家兔血液應(yīng)用于醫(yī)療器械血液相容性評(píng)價(jià)的可行性研究

楊文潤 田勝慧 柯軍 廣東省醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所 （廣州 510080）

家兔血液應(yīng)用于醫(yī)療器械血液相容性評(píng)價(jià)的可行性研究

楊文潤 田勝慧 柯軍 廣東省醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所 （廣州 510080）

由于人血大量使用的限制性，本研究選取3種常用的血液凈化醫(yī)療器械探討兔血替代人血在醫(yī)療器械血液相容性評(píng)價(jià)中的可行性。結(jié)果表明，3類器械的兔血和人血血液相容性分析結(jié)果具有較好的一致性，兔血可替代人血進(jìn)行血液相容性評(píng)價(jià)。由于兔血和人血的差異性，補(bǔ)體激活試驗(yàn)只適宜相對(duì)結(jié)果分析。

血液相容性 兔血 人血 醫(yī)療器械

0.前言

血液透析器是血液凈化療法中最常用的醫(yī)療器械，因其與人體血液直接接觸，屬于三類高風(fēng)險(xiǎn)醫(yī)療器械，因此該類產(chǎn)品上市之前，醫(yī)療器械檢測(cè)機(jī)構(gòu)要對(duì)其進(jìn)行嚴(yán)格的生物學(xué)評(píng)價(jià)，以避免臨床不良事件的發(fā)生。2008 年，國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布了血液透析器的新標(biāo)準(zhǔn) YY0053-2008《心血管植入物和人工器官－血液透析器、血液透析濾過器、血液濾過器和血液濃縮器》加嚴(yán)了生物學(xué)評(píng)價(jià)方面的要求，增加了細(xì)胞毒性、血液相容性、皮內(nèi)刺激與皮膚致敏等生物學(xué)試驗(yàn)。

然而，臨床應(yīng)用的血液凈化材料仍然存在直接或間接地導(dǎo)致血液成分的改變或血栓形成的現(xiàn)象，因此，血液相容性評(píng)價(jià)研究已成為此類材料應(yīng)用的關(guān)鍵問題之一[1]。判斷材料的好壞首先看其是否具備良好的生物相容性，尤其是良好的血液相容性。血液相容性是指材料與血液接觸時(shí)，無血栓形成、無血細(xì)胞破壞、不引起凝血及血小板的粘附和凝聚以及補(bǔ)體的活化。

材料與血液接觸時(shí)，由于其本身的理化性質(zhì)，血液各種成分和膜材料之間發(fā)生的相互作用，血漿蛋白質(zhì)首先被吸附在材料表面，并進(jìn)一步激活血小板、補(bǔ)體和凝血系統(tǒng)，活化白細(xì)胞，引起血栓和炎癥反應(yīng)。補(bǔ)體激活是在血液透析過程中經(jīng)常發(fā)生的，也是患者在長期透析后引起殘存腎功能衰退、反復(fù)發(fā)生感染的主要原因。此外，粘附于材料表面的紅細(xì)胞發(fā)生變形、破裂，可導(dǎo)致溶血。因此，血液相容性評(píng)價(jià)研究對(duì)此類器械在血液凈化領(lǐng)域中的應(yīng)用起到至關(guān)重要的作用。

由于在止血和血液因子及活性方面存在物種差異性，所以在體外試驗(yàn)中應(yīng)盡可能首選人血。在我國，人血供應(yīng)是受限制的，必須儲(chǔ)備用于人體輸血。而且血液保存期較短，這使得及時(shí)得到人血細(xì)胞更為困難。而我們?nèi)粘z驗(yàn)工作中對(duì)大量血液的需求，使這種選擇難以實(shí)現(xiàn)或不可能。有報(bào)道表明，家兔與人的紅細(xì)胞具有相似的溶血特性，而家兔也是醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)中常用的模式動(dòng)物，并具有穩(wěn)定的種系來源，使得家兔作為替代選擇應(yīng)用于血液相容性評(píng)價(jià)研究中具有極大地可行性。由于在血液反應(yīng)方面存在物種差異性，GB/T 16886.4中指出要注意所選物種與人的生理差異和相近之處[3,5]，特別是凝血、血小板功能和纖維蛋白溶解以及對(duì)諸如麻醉劑、抗凝劑、溶血栓劑和抗血小板劑這類藥物和抗生素的反應(yīng)，由一種物種試驗(yàn)中得到的數(shù)據(jù)應(yīng)予以謹(jǐn)慎說明。因此，在本研究中我們選擇了最常用3類的血液凈化器械，透析器，灌流器和體外循環(huán)管路，分別使用人血和兔血評(píng)價(jià)其血液相容性，對(duì)比兩者在凝血，血栓形成，血小板活化，血液學(xué)和補(bǔ)體C3a激活的差異[2,7]，以探討家兔應(yīng)用在血液相容性評(píng)價(jià)中的可行性。

1.材料與方法

根據(jù)GB/T 16886.4/ISO 10993.4《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第4部分：與血液相互作用試驗(yàn)選擇》和GB/T 16886.12/ISO10993.12《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第12部分：樣品制備與參照樣品》主要從以下試驗(yàn)項(xiàng)目對(duì)比人血和兔血血液相容性評(píng)價(jià)的差異：凝血酶原時(shí)間測(cè)定、體外血栓形成、血小板計(jì)數(shù)、補(bǔ)體激活試驗(yàn)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)以及溶血試驗(yàn)[3,4,5,6]。

1.1 溶血試驗(yàn)

試驗(yàn)組：取3支試管，每管注入10mL 0.9%氯化鈉注射液，按比例向每支試管內(nèi)加入所需樣品，搖勻，覆蓋全部材料。

陰性對(duì)照組：取3支試管，每支注入同批號(hào)10mL 0.9%氯化鈉注射液。

陽性對(duì)照組：取3支試管，每支注入10mL蒸餾水。

將試驗(yàn)管、陰性管、陽性管放入37°C水浴中保溫30min，隨后分別加入0.2mL稀釋抗凝兔血，輕輕混勻，繼續(xù)在37°C恒溫水浴中保溫60min。水浴結(jié)束后倒出管內(nèi)液體，800g離心5min。取上清液置于紫外分光光度計(jì)比色皿中，在545nm處測(cè)量吸光度值，并計(jì)算各組3管的平均值。溶血程度按以下公式計(jì)算：

式中：A-供試品液吸光度；B-陰性對(duì)照液吸光度；C-陽性對(duì)照液吸光度。

1.2 白細(xì)胞計(jì)數(shù)試驗(yàn)

按比例將供試品加入到硅化玻璃管中，每組平行操作3個(gè)樣品。每支硅化玻璃管中加入1.5mL血液，使材料全部被浸沒，放入置于37°C隔水培養(yǎng)箱的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器上，30rd/min動(dòng)態(tài)接觸1h。1h后取出，吸出抗凝全血，用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀測(cè)供試品、參照品和空白對(duì)照全血中的白細(xì)胞數(shù)量。

1.3 血小板計(jì)數(shù)試驗(yàn)

按比例將供試品加入到硅化玻璃管中，每組平行操作3個(gè)樣品。每支硅化玻璃管中加入1.5mL血液，使材料全部被浸沒，將硅化玻璃管放入置于37°C隔水培養(yǎng)箱的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器上，30rd/min動(dòng)態(tài)接觸1h。1h后取出供試品、參照品和空白對(duì)照管，吸出抗凝全血，用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀測(cè)供試品、參照品和空白對(duì)照全血中的血小板數(shù)量。

1.4 凝血酶原時(shí)間（PT）試驗(yàn)

按比例將供試品加入到硅化玻璃管中，每組平行操作3個(gè)樣品。每支硅化玻璃管中加入1.5mL血液，使材料全部被浸沒，放入置于37°C隔水培養(yǎng)箱的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器上，30rd/min動(dòng)態(tài)接觸1h。用冷凍離心機(jī)，在4°C下，2000g離心10min，分離血漿，用凝血儀檢測(cè)凝血酶原時(shí)間（PT）。

1.5 體外血栓形成試驗(yàn)

按比例將供試品加入到硅化玻璃管中，每組平行操作3個(gè)樣品。試驗(yàn)方法：心臟采取家兔血液10mL，加入3.8%檸檬酸鈉溶液0.4mL進(jìn)行部分抗凝，向每支硅化玻璃試管內(nèi)注入0.5mL部分抗凝血液，樣品與對(duì)照管交叉注入，室溫靜止10～15min，待試管內(nèi)形成部分血栓時(shí)，迅速加入肝素鈉溶液，并搖晃試管使其充分抗凝。將試管放入到冷凍離心機(jī)內(nèi)，2000g，4°C，離心10min，吸取上層血漿在凝血儀上檢測(cè)剩余纖維蛋白原的含量（注：剩余纖維蛋白原含量越少則說明血栓形成量越多）。

1.6 補(bǔ)體C3a激活試驗(yàn)

按比例將供試品加入到硅化玻璃管中，每組平行操作3個(gè)樣品。將供試品管、參照品管和空白對(duì)照管中分別加入等體積的血清，置于（37 ±1）°C水浴箱中孵育60min。孵育結(jié)束后，按照試劑盒說明書上的操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。

2.結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果與分析

表1，表2分別為體外循環(huán)管路用兔血和人血試驗(yàn)的血液相容性試驗(yàn)結(jié)果。其中溶血試驗(yàn)結(jié)果表明，使用兔血和人血進(jìn)行試驗(yàn)，溶血率均低于5%，且試驗(yàn)結(jié)果接近，表明體外循環(huán)管路溶血試驗(yàn)用人血和兔血具有良好一致性。從白細(xì)胞計(jì)數(shù)試驗(yàn)、血小板計(jì)數(shù)試驗(yàn)、凝血酶原時(shí)間試驗(yàn)和體外血栓形成試驗(yàn)這4個(gè)項(xiàng)目的結(jié)果分析，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)SPSS計(jì)算，試驗(yàn)樣品組與陰性對(duì)照品組的P值均大于0.05，且試驗(yàn)樣品組與陰性對(duì)照品組均值的比值很接近，表明體外循環(huán)管路的這4個(gè)項(xiàng)目無論是用人血或兔血進(jìn)行試驗(yàn)，血液相容性均表現(xiàn)良好。由于試劑盒和物種差異，人血和兔血檢測(cè)補(bǔ)體C3a含量的結(jié)果差異較大，但試驗(yàn)樣品組與陰性對(duì)照品組的P值均＞0.05，且試驗(yàn)樣品組與陰性對(duì)照品組的比值接近，均具有良好的血液相容性。

表3，表4分別為聚砜膜透析器用兔血和人血試驗(yàn)的血液相容性試驗(yàn)結(jié)果。溶血試驗(yàn)結(jié)果表明，分別使用兔血和人血進(jìn)行試驗(yàn)，溶血率均低于5%，且溶血結(jié)果一致，表明聚砜膜透析器溶血試驗(yàn)用人血和兔血具有良好的一致性。由于聚砜膜透析器吸附能力比較強(qiáng)，對(duì)白細(xì)胞和血小板都具有一定的吸附，特別是對(duì)血小板的吸附率比較高，所以這兩個(gè)計(jì)數(shù)試驗(yàn)結(jié)果都比陰性對(duì)照或者空白的低。聚砜膜透析器的體外血栓形成試驗(yàn)，由于材料為纖維狀態(tài)，在半凝固的血液中有一定的促凝作用，故纖維蛋白原含量均比陰性對(duì)照或空白對(duì)照低，凝血酶原時(shí)間有延遲。白細(xì)胞計(jì)數(shù)試驗(yàn)、血小板計(jì)數(shù)試驗(yàn)、凝血酶原時(shí)間試驗(yàn)和體外血栓形成試驗(yàn)這4個(gè)項(xiàng)目的結(jié)果分析表明，P值和試驗(yàn)樣品組與陰性對(duì)照品組的比值都具有較好的一致性，因此，無論是用人血或兔血進(jìn)行試驗(yàn)，聚砜膜透析器的血液相容性結(jié)果均可以取得比較好的一致性。由于試劑盒和物種的差異，人血和兔血補(bǔ)體C3a含量的值差異較大，但試驗(yàn)樣品組與陰性對(duì)照品組的P值均大于0.05，且試驗(yàn)樣品組與陰性對(duì)照品組的比值接近，兩組血液結(jié)果一致。

表5，表6分別為血液灌流器用兔血和人血試驗(yàn)的血液相容性試驗(yàn)結(jié)果。其中溶血試驗(yàn)結(jié)果表明，兔血和人血溶血率均低于5%，由于兔的紅細(xì)胞脆性比人紅細(xì)胞差，對(duì)有一定溶血作用的材料，一般兔血的溶血率略大。但兩組試驗(yàn)中，溶血率試驗(yàn)結(jié)果接近，表明血液灌流器溶血試驗(yàn)無論是用人血或兔血都具有良好的一致性。與透析器相似，血液灌流器吸附能力較強(qiáng)，對(duì)白細(xì)胞和血小板都具有一定的吸附，因此這兩項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果均比陰性對(duì)照或者空白低。由于血液灌流器的材料為顆粒狀態(tài)，在半凝固的血液中有一定的促凝作用，在體外血栓形成試驗(yàn)中，纖維蛋白原含量均比陰性對(duì)照或空白對(duì)照的值低，凝血酶原時(shí)間試驗(yàn)有延遲。從白細(xì)胞計(jì)數(shù)試驗(yàn)、血小板計(jì)數(shù)試驗(yàn)、凝血酶原時(shí)間試驗(yàn)和體外血栓形成試驗(yàn)這4個(gè)項(xiàng)目的結(jié)果分析，P值以及試驗(yàn)樣品組與陰性對(duì)照品組均值的比值都比較一致。這表明在人血和兔血試驗(yàn)中，血液灌流器的血液相容性的結(jié)果具有較好的一致性。人血和兔血補(bǔ)體C3a的含量的結(jié)果值差異比較大，但試驗(yàn)樣品組與陰性對(duì)照品組的P值均＞0.05，且試驗(yàn)樣品組與陰性對(duì)照品組均值的比值很接近，結(jié)果一致。

2.2 討論

表1. 兔血血液相容性試驗(yàn)結(jié)果（體外循環(huán)管路）

表2. 人血血液相容性試驗(yàn)結(jié)果（體外循環(huán)管路）

表3. 兔血血液相容性試驗(yàn)結(jié)果（聚砜膜透析器）

本研究選用血液相容性試驗(yàn)中3類常見醫(yī)療器械，體外循環(huán)管路、聚砜膜透析器和血液灌流器分析兔血和人血在血液相容性方面的差異，結(jié)果表明，在評(píng)價(jià)溶血率、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、體外血栓形成和凝血酶原時(shí)間試驗(yàn)中均具有較好的一致性，且結(jié)果相近。在評(píng)價(jià)補(bǔ)體C3a激活試驗(yàn)中，由于試劑盒和物種的差異，人血和兔血補(bǔ)體C3a含量的值差異較大，但試驗(yàn)樣品組與陰性對(duì)照品組的P值均大于0.05，且試驗(yàn)樣品組與陰性對(duì)照品組的比值接近，兩組血液結(jié)果一致。因此，在評(píng)價(jià)醫(yī)療器械產(chǎn)品血液相容性時(shí)，在沒有足夠可獲得人血時(shí)，可考慮使用兔血替代。但對(duì)于補(bǔ)體激活試驗(yàn)只適宜用于相對(duì)試驗(yàn)結(jié)果分析（有參照樣品），而不適宜用于絕對(duì)試驗(yàn)結(jié)果分析。

表4. 人血血液相容性試驗(yàn)結(jié)果（聚砜膜透析器）

表5.兔血血液相容性試驗(yàn)結(jié)果（血液灌流器）

表6. 人血血液相容性試驗(yàn)結(jié)果（血液灌流器）

[1] 楊立峰，柯軍，顏林，徐紅蕾.血液透析器的生物相容性研究及其臨床應(yīng)用現(xiàn)狀. 臨床醫(yī)學(xué)工程. 2012, 19(2):320-322

[2] 許建霞，奚廷斐.血液透析器中空纖維的體外血液相容性評(píng)價(jià).中國組織工程研究與臨床康復(fù), 2010. 14(38):7091-7094

[3] GB/T16886.4-2003 醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第4部分：與血液相互作用試驗(yàn)選擇

[4] GB/T 16886.12-2005 醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)[12].第十二部分：樣品制備與參照樣品

[5] ISO 10993-4：2002 Biological evaluation of medical devices—Part 4: Selection of tests for interactions with blood

[6] ISO 10993-12：2009 Biological evaluation of medical devices—Part 12: Sample preparation and reference materials

[7] 王輝.血液灌流器濾芯中吸附樹脂的體外血液相容性評(píng)價(jià). 中國醫(yī)療器械雜志. 2013(6):444-446

Feasibility of Rabbits Blood Used in Medical Devices Blood Compatibility Evaluation

YANG Wen-run TIAN Sheng-hui KE Jun Guangdong Medical Devices Quality Surveillance and Test Institute (Guangzhou 510080)

Absract: Due to the restrictive of extensive use of human blood, we selected 3 commonly used blood purification medical equipments to investigate the feasibility of rabbit blood substitute human blood in the medical device blood compatibility evaluation. Results of two groups have a good consistency; rabbit blood can be an alternative to human blood in blood compatibility evaluation. Since the differences of rabbit blood and human blood, complement activation evaluation is only suitable for relatively test result analysis.

blood compatibility, rabbit blood, human blood, medical equipment

1006-6586(2016)07-0041-05

R319

A

2016-04-21

楊文潤，助理工程師

廣東省醫(yī)療產(chǎn)品生物安全評(píng)價(jià)科技服務(wù)平臺(tái)（2012B011000003）