大鼠腦缺血再灌注后線粒體損傷及p-STAT3表達(dá)

陳爽，趙亞倩，茍蕓，黃國(guó)偉，張緒梅

（天津醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，天津300070）

論著

大鼠腦缺血再灌注后線粒體損傷及p-STAT3表達(dá)

陳爽，趙亞倩，茍蕓，黃國(guó)偉，張緒梅

（天津醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，天津300070）

目的：研究大鼠腦缺血再灌注后腦組織線粒體中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和激活子3（STAT3）的表達(dá)情況，探討線粒體中磷酸化STAT3（p-STAT3）與腦缺血后線粒體損傷的關(guān)系。方法：線栓法制作大鼠腦局部缺血再灌注模型，大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)（SHAM）組和大腦中動(dòng)脈栓塞再灌注（I/R）組。透射電鏡觀察皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元內(nèi)的線粒體損傷情況。Western blotting及免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)線粒體中STAT3及p-STAT3表達(dá)。結(jié)果：與SHAM組比較，大鼠腦缺血再灌注后，皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元內(nèi)的線粒體損傷嚴(yán)重；線粒體中存在STAT3表達(dá)，且在腦缺血再灌注后表達(dá)量無變化,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而p-STAT3表達(dá)顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：STAT3在大鼠腦組織線粒體中表達(dá)，腦缺血再灌注后被顯著激活，推測(cè)腦缺血再灌損傷后，線粒體中STAT3的激活可能參與了腦缺血再灌注病理生理過程中線粒體的損傷和修復(fù)。

缺血再灌注；腦組織線粒體；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子3；大鼠

腦卒中具有發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高等特點(diǎn)，是一類危害嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。研究表明腦缺血再灌注損傷的病理生理機(jī)制極為復(fù)雜。其中一些信號(hào)通路，如Janus激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子（Janus kinase-signal transducer and activator of transcription,JAK-STAT）參與了腦損傷的過程。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子 （signal transducer and activators of transcriptions,STATs）是一類可與JAKs信號(hào)偶聯(lián)，與靶基因調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合調(diào)控轉(zhuǎn)錄的胞漿蛋白。目前在哺乳動(dòng)物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)7種，分別是STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6[1-2]。STAT3是STATs家族的重要成員，大量研究表明腦缺血損傷后，磷酸化 STAT3（phosphorylated STAT3，p-STAT3）在皮質(zhì)、海馬、紋狀體等區(qū)域的神經(jīng)細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)增加[3-4]，腦缺血再灌注24h，STAT3基因表達(dá)量增加92%[5]。最近研究發(fā)現(xiàn)，在心肌、肝臟等組織的線粒體中也存在STAT3表達(dá)[6]，心肌缺血等損害過程中，它通過作用于線粒體呼吸鏈復(fù)合酶和抑制線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔的開放而發(fā)揮對(duì)線粒體的保護(hù)作用[7-8]。但大鼠腦組織線粒體中是否存在 STAT3表達(dá)以及腦損傷后STAT3活化情況尚不明確，本研究擬采用大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，研究腦組織線粒體中p-STAT3及總STAT3在缺血損傷后的表達(dá)情況，為研究STAT3在腦缺血損傷中的作用機(jī)制提供線索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量180～200 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供[許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001]。動(dòng)物按體質(zhì)量分層，再隨機(jī)分為假手術(shù)組（SHAM）、腦缺血再灌注組（I/R），每組20只。大鼠適應(yīng)1周后造模。再灌注24 h后處死大鼠取材。

1.2 主要試劑 腦組織線粒體提取試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；小鼠抗大鼠STAT3單克隆抗體、兔抗大鼠p-STAT3（Tyr705）單克隆抗體、β-actin購(gòu)自CST（Cell Signaling Technology）公司，小鼠抗大鼠Cytochrome C單克隆抗體、小鼠抗大鼠SOD2單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司，DAPI（索萊寶生物），F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗兔IgG、TRICT標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（北京中杉金橋科技有限公司），檸檬酸鈉抗原修復(fù)液（碧云天生物技術(shù)研究所），即用型山羊血清封閉液（博士德生物技術(shù)有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型的制備 采用改良Longa法[9]制備大鼠大腦局灶性腦缺血再灌注模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水，適應(yīng)1周后隨機(jī)分組，進(jìn)行造模，腹腔注射10%水合氯醛（0.30 mL/100 g）麻醉大鼠，仰臥位固定，頸部正中縱向切口，逐層分離。暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈（common carotid artery，CCA）和迷走神經(jīng)。鈍性分離CCA和迷走神經(jīng)。找到左側(cè)頸外動(dòng)脈（external carotid artery，ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（internal carotid artery，ICA）分叉，分離ECA，ICA，縫線結(jié)扎左側(cè)CCA近心端和ECA，以動(dòng)脈夾夾閉ICA；用1 mL注射器針頭于CCA結(jié)扎的遠(yuǎn)心端（距頸總動(dòng)脈分叉處約2～3 mm）刺一小口入栓塞線，松開ICA動(dòng)脈夾，調(diào)整栓線方向及角度，栓線經(jīng)頸總動(dòng)脈進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，遇阻力不能再進(jìn)為止，插線長(zhǎng)度約18～20 mm，縫合線固定栓線，確認(rèn)無出血后縫合皮膚，缺血1 h時(shí)將栓線拔出10 mm，形成再灌注。缺血過程中采用烤燈維持大鼠體溫。假手術(shù)組除不插栓線外，其余過程同模型組。

1.3.2 腦組織線粒體的提取 按照試劑盒說明書提取腦組織線粒體，取新鮮大鼠腦組織約200 mg，用PBS洗組織1次。將組織置于冰上的玻璃勻漿器中，隨后加入10倍體積預(yù)冷的線粒體分離試劑A（臨用前加PMSF），在冰上進(jìn)行勻漿，勻漿10次左右。獲得的勻漿在1 000×g，4℃離心5 min。然后把上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管，在3 500×g，4℃離心10 min。隨即獲得的上清為除線粒體的細(xì)胞漿蛋白，沉淀即為分離得到的線粒體。

1.3.3 線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察 再灌注24 h，每組隨機(jī)取3只大鼠斷頭取腦，置于冰上，分離出梗死側(cè)皮層，將皮層切成1 mm3的小塊，迅速置于2.5%戊二醛中固定過夜，1%鋨酸后固定，磷酸鹽緩沖液沖洗漂洗，酒精和丙酮梯度脫水后，環(huán)氧樹脂包埋，半薄切片選區(qū)，超薄切片，再經(jīng)醋酸和檸檬酸鋁雙重染色后于透射電子顯微鏡下觀察腦神經(jīng)細(xì)胞及線粒體的損傷情況，并拍照。

1.3.4 線粒體損傷評(píng)分 通過基于線粒體的超微結(jié)構(gòu)特征的評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行線粒體損傷程度評(píng)估[10]（表1）。對(duì)于每個(gè)樣本，從兩個(gè)不同的網(wǎng)格，隨機(jī)選擇3個(gè)相隔較遠(yuǎn)的區(qū)域進(jìn)行線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察。選擇2位觀察者進(jìn)行盲法評(píng)分，線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重程度的量化通過確定一個(gè)總分，最后每組線粒體損傷程度得分取兩位觀察者得分的均值。

1.3.5 Western blotting檢測(cè)線粒體蛋白純度 提取腦組織線粒體蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量。線粒體蛋白純度檢測(cè)方法參照之前的研究[6]，Western blotting檢測(cè)逐漸遞增量的線粒體蛋白中的STAT3，β-actin，Cytochrome C的含量。

表1 基于細(xì)胞損傷階段的線粒體評(píng)分[10]Tab 1 Mitochondrial injury scoring system based on the stages of cellular injury

1.3.6 Western blotting檢測(cè)磷酸化 STAT3及總STAT3表達(dá) 取各組線粒體蛋白20 μg，進(jìn)行SDSPAGE電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至NC膜，5%BSA室溫封閉1 h后，分別加入一抗（p-STAT3 1∶2 000，STAT3 1∶2 000），4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，用化學(xué)發(fā)光底物試劑呈色，蛋白條帶用ImageJ 2.0軟件進(jìn)行定量分析。

1.3.7 免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)腦缺血再灌注后線粒體中磷酸化STAT3表達(dá) 石蠟切片脫蠟、水化、3% H2O2室溫封閉10 min、檸檬酸鈉-EDTA抗原修復(fù)、山羊血清37℃封閉30 min～1 h、滴加一抗（p-STAT3 1∶100，SOD2 1∶100）4℃孵育過夜。PBS洗3次，滴加熒光二抗混合液（山羊抗兔FITC 1∶100，山羊抗小鼠TIRTC 1∶100）25℃避光孵育1 h，抗熒光衰減猝滅劑封片。陰性對(duì)照片不加一抗，采用PBS代替，其余步驟相同。熒光倒置顯微鏡（Olympus BX51，日本）拍片，圖像結(jié)果采用Image-Pro-Plus6.0軟件進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1腦缺血再灌注后線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化 SHAM組神經(jīng)元細(xì)胞核核膜清晰完整，染色質(zhì)呈顆粒狀，均勻分布在細(xì)胞核中，胞漿中線粒體呈橢圓形或桿狀，大小正常，嵴結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊有序，基質(zhì)濃密。I/R組胞漿中線粒體腫脹，嵴斷裂，排列不整齊，甚至出現(xiàn)空泡化，見圖1。

圖1 大鼠腦缺血再灌注24 h后線粒體電鏡觀察Fig 1 Cerebral mitochondria in rats observed by electromicroscopy at 24 h after ischemia-reperfusion

2.2 腦組織線粒體損傷評(píng)分 SHAM組：（0.16±0.11）分，I/R組：（2.33±0.58）分，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 線粒體蛋白的純度驗(yàn)證 β-actin主要存在于胞漿蛋白中，在線粒體蛋白中，β-actin的含量極少，如果線粒體蛋白中含有胞漿蛋白，總STAT3與β-actin比值應(yīng)該接近1，本文結(jié)果顯示在提取的腦組織線粒體蛋白中，STAT3與β-actin的比值為11～18，故所提線粒體蛋白純度較高。STAT3與β-actin，Cytochrome C檢測(cè)結(jié)果見圖2。

圖2 腦組織線粒體蛋白純度檢測(cè)Fig 2 The detection of the cerebral mitochondrial purity

2.4腦缺血再灌注后線粒中p-STAT3與總STAT3的表達(dá)水平 腦缺血再灌注后，線粒體中STAT3的活性與SHAM組相比顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此外總STAT3兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3A、3B。

圖3 大鼠腦缺血再灌注后線粒體中p-STAT3和總STAT3的表達(dá)Fig 3 The protein expressions of phosphorylated and total STAT3 in the mitochondria of rat brain after ischemia-reperfusion

2.5 腦缺血再灌注后皮質(zhì)區(qū)線粒體中p-STAT3表達(dá)情況 SOD2是免疫組化中識(shí)別腦組織線粒體的特異性標(biāo)記物。SOD2與p-STAT3免疫熒光雙標(biāo)記結(jié)果顯示，患側(cè)皮質(zhì)區(qū)SOD2與p-STAT3雙標(biāo)陽(yáng)性數(shù)顯著增加（圖4），說明梗塞可導(dǎo)致皮質(zhì)區(qū)線粒體中p-STAT3表達(dá)升高。

圖4 腦缺血再灌注后線粒體中p-STAT3表達(dá)情況Fig 4 The expressions of mitochondrial p-STAT3 after cerebral ischemia-reperfusion

3 討論

腦缺血再灌注損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，包括諸多環(huán)節(jié)如自由基生成、能量障礙、細(xì)胞酸中毒、興奮性氨基酸釋放增加、細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)、凋亡基因激活等的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，這些環(huán)節(jié)互為因果，彼此重疊，并互相聯(lián)系，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或細(xì)胞壞死性死亡[11-12]。研究表明，線粒體是缺血后細(xì)胞凋亡及細(xì)胞壞死性死亡的關(guān)鍵靶區(qū)，也是神經(jīng)細(xì)胞存活的關(guān)鍵因素[11]。腦缺血再灌注通過各種途徑造成線粒體結(jié)構(gòu)和功能異常，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體數(shù)量減少以及功能障礙，最終誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡或壞死性死亡。因此，研究腦缺血再灌注后線粒體損傷及功能障礙的機(jī)制，可能會(huì)給缺血性腦病的治療提供新思路。

以往大量研究證據(jù)表明，STAT3作為一種信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和存活等重要生物學(xué)效應(yīng)[2,13]。在腦缺血再灌注模型研究中，亦發(fā)現(xiàn)在不同腦區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞核中p-STAT3的表達(dá)顯著增加，且抑制p-STAT3的表達(dá)對(duì)腦缺血損傷起到一定的保護(hù)作用[14-15]。然而，目前關(guān)于大鼠腦組織線粒體中是否存在STAT3及在腦缺血損傷后其表達(dá)是否發(fā)生變化尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦組織線粒體中存在STAT3的表達(dá)，腦缺血再灌注損傷對(duì)線粒體中總STAT3蛋白水平無影響，但可顯著上調(diào)線粒體p-STAT3的表達(dá)及其磷酸化活性（p-STAT3/STAT3）。同時(shí)觀察到腦缺血損傷后，腦組織中線粒體發(fā)生明顯損傷，故推測(cè)腦組織線粒體中p-STAT3表達(dá)的升高可能與線粒體本身的損傷有關(guān)。研究p-STAT3在線粒體中的表達(dá)變化，為腦缺血損傷病理機(jī)制的研究提供了新的線索，也對(duì)STAT3信號(hào)通路作為非轉(zhuǎn)錄因子的功能有了更深入的認(rèn)識(shí)。

既往已有報(bào)道顯示：STAT3存在于大鼠的心臟及小鼠的肝臟等組織的線粒體內(nèi)。如在心肌缺血過程中，線粒體中p-STAT3能夠維持線粒體復(fù)合物Ⅰ的活性，并減少ROS的產(chǎn)生，起到保護(hù)心肌的作用[16]，此外STAT3活性(p-STAT3/STAT3)的下調(diào)會(huì)導(dǎo)致線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ活性的降低，使活性氧水平升高，ATP能量合成減少，進(jìn)而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡和（或）細(xì)胞壞死[17]。故心肌線粒體內(nèi)的p-STAT3可通過直接作用于線粒體呼吸鏈復(fù)合物，降低活性氧的生成，對(duì)線粒體及缺血心肌起到保護(hù)作用[16,18]。由于pSTAT3所執(zhí)行的具體功能與其所在的組織及細(xì)胞種類密切相關(guān)，故腦缺血再灌注后線粒體STAT3的激活是否通過調(diào)控復(fù)合酶的活性或ROS的生成對(duì)線粒體的損傷造成影響，尚有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，大鼠腦組織中存在STAT3，并且腦缺血再灌注后線粒體中p-STAT3表達(dá)水平顯著升高，線粒體中STAT3磷酸化水平的升高可能與腦缺血后線粒損傷有關(guān)。研究將為磷酸化STAT3在腦缺血后線粒體中的具體作用機(jī)制的探討及腦缺血再灌注病理過程的研究奠定基礎(chǔ)。

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（2016-05-07收稿）

Mitochondrial damage and p-STAT3 protein expression following focal cerebral ischemia-reperfusion in rats

CHEN Shuang,ZHAO Ya-qian,GOU Yun,HUANG Guo-wei，ZHANG Xu-mei
（Department of Nutrition and Food Hygiene,School of Public Health,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China）

Objective:To assess the expression and activation of signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3)in mitochondria of rat brain cortex,and explore the role of phosphorylated STAT3 (p-STAT3)in mitochondrial injury and repair following cerebral ischemia-reperfusion.Methods:The model of focal cerebral ischemia-reperfusion was established by suture method.The rats were randomly divided into the sham-operated(SHAM)group and the middle cerebral occlusion-reperfusion(I/R)group.The ultrastructure of cortex mitochondria was observed under transmission electronic microscope.The expressions of total STAT3 and p-STAT3 were detected by western blotting and immunofluorescent double-staining.Results:A significant mitochondrial ultrastructural injury was found in I/R group,compared with the SHAM group.STAT3 immunoreactivity was observed in the mitochondria of rat brain cortex.No significant difference in total STAT3 level was detected in both experimental groups(P＞0.05),whereas the level of p-STAT3 in the mitochondria of brain cortex was elevated after ischemia injury(P＜0.05).Conclusion:STAT3 localizes in mitochondria.The activity of mitochondrial STAT3 is elevated during cerebral ischemia-reperfusion.STAT3 activation may be involved in mitochondrial injury and repair in the pathophysiological process of cerebral ischemia-reperfusion injury.

ischemia-reperfusion;cerebral mitochondria;signal transducer and activator of transcription 3；rat

R743.3

A

1006－8147（2016）06-0469-05

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81373003）；中國(guó)博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2014M550148）

陳爽（1990-），女，碩士在讀，研究方向：營(yíng)養(yǎng)與神經(jīng)退行性疾?。煌ㄐ抛髡撸簭埦w梅，E-mail：zhangxumei@tijmu.edu.cn。