China）

Objective:To determine the role of HPV18-E7 oncogene in the epithelial to mesenchymal transition(EMT)like process. Methods:HPV18-E7 siRNAs were transfected in human cervical cancer HeLa cells.Real-time PCR,western blot and immunofluorescence technique were performed to examine the localization and expression of E7 and EMT markers,respectively.Furthermore,the wound healing assay and matrigel invasion assay were used to evaluate the invasion and migration ability.Results:On the mRNA and protein levels,E7 depletion significantly induced the expression of E-caderin.Furthermore,N-caderin,Vimetin,and fibronectin expression were decreased in HeLa-SIE7 cells.E-cadherin was up-regulated and mainly observed in contact areas between cells in HeLa/SIE7 cells,while the mesenchymal markers such as N-caderin,and fibronectin were reduced and detected mainly in the cytoplasm.Down-regulation of HPV18-E7 by transient transfection of HPV18-E7 siRNAs in HeLa cells caused significant inhibition of cell invasion and migration compared with the siNC transfected cells.Conclusion:In HeLa cells HPV18-E7 can enhance invasion and migration by inducing EMT.

cervical adenocarcinoma；EMT；HPV18-E7

R737.33

A

1006－8147（2016）06-0487-05

米合日尼沙·買買提（1976-），女，副主任醫(yī)師，碩士，研究方向：婦科腫瘤的診治；通信作者：韓莉莉，E-mail：hanliliabcd@163. com。