傳統(tǒng)酵子中產(chǎn)香酵母菌的分離·鑒定及發(fā)酵香氣的檢測

付 娜，王錫昌， 杜 毅， 黃 健

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.愛普香料集團股份有限公司，上海 201809)

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傳統(tǒng)酵子中產(chǎn)香酵母菌的分離·鑒定及發(fā)酵香氣的檢測

付 娜1,2，王錫昌1*， 杜 毅2， 黃 健2

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.愛普香料集團股份有限公司，上海 201809)

[目的]從酵子中篩選出發(fā)酵香氣較好的菌種，使其發(fā)酵產(chǎn)物能增強發(fā)酵面制品風(fēng)味。[方法]通過平板劃線分離法，從傳統(tǒng)酵子中分離出1株酵母樣真菌，對其形態(tài)學(xué)特征及18S rDNA區(qū)序列進行分析，采用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法對該菌株糊化小麥淀粉發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性香氣成分進行檢測。[結(jié)果]被命名為FN001的該菌株屬于Wickerhamomycesanomalus,該酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生的香氣組分主要為酯類、醇類和酸類，包括乙醇、乙酸乙酯、丁醇、丁酸乙酯、乙酸丁酯、丁酸丁酯、苯乙醇、丁酸、乙酸等，其中，乙醇的相對百分含量高達20.33%、乙酸乙酯14.52%、丁醇14.51%、乙酸丁酯13.90%。[結(jié)論]利用此菌株發(fā)酵可為發(fā)酵面制品提供較濃郁的香氣來源。

酵子；異常威克漢姆酵母；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

冷凍面團的應(yīng)用為發(fā)酵面食制品工業(yè)化、標(biāo)準(zhǔn)化、連鎖化生產(chǎn)創(chuàng)造了條件[1]。其中，發(fā)酵劑是必不可少的。酵子是一種多菌發(fā)酵劑，含有大量能夠產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)的微生物，賦予發(fā)酵面制品特殊風(fēng)味[2]，但是酵子的發(fā)酵力較弱，需要消耗較長的發(fā)酵時間。要想在適應(yīng)工業(yè)化的過程中達到豐富發(fā)酵面制品口感的效果，可將酵母發(fā)酵產(chǎn)香過程單獨進行，而菌種的分離與培養(yǎng)會使研究工作更精細(xì)化、具體化。

在研究發(fā)酵產(chǎn)香的微生物中，酵母發(fā)酵產(chǎn)香的報道較為常見。在以往研究中，李銳等[3]研究了不同來源釀酒酵母對柑橘果酒香氣成分的影響，付俊淑等[4]對分離出的酵母菌菌株進行分子鑒定和揮發(fā)性香氣的檢測分析，廖永紅等[5]對產(chǎn)香酵母和其發(fā)酵香氣進行了研究。筆者從酵子中篩選出1種產(chǎn)香能力較好的酵母菌，并以篩選出的酵母菌為研究對象，鑒定其種屬，且在糊化淀粉溶液下進行發(fā)酵，從而得出一種可以改善發(fā)酵面團風(fēng)味的輔料，為冷凍面團制品風(fēng)味改良提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料 傳統(tǒng)酵子，采自河南省商丘市，酵母樣真菌FN001分離于此傳統(tǒng)酵子。7890A氣相色譜儀、5975質(zhì)譜儀，Agilent 公司；固相微萃取裝置及50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭，Supelco公司。

1.2 方法

1.2.1 酵母樣真菌的篩選。分離培養(yǎng)基與純化培養(yǎng)基為PDA和YPD培養(yǎng)基[6]。將酵子碾碎后取0.1 g溶于無菌水中用無菌玻璃棒攪拌均勻并靜置0.5 h，取0.5 mL溶液接種到平板上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)平板上長出菌落時，用接種環(huán)挑取菌落，連續(xù)劃線傳代培養(yǎng)幾次，即得純化的菌株，選出發(fā)酵香氣較濃的菌種。

1.2.2 18S rDNA的測定。將分離出的酵母樣真菌送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行18S rDNA測定。根據(jù)供試菌株的序列，在GenBank數(shù)據(jù)庫中分別進行同源序列搜索。

PCR 反應(yīng)條件：采用三溫度點法，雙鏈DNA在95 ℃下保持30 s變性，再迅速冷卻至55 ℃保持30 s，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至72 ℃并保持40 s，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。循環(huán)次數(shù)為35次。

1.2.3 酵母菌發(fā)酵。將活化好的酵母菌株接種到4%的蔗糖溶液中，接種量為5.1×106個/mL，當(dāng)酵母菌達到5.0×107個/mL時，加入含水量為91%的糊化小麥淀粉溶液中，于28 ℃下通氣培養(yǎng)，72 h發(fā)酵后取樣并進行上機檢測香氣成分。

1.2.4 香氣物質(zhì)提取。精確量取10 mL發(fā)酵液放入15 mL頂空瓶中，萃取溫度為60 ℃，用萃取頭萃取40 min，進樣進行氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析。1.2.5 GC-MS分析條件。色譜柱為DB-5MS(30 m×0.25 mm，0.5 μm)；程序升溫為40 ℃保持1 min，以6 ℃/min升至100 ℃，以3 ℃/min升溫至200 ℃，以10 ℃/min升溫至210 ℃，保持3 min。進樣口溫度250 ℃，檢測器溫度250 ℃，無分流進樣。載氣，高純He(99.999%)；載氣流速1.0 mL/min。

電離方式EI；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃，全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍為40～600 u。

1.2.6 香氣成分的分析。用氣相色譜-質(zhì)譜-計算機聯(lián)用儀進行分析鑒定。分析結(jié)果運用計算機譜庫( NIST08 和WILEY7) 進行初步檢索及資料分析，再結(jié)合文獻進行人工譜圖解析，確認(rèn)香氣物質(zhì)的各化學(xué)成分，并用氣相色譜峰面積歸一化定量計算出各香氣成分的相對含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 FN001菌株的培養(yǎng)和形態(tài)特征 將FN001菌株培養(yǎng)于PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)2 d后，菌落為圓形，乳白色，質(zhì)地均勻，邊緣整齊，表面光滑、濕潤、黏稠、易挑取，并散發(fā)出發(fā)酵香氣，光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞呈球形，進行出芽生殖(圖1)。

注：“o”內(nèi)表示出芽生殖。Note: o indicated gemmation.圖1 酵母菌的菌落形態(tài)與繁殖方式Fig.1 Colony morphology and propagation mode of FN001

2.2 18S rDNA檢測結(jié)果 隨著現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，染色體核型分析、核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)分析(ITS 序列)、核糖體分析和肌動蛋白基因分析等將取代傳統(tǒng)的酵母分類方法[7-9]。該試驗對分離出的酵母真菌FN001進行18S rDNA測定，其PCR擴增膠圖見圖2。

試驗得出FN001真菌的拼接序列：TTTACTACTTGGTAT

AACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTAAAAACCCCG

ACTGTTTGGAAGGGGTGTATTTATTAGATAAAAAATCAATGC

TCTTCTGAGCTCTTTGATGATTCATAATAACTTTTCGAATCGC

ATGACTTCGTGTCGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTGCCCTA

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GGGTAACGGGGAATAAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCC

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AGCATTTGCCAAGGACGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTT

AGGGGATCGAAGATGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCA

TAAACTATGCCGACTAGGGATCGGGTGGTGTTTTTTATATAC

CCACTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGG

GGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACG

GAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGAC

TCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACACAATAAGGAT

TGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATTTTGTGGGTGGTGGTG

CATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGCTTAATTG

CGATAACGAACGAGACCTTAACCTACTAAATAGTGCGATTA

GCTTTTGCTGATTTTGACACTTCTTAGAGGGACTATCGATTTC

AAGTCGATGGAAGTTTGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCC

CTTAGACGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGACGGAGC

CAGCGAGTAATAACCTTGGCCGAGAGGTCTGGGTAATCTTG

TGAAACTCCGTCGTGCTGGGGATAGAGCATTGCAATTATTG

CTCTTCAACGAGGAATTCCTAGTAAGCGCAAGTCATCAGCT

TGCGTTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCG

CTACTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGGCTTCCGGA。

樣本序列比對結(jié)果顯示：異常威克漢姆酵母18S核糖體RNA基因的部分序列；內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1，5.8S核糖體RNA基因；內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2，全序列；和28S核糖體RNA基因的部分序列最大得分2 856，總得分2 856，查詢范圍100%，E值0.0，識別率100%。經(jīng)鑒定該菌株為異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)。

圖2 PCR擴增膠圖Fig.2 Plastic figure of PCR amplification

2.3 發(fā)酵香氣檢測 考慮到工業(yè)應(yīng)用及篩選此菌株的目的，該研究采用4%的蔗糖溶液為活化酵母的溶液，以糊化小麥淀粉為發(fā)酵底物，發(fā)酵過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性成分經(jīng)質(zhì)譜檢測，結(jié)果見表1。

由表1可知，篩選的酵母在糊化小麥淀粉溶液中發(fā)酵72 h后，共檢測出香氣組分22種，其中醇類5種，酯類11種，酸類2種，另外還含有甘油、苧烯、苯乙醛與乙基麥芽酚。

醇類相對百分含量為42.32%，分別是乙醇、丁醇、異戊醇、己醇、苯乙醇。其中乙醇和丁醇的相對百分含量最高，為20.33%、14.50%，且乙醇具有特殊香味，微甘，并伴有刺激的辛辣滋味，而丁醇具有酒味。

酯類相對百分含量為49.39%，分別為乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸異戊酯、γ-丁內(nèi)酯、丁酸丁酯、丁酸異戊酯、丁酸-2-甲基丁酯、水楊酸甲酯、乙酸苯乙酯、3-苯丙酸乙酯。其中乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸丁酯與丁酸丁酯的含量較高，分別為14.52%、10.17%、13.90%和8.06%，乙酸乙酯具有強烈的醚似的氣味，清靈、微帶果香的酒香，丁酸乙酯、丁酸丁酯和乙酸丁酯具有使人愉悅的果香。另外，含量較少的酯類有乙酸異戊酯、γ-丁內(nèi)酯、水楊酸甲酯、乙酸苯乙酯、3-苯丙酸乙酯。酵母在發(fā)酵過程形成的酯類，可以由有機酸(乙酸、乳酸等)與高級醇通過酯化反應(yīng)產(chǎn)生[10]。

酸類相對百分含量為6.50%，分別為乙酸(3.22%)和丁酸(3.28%)，乙酸具有刺激的辛辣味，丁酸帶有難聞的氣味。

除以上三大類物質(zhì)之外，發(fā)酵香氣成分中還含有甘油、苧烯、苯乙醛、乙基麥芽酚，相對百分含量分別為0.53%、0.56%、0.17%和0.53%。其中，苯乙醛具有類似風(fēng)信子的香氣，稀釋后具有水果的甜香氣，乙基麥芽酚的溶液具有甜香味。

在以往研究發(fā)酵產(chǎn)香的微生物中，酵母發(fā)酵產(chǎn)香的報道較為常見，高健等[6]從萵苣中分離出1株產(chǎn)香酵母，該酵母發(fā)酵產(chǎn)生的香氣組分主要是烯類和醇類，其中檸檬烯的相對含量高達20%。該研究從酵子中分離到的FN001菌株發(fā)酵糊化淀粉產(chǎn)生的香氣中，香氣組分主要是醇類與酯類，占總香氣物質(zhì)含量的80%以上。

表1 酵母發(fā)酵72 h后的香氣成分及相對含量

3 結(jié)論與討論

該研究從酵子中分離到1株酵母樣真菌，命名為FN001，結(jié)合18S rDNA序列分析，該菌株被鑒定為Wickerhamomycesanomalus。鑒于菌株培養(yǎng)時所發(fā)出的發(fā)酵香氣及其工業(yè)應(yīng)用，該研究采用GC-MS 手段，檢測了菌株發(fā)酵糊化淀粉產(chǎn)生的各種揮發(fā)性成分。結(jié)果表明，菌株產(chǎn)生的揮發(fā)性成分大多為醇、酸、酯類，且酯類和醇類相對百分含量較高，分別為49.39%和42.32%。因此，該菌株的分離為利用微生物高效生產(chǎn)豐富發(fā)酵面制品風(fēng)味物質(zhì)提供了較好的研究材料。

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Isolation and Identification of Aroma-producing Yeast from Traditional Jiaozi and Detection of Its Fermentation Aroma

FU Na1,2, WANG Xi-chang1*, DU Yi2et al

(1.College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 2.APPLE Flavor & Fragrance Group Co., Ltd., Shanghai 201809)

[Objective] To screen better fermented aroma strains from Jiaozi, and to enhance the flavor of fermented flour products.[Method] A strain of yeast was isolated from Jiaozi by streak plate method.Morphological characteristics and 18S rDNA analysis revealed that it was named as strain FN001.The major volatile compounds produced by the strain were identified by gas chromatography-mass spectrometry, which were esters, alcohols and acids.They included ethanol, ethyl acetate, butanol, ethyl butyrate, butyl acetate, butyl butyrate, phenethyl alcohol, butyrate and acetic acid.Among them, relative content of ethanol was as high as 20.33%, those of ethyl acetate, butanol and butyl acetate were 14.52%, 14.51% and 13.90%, respectively.[Conclusion] Strain FN001 was used to provide a rich aroma of fermented products.

Jiaozi;Wickerhamomycesanomalus; GC-MS

國家自然科學(xué)基金項目( 31271900 )。

付娜(1985- )，女，河南商丘人，博士，從事食品營養(yǎng)與風(fēng)味化學(xué)研究。*通訊作者，教授，博士，從事食品營養(yǎng)與風(fēng)味研究。

2016-09-09

TS 201.3

A

0517-6611(2016)32-0089-03