HPLC法同時測定風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎片中4種成分的含量Δ

逯雯潔，劉亞蓉，韓曉萍，劉學(xué)良（青海省藥品檢驗檢測院，西寧 810016）

HPLC法同時測定風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎片中4種成分的含量Δ

逯雯潔＊，劉亞蓉，韓曉萍，劉學(xué)良（青海省藥品檢驗檢測院，西寧 810016）

目的：建立同時測定風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎片中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、馬錢子堿、士的寧含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為XTerra-C18，流動相為乙腈-0.01 mol/L庚烷磺酸鈉與0.01 mol/L磷酸二氫鉀的等量混合溶液（用磷酸調(diào)pH至2.8）（梯度洗脫），流速為1.0 ml/min，檢測波長為206 nm（鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿）、260 nm（馬錢子堿和士的寧），柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10μl。結(jié)果：鹽酸偽麻黃堿、鹽酸麻黃堿、馬錢子堿和士的寧檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.916～18.320 0μg/ml（r＝0.999 6）、10.034～200.680 0μg/ml（r＝0.999 7）、8.693～121.700 0μg/ml（r＝0.999 9）、9.696～193.920 0μg/ml（r＝0.999 9）；定量限分別為0.03、0.07、0.04、0.03 ng，檢測限分別為0.01、0.02、0.01、0.01 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為97.30%～99.79%（RSD＝0.96%，n＝6）、95.81%～99.36%（RSD＝0.38%，n＝6）、95.34%～99.93%（RSD＝2.00%，n＝6）、95.59%～99.80%（RSD＝1.76%，n＝6）。結(jié)論：該方法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于同時測定風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎片中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、馬錢子堿、士的寧的含量。

高效液相色譜法；風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎片；鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、馬錢子堿、士的寧；含量測定

風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎片由馬錢子（調(diào)制粉）、麻黃、當(dāng)歸、蒼術(shù)、續(xù)斷、桃仁、紅花、乳香、沒藥、千年健、地楓皮、羌活、地龍、桂枝、穿山甲、木瓜、牛膝等17味中藥材組成，其中馬錢子具有通絡(luò)止痛、散風(fēng)消腫的作用，可用于治療風(fēng)濕頑癖、麻木癱瘓、關(guān)節(jié)腫痛；麻黃具有發(fā)散風(fēng)寒、利水消腫的作用，能祛風(fēng)除濕；蒼術(shù)、羌活、桂枝、木瓜、地楓皮、桃仁、穿山甲等具有活血通絡(luò)、消腫止痛的作用；地龍善于走竄，能祛除隱藏在皮肉、筋膜、關(guān)節(jié)經(jīng)絡(luò)等處的風(fēng)寒濕邪氣；牛膝補肝腎、強筋骨、祛風(fēng)濕、利關(guān)節(jié)、能引藥下行。諸藥合用共奏祛風(fēng)燥濕、活血止痛之功效，可用于風(fēng)濕痹痛、腰腿疼痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等癥的治療，療效較好。該制劑收載于衛(wèi)生部《藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》（第三冊）[1]，該標(biāo)準(zhǔn)中質(zhì)量控制項僅有性狀鑒別和片劑常規(guī)檢查，無相應(yīng)含量測定項[2-8]；且現(xiàn)有相關(guān)文獻(xiàn)[2-3]也僅針對該制劑中的單一成分進(jìn)行含量測定。因此，筆者采用高效液相色譜法（HPLC）建立了同時測定風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎片中君藥馬錢子的主要成分（馬錢子堿和士的寧）、麻黃的主要成分（鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿）[9]含量的方法，以期為完善該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

2695型HPLC儀，包括四元泵、2998光電二極管陣列檢測器、自動進(jìn)樣器、Empower色譜工作站（美國Waters公司）；CPA225D型萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）；XS105DU型十萬分之一電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；Milli-QA型超純水器（美國Millipore公司）；KQ5222V型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：500 W，頻率：40 kHz）。

1.2 藥品與試劑

風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎片（國家評價性市場抽檢：廠家A，編號：S1；廠家B，編號：S2；廠家C，編號：S3；廠家D，編號：S4；廠家E，編號：S5；廠家F，編號：S6；廠家G，編號：S7；廠家H，編號：S8；廠家I，編號：S9；廠家J，編號：S10）；鹽酸偽麻黃堿對照品（批號：171237-200807，純度：99.9%）、鹽酸麻黃堿對照品（批號：171241-201007，純度：99.7%）、馬錢子堿對照品（批號：110706-200505，純度：95.9%）、士的寧對照品（批號：0705-200005，純度：96%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：XTerra C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-0.01 mol/L庚烷磺酸鈉與0.01 mo1/L磷酸二氫鉀的等量混合溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.8）（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：260 nm（馬錢子堿和士的寧）、206 nm（鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿）；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μl。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Conditions of gradient elution

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取鹽酸偽麻黃堿對照品9.17 mg、鹽酸麻黃堿對照品50.32 mg、馬錢子堿對照品63.45 mg、士的寧對照品48.48 mg，分別置于50、25、50、25 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成每1 ml含鹽酸偽麻黃堿183.2μg、鹽酸麻黃堿2 006.8μg、馬錢子堿1 217.0μg、士的寧1 939.2μg的單一對照品貯備液。取上述單一對照品貯備液適量，置于50 ml量瓶中，加甲醇制成每1 ml含鹽酸偽麻黃堿9.16μg、鹽酸麻黃堿100.34μg、馬錢子堿86.93μg、士的寧96.96μg的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品適量，研細(xì)，取樣品粉末約2 g，精密稱定，置于20 ml錐形瓶中，加5%氫氧化鈉溶液約4 ml，混勻，超聲處理2 min；精密加入三氯甲烷25 ml，稱定質(zhì)量，于70℃水浴回流提取120 min，取出，放冷，稱定質(zhì)量，用三氯甲烷補足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按樣品的處方比例和工藝分別制備缺麻黃和馬錢子的陰性樣品，再按“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液A和B。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

精密量取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5；理論板數(shù)均＞3 000。206 nm波長處陰性對照A未出現(xiàn)與鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿對照品保留時間一致的色譜峰，260 nm波長處陰性對照B未出現(xiàn)與馬錢子堿、士的寧對照品保留時間一致的色譜峰。結(jié)果表明，其他成分對測定無干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液0.1、0.2、0.5、1、2、5 ml，分別置于10 ml量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得系列線性溶液。取上述系列線性溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表2。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對照品（206 nm）；B.供試品（206 nm）；C.陰性對照A（206 nm）；D.混合對照品（260 nm）；E.供試品（260 nm）；F.陰性對照B（260 nm）；1.鹽酸偽麻黃堿；2.鹽酸麻黃堿；3.馬錢子堿；4.士的寧Fig lHPLC chromatogramsA.mixed reference substance（206 nm）；B.test sample（206 nm）；C.negative control without A（206 nm）；D.mixed reference substance（260 nm）；E.test sample（260 nm）；F.negative control without B（260 nm）；1.pseudoephedrine hydrochloride；2.ephedrine hydrochloride；3.brucine；4.strychnine

2.5 定量限與檢測限考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，等倍逐步稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10：1時，得定量限（LOQ）；當(dāng)信噪比為3∶1時，得檢測限（LOD），結(jié)果見表3。

2.6 精密度試驗

表2 回歸方程與線性范圍Tab 2 Regression equations and linear ranges

表3 定量限與檢測限測定結(jié)果Tab 3 Determination results of quantitation limits and detection limits

精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，鹽酸偽麻黃堿、鹽酸麻黃堿、馬錢子堿、士的寧峰面積的RSD分別為0.09%、0.09%、0.13%、0.47%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液（編號：S1）適量，分別于室溫下放置2、4、6、8、10 h時按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，鹽酸偽麻黃堿、鹽酸麻黃堿、馬錢子堿、士的寧峰面積的RSD分別為0.29%、0.55%、0.14%、0.09%（n＝5），表明供試品溶液在室溫下10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗

取樣品（編號：S1）適量，研細(xì)，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算樣品平均含量。結(jié)果，鹽酸偽麻黃堿、鹽酸麻黃堿、馬錢子堿、士的寧平均含量分別為0.07、0.08、0.23、0.33 mg/片，RSD分別為1.7%、1.3%、0.7%、1.0%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取樣品（編號：S1）適量，研細(xì)，共6份，分別置于10 ml量瓶中，分別加入一定質(zhì)量的鹽酸偽麻黃堿、鹽酸麻黃堿、馬錢子堿、士的寧對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表4。

2.10 樣品含量測定

取10批樣品適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結(jié)果見表5。

3 討論

3.1 提取方式、提取溶劑和提取時間的選擇

本試驗比較了超聲提取和回流提取兩種不同的提取方式對提取效果的影響。結(jié)果，回流提取的提取效率更高，故選擇回流提取為本試驗的提取方式。此外，還考察了甲醇、乙酸乙酯、三氯甲烷3種提取溶劑。結(jié)果，三氯甲烷的提取效率最高，故選擇三氯甲烷為本試驗的提取溶劑。提取時間考察了10、30、60、90、120、140 min。結(jié)果，回流提取120 min時鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、馬錢子堿、士的寧的提取效果較好，當(dāng)回流提取超過120 min，各成分提取效率差異不大。因此，確定120 min為本試驗的提取時間。

3.2 檢測波長的選擇

表4 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 4 Results of recovery tests（n＝6）

表5 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，mg/片）Tab 5 Determination results of contents in samples（n＝3，mg/tablet）

本試驗采用光電二極管陣列檢測器對鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、馬錢子堿、士的寧進(jìn)行190～400 nm紫外全波長掃描。結(jié)果，4種成分均有很強的末端吸收。其中，馬錢子堿在264 nm波長處、士的寧在256 nm波長處有次強吸收，鹽酸麻黃堿與鹽酸偽麻黃堿分別在263、257 nm波長處有極其微弱的吸收。綜合考慮4種成分的光譜特點及參考相關(guān)文獻(xiàn)[10-12]，本試驗選擇206 nm波長檢測鹽酸偽麻黃堿和鹽酸麻黃堿（僅存在末端強吸收）、260 nm波長檢測馬錢子和士的寧（206 nm波長處吸收值較高，考慮末端吸收存在相應(yīng)檢測弊端，故選擇次強吸收260 nm）。

綜上所述，本方法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于同時測定風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎片中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、馬錢子堿、士的寧的含量。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑：第三冊[S].WS3-B-0560-91：1991.

[2] 胡爽，李曉妮，葛新，等.風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎片中麻黃堿的HPLC測定[J].中草藥，2005，36（1）：62.

[3] 蔡州，李海松，張瀅.HPLC法測定風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎片中士的寧的含量[J].中醫(yī)研究，2006，19（5）：24.

[4] 劉會東，李春英，葉敏，等.風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].藥物分析雜志，2008，28（2）：291.

[5] 吳莉莉，楊飛.風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎片中士的寧含量測定方法的改進(jìn)[J].風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2014，3（11）：34.

[6] 王光函，邸子真，趙玥，等.高效液相色譜法測定芩雙片中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿含量[J].中國藥業(yè)，2014，23（2）：40.

[7] 周軍，張蕾，張茉，等.HPLC法同時測定香連化滯丸中7種成分的含量[J].中國藥房，2016，27（6）：840.

[8] 周玲，孫漢斌，鄧旭坤，等.高效液相色譜法測定3種馬錢屬藥材中士的寧和馬錢子堿的含量[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2012，32（16）：1 301.

[9] 單婷婷，曹紅，邢俊波，等.HPLC法測定麝香接骨膠囊中四種生物堿的含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報，2013，29（5）：450.

[10] 郭青，孫姍，呂霞，等.反相離子對高效液相色譜法測定疏風(fēng)活絡(luò)丸中4種生物堿的含量[J].藥物分析雜志，2009，29（1）：6.

[11] 刁國蘭、張貴華、馬云淑，等.HPLC測定馬錢子及其提取物中馬錢子堿和士的寧含量[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2013，20（12）：51.

[12] 陳衛(wèi)平，王偉影，毛菊華.HPLC法測定追風(fēng)舒筋活血片中馬錢子堿、士的寧的含量[J].中國藥師，2016，19（1）：191.

Simultaneous Setermination of Four Components of RheumatoidArthritis Tablet by HPLC

LU Wenjie，LIU Yarong，HAN Xiaoping，LIU Xueliang（Qinghai Institute for Drug Control，Xining 810016，China）

OBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of ephedrine hydrochloride，pseudoephedrine hydrochloride，brucine，strychnine in Rheumatoid arthritis tablet.METHODS：HPLC was performed on column of XTerra-C18with mobile phase of acetonitrile-mixed solution（pH was adjusted to 2.8 with phosphate acid）composing of 0.01 mol/L sodium heptanesulfonate solution and equal quantity of 0.01 mol/L potassium dihydrogen phosphate solution at a flow rate of 1.0 ml/min，detection wavelength was 206 nm for ephedrine hydrochloride and pseudoephedrine hydrochloride，260 nm for brucine and strychnine，column temperature was 30℃，and injection volume was 10μl.RESULTS：The linear range was 0.916-18.320 0μg/ml for pseudoephedrine hydrochloride（r＝0.999 6），10.034-200.680 0μg/ml for ephedrine hydrochloride（r＝0.999 7），8.693-121.700 0μg/ml for brucine（r＝0.999 9）and 9.696-193.920 0μg/ml for strychnine（r＝0.999 9）；limits of quantification were 0.03，0.07，0.04，0.03 ng，limits of detection were 0.01，0.02，0.01，0.01 ng；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；recoveries were 97.30%-99.79%（RSD＝0.96%，n＝6），95.81%-99.36%（RSD＝0.38%，n＝6），95.34%-99.93%（RSD＝2.00%，n＝6）and 95.59%-99.80%（RSD＝1.76%，n＝6）.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate，and can be used for the simultaneous determination of ephedrine hydrochloride，pseudoephedrine hydrochloride，brucine，strychnine in Rheumatoid arthritis tablet.

HPLC；Rheumatoid arthritis tablet；Ephedrine hydrochloride；Pseudoephedrine hydrochloride；Brucine；Strychnine；Content determination

R927.2

A

1001-0408（2016）33-4692-04

2015-12-13

2016-09-02）

（編輯：劉 柳）

國家藥品計劃抽驗項目（No.2014）

＊主管藥師，碩士。研究方向：中藏藥檢驗分析。電話：0971-8232182。E-mail：luwenjie608@hotmail.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.33.28