HPLC法同時(shí)測(cè)定桂樸微丸中厚樸酚、和厚樸酚的含量Δ

趙呈雷，黃一平，田耀洲，曹 鵬（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院/江蘇省中醫(yī)藥研究院，南京 210028）

HPLC法同時(shí)測(cè)定桂樸微丸中厚樸酚、和厚樸酚的含量Δ

趙呈雷＊，黃一平，田耀洲，曹 鵬（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院/江蘇省中醫(yī)藥研究院，南京 210028）

目的：建立同時(shí)測(cè)定桂樸微丸中厚樸酚、和厚樸酚含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Alltima C18，流動(dòng)相為甲醇-水（70∶30，V/V），流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為294 nm，柱溫為35℃，進(jìn)樣量為10μl。結(jié)果：厚樸酚、和厚樸酚檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍分別為0.206 4～2.064μg（r＝0.999 8）、0.088 0～0.880μg（r＝0.999 9）；定量限分別為0.41、0.26μg/ml，檢測(cè)限分別為0.12、0.075μg/ml；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為99.86%～102.11%（RSD＝1.02%，n＝6）、96.53%～101.74%（RSD＝1.83%，n＝6）。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確、靈敏、重復(fù)性好，可用于同時(shí)測(cè)定桂樸微丸中厚樸酚、和厚樸酚的含量。

桂樸微丸；厚樸酚；和厚樸酚；高效液相色譜法；含量測(cè)定

桂樸湯為臨床上治療胃氣虛寒所致的胃脘痛以及消化不良、胃炎、胃或十二指腸潰瘍等多種消化性疾病的常用方劑，該方出自清代孟河醫(yī)派名醫(yī)費(fèi)伯雄所著《醫(yī)醇勝義》中胃氣虛寒作痛的效方[1]。原方為煎劑，患者使用不便，本課題組在桂樸湯的基礎(chǔ)上通過(guò)對(duì)原方提取、純化，加入相關(guān)輔料采用擠出滾圓法制備了桂樸微丸[2]。桂樸微丸由厚樸、肉桂、當(dāng)歸、茯苓、大棗等中藥材組成，厚樸為方中君藥，其味苦、辛，性溫，歸脾、胃、肺、大腸經(jīng)，具有燥濕消痰、下氣除滿的功效[3]。藥理學(xué)研究表明，厚樸具有廣譜抗菌、抗炎、抗?jié)兊茸饔肹4-5]。厚樸酚、和厚樸酚為厚樸中木質(zhì)素類成分中含量最高的化合物，也是厚樸的主要有效成分[6]。因此，本課題組采用高效液相色譜法（HPLC）建立了同時(shí)測(cè)定桂樸微丸中厚樸酚、和厚樸酚含量的方法，以期為更好地控制該制劑的質(zhì)量提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Alliance 2695型HPLC儀，包括2695四元泵及自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、2996二極管陣列檢測(cè)器、Empower色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；KQ-3200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：150 W，頻率：40 kHz）；AB204-S型萬(wàn)分之一電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

桂樸微丸（江蘇省中醫(yī)藥研究院制劑室自制，批號(hào)：111220、111222、111224，規(guī)格：2.128 g/1 000粒）；厚樸酚對(duì)照品（批號(hào)：110729-200411，純度：98.4%）、和厚樸酚對(duì)照品（批號(hào)：110730-201011，純度：98.4%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Alltima C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（70∶30，V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：294 nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取厚樸酚、和厚樸酚對(duì)照品各適量，置于同一10 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，制得厚樸酚、和厚樸酚的質(zhì)量濃度分別為1.032、0.440 g/L的混合對(duì)照品貯備液。精密量取上述混合對(duì)照品貯備液1 ml，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，制得厚樸酚、和厚樸酚的質(zhì)量濃度分別為103.20、44.00μg/ml的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品適量，研細(xì)，取約2 g，精密稱定，置于150 ml具塞錐形瓶中，加甲醇50 ml，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，以甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按樣品的配方比例和工藝制備不含厚樸的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5；理論板數(shù)以厚樸酚峰計(jì)≥4 000。結(jié)果表明，其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得厚樸酚的回歸方程為y＝2 000 000x－44 700（r＝0.999 8），和厚樸酚的回歸方程為y＝2 000 000x－18 400（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，厚樸酚、和厚樸酚檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍分別為0.206 4～2.064、0.088 0～0.880μg。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照；1.和厚樸酚；2.厚樸酚Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed reference substance；B.test sample；C.negative control；1. honokiol；2.magnolol

2.5 定量限與檢測(cè)限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，等倍逐步稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得厚樸酚、和厚樸酚的定量限分別為0.41、0.26 μg/ml；當(dāng)信噪比為3：1時(shí)，得厚樸酚、和厚樸酚的檢測(cè)限分別為0.12、0.075μg/ml。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，厚樸酚、和厚樸酚峰面積的RSD分別為0.31%、0.51%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液（批號(hào)：111220）適量，分別于室溫下放置0、1、2、4、6、8、10、12 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，厚樸酚、和厚樸酚峰面積的RSD分別為1.07%、0.37%（n＝8），表明供試品溶液在室溫下12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品（批號(hào)：111220）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，厚樸酚、和厚樸酚峰面積的RSD分別為1.15%、1.91%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品（批號(hào)：111220）適量，精密稱定，共6份，分別置于10 ml量瓶中，分別加入一定質(zhì)量的厚樸酚、和厚樸酚對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test（n＝6）

2.10 樣品含量測(cè)定

取3批樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 2 Results of content determination of sample（n＝3，mg/g）

3 討論

3.1 提取溶劑和溶劑用量的選擇

本課題組預(yù)試驗(yàn)考察了不同濃度的甲醇、乙醇及氯仿作為提取溶劑對(duì)桂樸微丸中厚樸酚、和厚樸酚提取總量的影響[7-8]。結(jié)果，甲醇的提取率最高且分離效果最好，因此本試驗(yàn)選擇甲醇為提取溶劑。同時(shí)，還考察了甲醇用量（30、50、80 ml）對(duì)上述兩種成分提取率的影響，結(jié)果顯示甲醇為50 ml時(shí)，厚樸酚、和厚樸酚提取完全，因此本試驗(yàn)選擇甲醇的用量為50 ml。

3.2 提取方法和提取時(shí)間的選擇[9-11]

本課題組比較了超聲提取法和熱回流提取法對(duì)厚樸酚、和厚樸酚提取效率的影響。結(jié)果，超聲提取和熱回流提取對(duì)上述兩種成分提取效率無(wú)顯著差別，因超聲提取法操作簡(jiǎn)單，因此本試驗(yàn)采用甲醇超聲提取的方法制備供試品溶液。此外，本試驗(yàn)還考察了超聲提?。?5、30、45、60 min）對(duì)厚樸酚、和厚樸酚提取總量的影響，結(jié)果表明甲醇超聲提取30 min后，延長(zhǎng)提取時(shí)間，提取總量無(wú)明顯差別，即超聲提取30 min可將厚樸酚、和厚樸酚提取完全，因此本試驗(yàn)選擇提取時(shí)間為30 min。

3.3 流動(dòng)相的選擇

本課題組考察了不同比例甲醇-磷酸[12]、甲醇-乙酸[13]、甲醇-水[14]以及乙腈-乙酸[15-16]等作為流動(dòng)相時(shí)兩種成分的分離情況。結(jié)果，以甲醇-水（70∶30，V/V）為流動(dòng)相時(shí)厚樸酚、和厚樸酚的出峰時(shí)間合適、分離度良好、峰形好、無(wú)拖尾，且不受雜質(zhì)干擾，故本試驗(yàn)選擇甲醇-水（70∶30，V/V）為流動(dòng)相。

綜上所述，本方法準(zhǔn)確、靈敏、重復(fù)性好，可用于同時(shí)測(cè)定桂樸微丸中厚樸酚、和厚樸酚的含量。

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Simultaneous Determination of Magnolol and Honokiol in Guipo Pellet by HPLC

ZHAO Chenglei，HUANG Yiping，TIAN Yaozhou，CAO Peng（Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine/Jiangsu Province Academy of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210028，China）

OBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of magnolol and honokiol in Guipo pellet. METHODS：HPLC was performed on the column of Alltima C18with mobile phase of methanol-water（70∶30，V/V）at a flow rate at 1.0 ml/min，detection wavelength was 294 nm，column temperature was 35℃and injection volume was 10μl.RESULTS：The linear range was 0.206 4-2.064μg for magnolol（r＝0.999 8）and 0.088 0-0.880μg for honokiol（r＝0.999 9）；limits of quantitation were 0.41，0.26 μg/ml，detection limits were 0.12，0.075 μg/ml，respectively；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；recoveries were 99.86%-102.11%（RSD＝1.02%，n＝6）and 96.53%-101.74%（RSD＝1.83%，n＝6）.CONCLUSIONS：The method is accurate，sensitive，reproducible，and suitable for the simultaneous determination of magnolol and honokiol in Guipo pellet.

Guipo pellet；Magnolol；Honokiol；HPLC；Content determination

R917

A

1001-0408（2016）33-4695-03

2015-12-30

2016-09-10）

（編輯：劉 柳）

江蘇省科技廳“科技基礎(chǔ)實(shí)施建設(shè)計(jì)劃”專項(xiàng)項(xiàng)目（No.BM2008152-KF03）

＊助理研究員，碩士。研究方向：中藥新劑型與新技術(shù)。電話：025-52362182。E-mail：zhaocl292@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.33.29