蒙藥大梔子超微飲片的質(zhì)量標準研究Δ

白萬富，鞠愛華，張 靜，蔡麗娟，莊志鶴（1.內(nèi)蒙古科技大學包頭醫(yī)學院，內(nèi)蒙古包頭 014040；.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學藥學院，呼和浩特 010059）

蒙藥大梔子超微飲片的質(zhì)量標準研究Δ

白萬富1＊，鞠愛華2#，張 靜2，蔡麗娟2，莊志鶴2（1.內(nèi)蒙古科技大學包頭醫(yī)學院，內(nèi)蒙古包頭 014040；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學藥學院，呼和浩特 010059）

目的：建立蒙藥大梔子超微飲片的質(zhì)量標準。方法：觀察超微飲片的顯微鑒別特征；采用薄層色譜法（TLC）對超微飲片進行定性鑒別；檢測超微飲片水分、灰分、浸出物量；采用高效液相色譜法測定超微飲片中梔子苷的含量：色譜柱為Kromasil C18，流動相為乙腈-水（15∶85，V/V），流速為1.0 ml/min，檢測波長為238 nm，柱溫為30℃，進樣量為10 μl。結(jié)果：超微飲片細胞已完全破壁，粒徑為5～60 μm。超微飲片TLC斑點清晰，分離良好。超微飲片水分為3.89%～5.55%，灰分為3.13%～5.22%，酸不溶性灰分為0.16%～0.80%，浸出物為29.2%～43.4%。梔子苷檢測質(zhì)量濃度線性范圍為1.56～7.82 μg/ml（r＝0.999 9）；精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD＜2.0%；加樣回收率為100.17%～102.04%（RSD＝1.07%，n＝6）。結(jié)論：該研究所建標準可用于蒙藥大梔子超微飲片的質(zhì)量控制。

蒙藥大梔子；超微飲片；梔子苷；質(zhì)量標準

大梔子為茜草科植物長果梔子Gardenia jasminoides Ellis f.Longicarpa Z.W.Xie et M.Okada的干燥成熟果實。為蒙醫(yī)專用特色藥材，蒙藥名為“朱如拉”，收載于1998年版《中華人民共和國藥品標準》蒙藥分冊[1]。該藥具有清血熱、明目、祛“巴達干協(xié)日”、生津、調(diào)元的功效，蒙醫(yī)臨床用于血熱、肝熱、黃疸、急性結(jié)膜炎、腎熱、膀胱熱、血熱頭痛、口渴等證的治療。

大梔子主要含有梔子苷等環(huán)烯醚萜類成分，故本課題組在前期對蒙藥大梔子超微飲片系統(tǒng)規(guī)范研究的基礎上，為了控制其內(nèi)在質(zhì)量，對其從性狀、顯微、薄層色譜（TLC）、含量測定及各項檢查方面進行了深入研究，為建立科學、合理的質(zhì)量標準提供參考。

1 材料

1.1 儀器

SLC-10AVP型高效液相色譜（HPLC）儀，包括紫外可見檢測器、CLASS-VP色譜工作站（日本Shimadzu公司）；BFM-6A型翻滾式倍力粉碎機（濟南倍力粉碎技術(shù)工程有限公司）；AL204型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；3001型干粉激光粒度測定儀、激光粒度分析專家系統(tǒng)（濟南微納儀器有限公司）；KQ-250D型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：400 W，頻率：40 kHz）。

1.2 試劑

梔子苷對照品（批號：110749-200714，純度＞98%）、大梔子對照藥材（批號：120907-2011111）均購自中國食品藥品檢定研究院；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

大梔子藥材采集于廣西等地及市售（見表1），均經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學藥學院鞠愛華教授鑒定為真品。超微飲片為筆者自制，粒徑為5～60 μm。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀鑒別

大梔子超微飲片為黃紅色極細微粉，質(zhì)地細膩而柔滑，氣微，味酸而苦。

2.2 顯微形貌特征

取粉末少許，置載玻片上，滴加蒸餾水少許，加蓋玻片，置顯微鏡下觀察，可見超微飲片細胞已完全破壁，失去大梔子粉末的原有顯微形貌，為細小均勻的顆粒狀，粒徑為5～60 μm，極少數(shù)為75 μm；大梔子原粉可見各種薄壁組織、厚壁組織的碎斷片，或完整的石細胞、纖維等聚集成群或散在，大小懸殊，粒徑為40～380 μm[2-4]，詳見圖1。

表1 大梔子藥材來源Tab 1 Origin of G.jasminoides

圖1 大梔子原粉與超微飲片顯微特征圖（100×）A.原粉；B.超微飲片F(xiàn)ig 1 Microscopic characters of G.jasminoides raw powder and ultramicro decoction piece（100×）A.raw powder；B.ultramicro decoction piece

2.3 TLC鑒別

取本品粉末1.0 g，加甲醇10 ml，超聲處理30 min，濾過，取濾液作為供試品溶液。另取梔子苷對照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為2 mg/ml的對照品溶液。再取大梔子對照藥材1.0 g，研細，按供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。按TLC法[2015年版《中國藥典》（四部）][5]試驗，吸取上述對照品溶液4 μl，供試品溶液和對照藥材溶液各2 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水（5∶5∶1∶1，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于110℃加熱至斑點顯色清晰，置日光燈下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，詳見圖2。

圖2 薄層色譜圖1～4.供試品；5.對照藥材；6.對照品Fig 2 TLC chromatograms1-4.test samples；5.control medicinal herb；6.reference substance

2.4 水分檢查

按2015年版《中國藥典》（四部）水分測定法[5]項下方法檢測樣品水分。結(jié)果，10批樣品水分在3.89%～5.55%范圍內(nèi)（見表2），故擬定大梔子超微飲片水分含量不得過6.0%。

2.5 總灰分檢查

按2015年版《中國藥典》（四部）灰分測定法[5]項下方法檢測樣品總灰分。結(jié)果，10批樣品總灰分在3.13%～5.22%范圍內(nèi)（見表2），故擬定大梔子超微飲片總灰分含量不得過5.5%。

2.6 酸不溶性灰分檢查

按2015年版《中國藥典》（四部）灰分測定法[5]項下方法檢測樣品酸不溶性灰分。結(jié)果，10批樣品酸不溶性灰分在0.16%～0.80%范圍內(nèi)（見表2），故擬定大梔子超微飲片酸不溶性灰分含量不得過1.0%。

2.7 浸出物檢查

按2015年版《中國藥典》（四部）熱浸法[5]項下方法檢測樣品浸出物量。結(jié)果，10批樣品浸出物量在29.2%～43.4%范圍內(nèi)（見表2），故擬定大梔子超微飲片浸出物量不得低于28.0%。

表2 大梔子超微飲片各項目檢測結(jié)果（n＝2）Tab 2 Determination results of G.jasminoides ultramicro decoction piece（n＝2）

2.8 含量測定[6-11]

2.8.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；乙腈-水（15∶85，V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：238 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μl。在上述色譜條件下，理論板數(shù)以梔子苷峰計≥1 500，各成分基線分離良好，分離度＞1.5，詳見圖3。

2.8.2 對照品溶液的制備 取梔子苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成梔子苷質(zhì)量濃度為6 μg/ml的對照品溶液。

2.8.3 供試品溶液的制備 取本品粉末（過4號篩）約0.1 g，精密稱定，置于具塞錐瓶中，加甲醇25 ml，稱定質(zhì)量，超聲處理20 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液2 ml，置于50 ml量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得。

2.8.4 線性關(guān)系考察 取梔子苷對照品11.5 mg，精密稱定，置于25 ml量瓶中，加甲醇定容，搖勻（梔子苷質(zhì)量濃度為460.00 μg/ml）；精密量取上述溶液1.7 ml，置于25 ml量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得梔子苷對照品溶液（梔子苷質(zhì)量濃度為31.28 μg/ml）。分別精密量取上述梔子苷對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml，分別置于10 ml量瓶中，加甲醇定容，制成系列對照品溶液。精密量取上述系列對照品溶液各10 μl，按“2.8.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以梔子苷質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得梔子苷回歸方程為y＝3.173 9×104x+6 675.4（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，梔子苷檢測質(zhì)量濃度線性范圍為1.56～7.82 μg/ml。

圖3 高效液相色譜圖A.供試品；B.對照品；1.梔子苷Fig 3 HPLC chromatogramsA.test sample；B.reference substance；1.geniposide

2.8.5 精密度試驗 取“2.8.2”項下對照品溶液適量，按“2.9.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，梔子苷峰面積的RSD＝0.74%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.8.6 穩(wěn)定性試驗 取“2.8.3”項下供試品溶液（批號：1）適量，分別于室溫下放置0、4、8、12、16、20、24 h時按“2.8.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，梔子苷峰面積的RSD＝1.23%（n＝7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8.7 重復性試驗 精密稱取同一批樣品（批號：1）適量，按“2.8.3”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.8.1”項下色譜條件進樣測定，計算樣品含量。結(jié)果，梔子苷平均含量為5.28%，RSD＝0.95%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.8.8 加樣回收率試驗 取已知含量樣品（批號：1）適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量的梔子苷對照品，按“2.8.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.8.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 3 Results of recovery tests（n＝6）

2.8.9 樣品含量測定 取10批樣品各適量，分別按“2.8.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.8.1”項下色譜條件進樣測定，計算樣品含量，結(jié)果見表2。結(jié)果，不同產(chǎn)地大梔子超微飲片中梔子苷含量差異較大，根據(jù)10批樣品測定結(jié)果，考慮到各地藥材質(zhì)量差異，故規(guī)定梔子苷含量不得低于2.8%。

3 討論

3.1 TLC鑒別的選擇

TLC鑒別試驗中，筆者選擇了大梔子藥材及大梔子特征性成分梔子苷作為對照[12]。通過比較研究，建立了TLC鑒別系統(tǒng)。筆者在預試驗中選用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液制備的硅膠G薄層板，并比較了14個不同展開系統(tǒng)：（1）乙酸乙酯-甲醇-水（6∶1∶0.1，V/V）；（2）乙酸乙酯-甲酸-水（6∶0.5∶0.1，V/V/V）；（3）三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（3∶3∶0.5，V/V/V）；（4）三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（3∶3∶1∶0.1，V/V/V/V）；（5）三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸-水（3∶3∶1∶0.1，V/V/V/V）；（6）三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（1∶3∶0.5，V/V/V）；（7）三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（1∶3∶1，V/V/V）；（8）乙酸乙酯-甲酸-水（4∶1∶0.1，V/V/V）；（9）乙酸乙酯-甲酸（4∶1，V/V）；（10）乙酸乙酯-丙酮-甲酸（5∶5∶1，V/V/V）；（11）三氯甲烷-甲醇（3∶1，V/V），展距8 cm；（12）三氯甲烷-甲醇（3∶1，V/V），展距15 cm；（13）三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸-水（3∶3∶2∶0.1，V/V/V/V）；（14）乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水（5∶5∶1∶1，V/V/V/V），顯色劑為10%硫酸乙醇，于110℃加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果表明，以第14個系統(tǒng)為展開系統(tǒng)時的效果最為理想，分離度良好，斑點清晰，重復性好。

此外，筆者考察了不同溫度（－5、25℃）、不同濕度（25%、75%）以及不同型號的薄層板對TLC鑒別的影響，結(jié)果表明以上條件對試驗均無顯著影響。

3.2 檢測波長的選擇

文獻[12]和2015年版《中國藥典》（一部）[6]中有關(guān)梔子苷的測定波長均為238 nm，經(jīng)在200～700 nm波長范圍內(nèi)進行光譜掃描，證明對照品及供試品均在238 nm波長處有最大吸收。故本試驗選擇238 nm為檢測波長，既可保證樣品測定，又可排除其他組分的干擾。

綜上所述，本研究所建標準可用于蒙藥大梔子超微飲片的質(zhì)量控制。

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Study on the Quality Standard of Ultramicro Decoction Piece of Meng Medicine Gardenia jasminoides

BAI Wanfu1，JU Aihua2，ZHANG Jing2，CAI Lijuan2，ZHUANG Zhihe2（1.Baotou Medical College，Inner Mongolia University of Science&Technology，Inner Mongolia Baotou 014040，China；2.College of Pharmacy，Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010059，China）

OBJECTIVE：To establish the quality standard of ultramicro decoction piece of Meng medicine Gardenia jasminoides. METHODS：Microscopic identification character of the ultramicro decoction piece was observed；TLC was adopted for its qualitative identification；moisture，ash，extract were detected；HPLC was used for the content determination of geniposide：the column was Kromasil C18with mobile phase of acetonitrile-water（15∶85，V/V）at a flow rate of 1.0 ml/min，detection wavelength was 238 nm，column temperature was 30℃，and injection volume was 10 μl.RESULTS：Cell wall was completely broken and the particle sizes were 5-60 μm.TLC spots were clear and well separated.The moisture was 3.89%-5.55%，ash was 3.13%-5.22%，acid-insoluble ash was 0.16%-0.80%，and extract was 29.2%-43.4%.The linear range of geniposide was 1.56-7.82 μg/ml（r＝0.999 9）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；recovery was 100.17%-102.04%（RSD＝1.07%，n＝6）.CONCLUSIONS：The standard can be used for the quality control of ultramicro decoction piece of Meng medicine G.jasminoides.

Gardenia jasminoides；Ultramicro decoction piece；Geniposide；Quality standard

R282.5

A

1001-0408（2016）33-4689-03

2015-12-07

2016-01-31）

（編輯：張 靜）

國家科技支撐計劃課題(No.2012BAI28B01)

＊講師，博士。研究方向：中蒙藥質(zhì)量標準及有效成分分析。電話：0472-7167795。E-mail:bwf007007@sina.com

#通信作者：教授。研究方向：生藥學。電話：0471-6653132。E-mail：hhhtnmyxyjih5511@sina.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.33.27