金絲桃苷對大鼠腦基底動脈的舒張作用及其作用機(jī)制

丁 蘭，陳志武，郭 巖

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◇藥學(xué)研究◇

金絲桃苷對大鼠腦基底動脈的舒張作用及其作用機(jī)制

丁 蘭，陳志武，郭 巖

目的 研究金絲桃苷(Hyp)對大鼠腦基底動脈舒張作用及可能的作用機(jī)制。方法 采用微血管張力測定儀檢測Hyp對血栓素A2受體激動劑(U46619)和KCl預(yù)收縮的大鼠腦基底動脈環(huán)的舒張作用；研究去內(nèi)皮、大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(BKCa)阻斷劑、蛋白激酶C(PKC)激動劑或抑制劑對其血管舒張作用的影響。結(jié)果 Hyp(10-5～10-3mol/L)濃度依賴性地舒張U46619(10-7mol/L)和KCl(60 mmol/L)預(yù)收縮的大鼠腦基底動脈(P<0.001)；去除內(nèi)皮后，Hyp的舒張血管作用減弱(P<0.01)；BKCa阻斷劑(IBTX，10-7mol/L)、PKC激動劑(PMA，3×10-7mol/L)均能抑制Hyp的舒血管作用(P<0.01，P<0.001)；而PKC阻斷劑(Bis-1，3×10-6mol/L)能促進(jìn)Hyp的血管舒張作用(P<0.05)。結(jié)論 Hyp對大鼠腦基底動脈有舒張作用，其作用機(jī)制可能與激活BKCa通道、抑制PKC有關(guān)。

金絲桃苷；基底動脈；血管舒張；大電導(dǎo)鈣激活鉀通道；蛋白激酶C

腦血管疾病是嚴(yán)重威脅人類健康及生存質(zhì)量的疾病，其中缺血性腦血管疾病占75%～85%，尤其近幾年來，趨于年輕化。因此，對缺血性腦損傷病理分子機(jī)制及藥物的研究探索一直是醫(yī)學(xué)界的重要課題與熱點(diǎn)。金絲桃苷(Hyperin，Hyp)系從錦葵科植物黃蜀葵花朵中提取的一種黃酮醇類化合物,研究[1-2]發(fā)現(xiàn)Hyp對抗自由基、拮抗過氧化損傷，減輕腦水腫，降低腦血管阻力、增加腦血流量從而對抗腦缺血。但Hyp對腦血管的舒縮作用及其離子通道機(jī)制的研究并不清楚。大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(large-conductance Ca2+-activated K+channels, BKCa)廣泛分布在哺乳動物各種組織(不含心肌細(xì)胞)中，特別是在血管平滑肌中，BKCa通道是最主要的鉀離子通道之一[3]，并參與血管張力調(diào)節(jié)、細(xì)胞的興奮及代謝調(diào)節(jié)、細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)等過程[4]。因其能夠調(diào)節(jié)血管張力，所以BKCa通道是治療高血壓、糖尿病、冠心病及缺血性腦中風(fēng)等疾病的潛在藥物靶點(diǎn)。有研究[5]顯示蛋白激酶C(protein kinase C, PKC) 在BKCa通道調(diào)節(jié)血管張力過程中有重要意義。該研究以大鼠腦基底動脈為研究對象，采用血管張力測定技術(shù)，探討Hyp對血管張力的影響以及與BKCa通道、PKC的關(guān)系，為臨床應(yīng)用 Hyp治療腦血管疾病提供藥理學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康清潔級SD大鼠，雌雄各半，250～300 g，均由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 Hyp(批號：MUST-15082112)購自成都曼斯特生物科技有限公司，純度98%。二甲基亞砜(DMSO)溶解Hyp現(xiàn)配現(xiàn)用，且DMSO終體積分?jǐn)?shù)低于0.1×10-2對實(shí)驗(yàn)無影響；乙酰膽堿(Ach，批號：064K1209)、DMSO(批號：BCBN8235V)、BKCa通道開放劑NS16199(批號：STBD0427V)、PKC激動劑PMA(批號：SLBH6902V)購自美國Sigma公司；血栓素A2受體激動劑(U46619，批號：5)、BKCa通道阻斷劑IBTX(批號：22A)購自德國TOCRIS公司；PKC阻斷劑Bis-1(批號：D00161187)購自德國Merck Millipore公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 微血管張力測定儀(丹麥DMT公司，620M)；PowerLab生物信號采集系統(tǒng)(澳大利亞AD公司)；電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械廠)；XTS-20連續(xù)變倍體視顯微鏡(北京泰克儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠腦基底動脈的制備 SD大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后斷頭迅速取腦，放入通氧的預(yù)冷(4℃)PSS緩沖液中，PSS緩沖液含(mmol/L):NaCl 130, KCl 4.7, KH2PO41.18, MgSO4·7H2O 1.18, NaHCO315, Glucose 5.5, Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt hydrate 0.03, CaCl21。顯微鏡下仔細(xì)分離大腦基底動脈，去除血管外周的脂肪和結(jié)締組織，將動脈斷離成大約2 mm的環(huán)供使用，將兩根金屬絲(40 μm)穿過血管管腔，固定于浴槽內(nèi)。離體基底動脈環(huán)具體的制備、張力的記錄方法、血管活性和內(nèi)皮完整檢測方法同文獻(xiàn)[6]。

1.2.2 Hyp對U46619或KCl預(yù)收縮大鼠腦基底動脈環(huán)的舒張作用 在正式實(shí)驗(yàn)前用60 mmol/L KCl預(yù)收縮血管，當(dāng)收縮曲線達(dá)到平臺后，用PSS緩沖液沖洗2～3次至基線，15 min后，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)步驟，KCl刺激收縮良好的血管方可進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。在靜息狀態(tài)下向浴槽內(nèi)加入60 mmol/L KCl或者10-7mol/L U46619預(yù)收縮血管，當(dāng)血管收縮達(dá)到平臺后，再向浴槽內(nèi)累積加入Hyp，使其在浴槽內(nèi)的終濃度依次遞增為10-5、10-4.5、10-4、10-3.5、10-3mol/L。制作Hyp的對數(shù)濃度-血管舒張效應(yīng)曲線，觀察Hyp對預(yù)收縮血管環(huán)張力的影響。溶劑對照組用等體積DMSO，對照組不含Hyp，其它與實(shí)驗(yàn)組一致，以排除溶劑對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

1.2.3 去內(nèi)皮對Hyp舒張血管的影響 先用鋼絲在血管腔內(nèi)來回摩擦幾次去除基底動脈環(huán)血管內(nèi)皮[7]，再向浴槽內(nèi)加入10-7mol/L U46619使血管收縮，待血管收縮穩(wěn)定后，依次加入上述濃度的Hyp，觀察去內(nèi)皮對Hyp舒張U46619預(yù)收縮基底動脈作用的影響。

1.2.4 各個阻斷劑或激動劑對Hyp舒張血管的影響 在靜息狀態(tài)下，向浴槽中分別加入BKCa阻斷劑IBTX、PKC抑制劑Bis-1、PKC激動劑PMA孵育血管20 min，使其分別在浴管內(nèi)的終濃度為10-7、3×10-6、3×10-7mol/L。待血管張力平穩(wěn)后，再加入U46619誘發(fā)血管收縮，當(dāng)血管收縮平穩(wěn)后依次加入上述梯度濃度Hyp，觀察各個阻斷劑或激動劑對Hyp舒張作用的影響。

2 結(jié)果

2.1 Hyp對U46619預(yù)收縮大鼠腦基底動脈環(huán)張力的影響 Hyp(10-5～10-3mol/L)濃度依賴性的舒張U46619(10-7mol/L)預(yù)收縮內(nèi)皮完整的基底動脈環(huán)，Hyp的IC50是7.30×10-4mol/L，Imax是(60.68±6.15)%，等體積DMSO溶劑對照組無明顯的舒張作用，Hyp給藥組與溶劑對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=195.0，P<0.001)。見圖1。

圖1 Hyp對U46619預(yù)收縮基底動脈環(huán)的舒張作用

2.2 Hyp對KCl預(yù)收縮大鼠腦基底動脈環(huán)張力的影響 累加濃度的Hyp(10-5～10-3mol/L)對 KCl(60 mmol/L)預(yù)收縮內(nèi)皮完整的血管環(huán)有舒張作用，并呈現(xiàn)濃度依賴性，其IC50為1.28×10-3mol/L，Imax為(44.26±12.95)%，溶劑對照組張力沒有明顯變化，Hyp給藥組的血管舒張作用與溶劑對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=98.8，P<0.001)。見圖2。

2.3 去內(nèi)皮對 Hyp舒張U46619預(yù)收縮大鼠基底動脈環(huán)作用的影響 與去內(nèi)皮溶劑對照組相比，去除內(nèi)皮后Hyp仍能濃度依賴性舒張血管(F=408.8，P<0.01)，其IC50為2.22×10-3mol/L，Imax為(26.66±2.77)%；Hyp在內(nèi)皮完整組與去內(nèi)皮組之間的舒張程度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=50.4，P<0.01)。見圖3。

2.4 BKCa通道阻滯劑IBTX對Hyp舒張血管作用的影響 IBTX(10-7mol/L)預(yù)孵育大鼠腦基底動脈環(huán)后，Hyp對U46619(10-7mol/L)預(yù)收縮血管的舒張作用與無IBTX組(Hyp組)相比明顯減弱，差異有統(tǒng)計意義(F=12.2，P<0.01)，其IC50為1.51×10-3mol/L，Imax是(35.09±15.27)%。見圖4。與溶劑對照組相比，BKCa通道開放劑NS1619(5×10-5mol/L)、Hyp(10-3.5、10-3mol/L)能夠顯著舒張U46619預(yù)收縮的血管環(huán)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.0、80.5、358.6，P<0.001)。NS1619的最大舒張率Imax為(98.10±1.38)%，Hyp(10-3.5、10-3mol/L)的Imax分別是(23.15±6.39)%和(60.14±8.16)%。見圖5。

圖2 Hyp對KCl預(yù)收縮大鼠腦血管環(huán)的舒張作用

圖3 去內(nèi)皮對Hyp舒張血管作用的影響

與內(nèi)皮完整組比較：**P<0.01；與去內(nèi)皮溶劑對照組比較：△△P<0.01

圖4 IBTX對Hyp舒張U46619預(yù)收縮大鼠基底動脈環(huán)作用的影響±s,n=7)

圖5 NS1619對U46619預(yù)收縮血管環(huán)張力的影響與溶劑對照組比較：***P<0.001

2.5 PKC激動劑PMA對Hyp舒血管的影響 PMA(3×10-7mol/L)孵育大鼠腦基底動脈環(huán)后，Hyp對預(yù)收縮血管的舒張作用減弱(F=290.9，P<0.001)，其IC50是3.07×10-3mol/L，Imax從未加激動劑處理組(Hyp組)的(60.68±6.15)%下降到(19.94±4.13)%。見圖6。

圖6 PMA對Hyp介導(dǎo)的大鼠基底動脈環(huán)舒張作用的影響±s,n=7)

2.6 PKC阻滯劑Bis-1對Hyp舒血管的影響 預(yù)先孵育PKC阻斷劑Bis-1(3×10-6mol/L)后， Hyp對U46619(10-7mol/L)預(yù)收縮腦基底動脈環(huán)的舒張作用增強(qiáng)(F=18.1，P<0.05)，其IC50是6.85×10-4mol/L，Imax是(65.73±10.79)%。見圖7。

圖7 Bis-1對Hyp舒張U46619預(yù)收縮基底動脈作用的影響

3 討論

腦基底動脈可以顯著影響腦血管阻力，對微血管壓力起到?jīng)Q定性作用，其功能的紊亂可加重缺血性腦損傷，在維持正常腦血液循環(huán)中擔(dān)任重要角色。本研究利用離體血管舒縮實(shí)驗(yàn)研究Hyp對大鼠腦基底動脈張力的影響，結(jié)果顯示60 mmol/L的KCl和10-7mol/L U46619預(yù)收縮的大鼠腦基底動脈上，Hyp可以產(chǎn)生濃度依賴性的舒張作用，其舒張腦血管作用可能與內(nèi)皮、BKCa通道、PKC有關(guān)。

Hyp作為一種黃酮醇類單體化合物，研究[1,8]顯示其對多種腦損傷模型有較好的保護(hù)作用。血管內(nèi)皮在調(diào)節(jié)血管阻力方面有著重要作用，內(nèi)皮組織釋放血管內(nèi)皮活性物質(zhì)，其最終影響血管平滑肌的電生理和舒縮活動。內(nèi)皮源性血管活性物質(zhì)包括松弛因子和收縮因子。一氧化氮(nitric oxide，NO)和前列腺環(huán)素(prostacyclin, PGI2)是有代表性的內(nèi)皮源性血管舒張因子。實(shí)驗(yàn)表明無論是內(nèi)皮完整還是去內(nèi)皮的血管環(huán)，Hyp均對其有濃度依賴性的舒張作用，提示Hyp的舒張血管作用， 部分是通過血管內(nèi)皮實(shí)現(xiàn)的，另一部分可能直接作用于血管平滑肌。以往研究[9-10]表明Hyp可以明顯地舒張主動脈或腦動脈，其舒張作用部分依賴于內(nèi)皮。研究[11-12]顯示腦基底動脈預(yù)孵育NO合酶抑制劑L-NAME和PGI2合酶抑制劑Indo后，Hyp的舒血管作用有所減弱，但舒張作用依然存在，說明Hyp舒張作用涉及內(nèi)皮源性舒張因子如NO、PGI2。這些結(jié)果均表明Hyp舒張基底動脈是內(nèi)皮依賴性的。另外，血管去除血管內(nèi)皮后，雖然Hyp舒張血管作用明顯減弱，但仍具備一定的舒張功能，提示Hyp對血管平滑肌也有非內(nèi)皮依賴性的舒張作用。

本實(shí)驗(yàn)主要研究Hyp對腦基底動脈環(huán)張力的影響以及與BKCa通道的關(guān)系。在血管平滑肌細(xì)胞中，鉀離子通道開放導(dǎo)致膜超極化，并進(jìn)一步引起電壓依賴性鈣離子通道關(guān)閉，鈣離子內(nèi)流減少，最終血管舒張。其中最為重要的是 BKCa通道，因其電導(dǎo)最大，廣泛分布于血管平滑肌，直接參與血管張力的調(diào)節(jié)，有較大的生理意義。Hyp可誘導(dǎo)大鼠腦血管產(chǎn)生濃度依賴性的舒張作用和血管平滑肌細(xì)胞膜的超極化作用，并且這種Hyp對腦血管的舒張效應(yīng)能夠被非特異性鈣激活鉀通道(KCa)抑制劑TEA所抑制[10-12]，以上結(jié)果說明Hyp的舒腦血管作用與KCa通道的激活有關(guān)，但涉及到具體哪種KCa通道，尚需要進(jìn)一步研究。本研究顯示，BKCa阻斷劑IBTX可抑制Hyp的舒血管作用，說明Hyp舒張腦基底動脈作用可能與其激活BKCa通道有關(guān)。

調(diào)節(jié)腦血管平滑肌收縮的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑包括肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)途徑和蛋白激酶C途徑，PKC可介導(dǎo)血管平滑肌鈣依賴性收縮[13]，尤其腦缺血時，PKC可引起血管平滑肌異常收縮，最終加重缺血損傷，因此PKC在調(diào)節(jié)血管平滑肌舒縮過程中發(fā)揮重要作用。在培養(yǎng)的家兔門靜脈細(xì)胞[14]、豬冠狀動脈平滑肌細(xì)胞[15]上，PKC的激動劑PMA對KCa通道表現(xiàn)出不同程度的阻斷作用，也有研究[16]表明：在鼠的肺動脈平滑肌細(xì)胞上，經(jīng)由不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，PKC可阻斷BKCa通道的開放；也可激活BKCa通道。以上說明PKC在BKCa通道調(diào)節(jié)血管張力過程中具有重要意義。本研究顯示，大鼠腦基底動脈預(yù)孵育PKC激動劑PMA能夠部分抑制Hyp的舒血管作用，而PKC抑制劑Bis-1卻能夠促進(jìn)Hyp舒張腦血管。因此，得出這樣的結(jié)論，PKC參與Hyp舒血管過程，也就是說Hyp通過抑制PKC舒張腦血管，可能是Hyp經(jīng)PKC激活BKCa通道，最終導(dǎo)致血管舒張，其具體機(jī)制尚需許進(jìn)一步探討。

綜上所述，Hyp可濃度依賴性地舒張大鼠腦基底動脈，其舒張機(jī)制可能與內(nèi)皮細(xì)胞、BKCa通道、PKC有關(guān)。

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Vasodilatation and mechanism of hyperin on rat cerebral basilar artery

Ding Lan, Chen Zhiwu, Guo Yan

(DeptofPharmacology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032)

ObjectiveToinvestigatethevasodilatationofhyperin(Hyp)onratcerebralbasilararteryanditsrelatedmechanism.MethodsRatcerebralbasilararteryringswereprecontractedwith9,11-Dideoxy-9a,11a-methanoepoxyprostaglandinF2a(U46619)orKClandthevasodilatationofHyponthearteryringswasrecordedwiththeMultiWireMyographSystemModle,Mechanicalremovaloftheendothelium,Large-conductanceCa2+-activatedK+channels(BKCa)inhibitor.ProteinkinaseC(PKC)activatororinhibitoronthebasilararteryringswereusedtoinvestigatethevasorelaxingmechanismofHyp.ResultsHyp(10-5～10-3mol/L)concentration-dependentlyrelaxedtheendothelium-intactringsprecontractedwithU46619(10-7mol/L)orKCl(60mmol/L)(P<0.001).MechanicalremovaloftheendotheliumproducedasignificantinhibitiononHyp-inducedvasodilatorresponse(P<0.01).Hyp-inducedrelaxationwasattenuateddrasticallybyIBTX(BKCachannelinhibitor, 10-7mol/L)andPMA(PKCactivator, 3×10-7mol/L)(P<0.01,P<0.001),whileBis-1(PKCinhibitor,3×10-6mol/L)promotedtheHyp-inducedvasorelaxation(P<0.05).ConclusionHyprelaxescontractedratbasilarartery.ActivationofBKCaandInhibitionofPKCmaybeinvolvedinunderlyingmechanismofHyp-inducedvasodilatation

hyperin;basilarartery;vasodilatation;BKCachannel;proteinkinaseC

安徽省自然科學(xué)基金(編號：1408085MH171)

安徽醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，合肥 230032

丁 蘭，女，碩士研究生；郭 巖，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail:guoyanzx@126.com

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20161012.1323.016.html

R 285.5；R 329.251；R 962.1；R 972.4；R 743

A

1000-1492(2016)11-1625-05

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.016

2016-06-22接收