運(yùn)動(dòng)介導(dǎo)蛋白質(zhì)泛素化調(diào)控線粒體質(zhì)量控制的機(jī)制探討

孫 易，丁樹哲，季 瀏

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運(yùn)動(dòng)介導(dǎo)蛋白質(zhì)泛素化調(diào)控線粒體質(zhì)量控制的機(jī)制探討

孫 易1,2，丁樹哲1,2，季 瀏1,2

線粒體處于持續(xù)動(dòng)態(tài)變化，線粒體生物發(fā)生、線粒體融合、線粒體分裂和線粒體自噬之間的平衡對維持細(xì)胞功能至關(guān)重要，其中，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)被認(rèn)為在其中發(fā)揮著重要作用。對蛋白質(zhì)泛素化對線粒體質(zhì)量控制作用的最新研究展開闡述。從蛋白質(zhì)泛素化入手，探討其通過調(diào)控線粒體生物發(fā)生、線粒體動(dòng)態(tài)變化和線粒體自噬從而對線粒體質(zhì)量控制產(chǎn)生的影響，并論述相關(guān)分子機(jī)制，著重探討線粒體相關(guān)E3泛素連接酶及泛素特異性蛋白酶的作用，在此基礎(chǔ)上闡明運(yùn)動(dòng)可能通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)對線粒體質(zhì)量控制產(chǎn)生的干預(yù)作用，從而為未來相關(guān)領(lǐng)域研究奠定理論基礎(chǔ)并指明方向。

泛素-蛋白酶體；線粒體；運(yùn)動(dòng)；質(zhì)量控制；泛素化

研究表明，諸多慢性疾病，如肥胖和II型糖尿病的發(fā)生等都伴隨著某種程度的代謝異常?？梢哉f，代謝異常對慢性疾病的發(fā)生和發(fā)展都起到至關(guān)重要的推進(jìn)作用。近年來，代謝類疾病的發(fā)病呈現(xiàn)年輕化的趨勢，在青少年中并不鮮見。自然而然地，線粒體作為細(xì)胞代謝的中心場所再一次引起科研人員的重視。

細(xì)胞及細(xì)胞器在應(yīng)對應(yīng)激刺激時(shí)會分別產(chǎn)生正向適應(yīng)和逆向適應(yīng)兩種變化。正向適應(yīng)主要指細(xì)胞的分裂生長、蛋白質(zhì)的合成以及組織器官功能增強(qiáng)等“生長型”的變化；逆向適應(yīng)則以細(xì)胞凋亡、細(xì)胞器自噬以及蛋白質(zhì)降解等“破壞型”的變化為標(biāo)志。盡管往往伴隨著“破壞型”的變化，然而，逆向適應(yīng)的存在對清除受損細(xì)胞器、維持細(xì)胞質(zhì)量以及控制壽命等方面都不可或缺。

1 蛋白質(zhì)泛素化簡述

在真核細(xì)胞中，為了確保細(xì)胞的生存和正常生長，線粒體介導(dǎo)的一系列生化反應(yīng)必須得到適當(dāng)?shù)恼{(diào)控，清除無用的蛋白質(zhì)是其中一類重要的調(diào)控方式。蛋白質(zhì)的清除是通過依賴于蛋白酶體的降解通路發(fā)生的。蛋白酶體是可以將蛋白消化成氨基酸從而使其得到再利用的一種復(fù)合物。當(dāng)細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境或生存需要發(fā)生變化時(shí)，多余的、無用的或受損的蛋白質(zhì)被識別，隨后被蛋白酶體降解。在降解開始前，待降解的蛋白質(zhì)首先通過添加一個(gè)小蛋白泛素分子作為標(biāo)記，進(jìn)而被呈遞給蛋白酶體，這一標(biāo)記和呈遞過程即是泛素化。

泛素化是在泛素(ubiquitin)的介導(dǎo)下完成的。泛素，顧名思義，是一種在真核細(xì)胞中廣泛存在的，高度保守的蛋白。人體中存在的泛素蛋白包括UbA80、UbA52、UbB以及UbC。泛素蛋白由76個(gè)氨基酸組成，其中約10%為賴氨酸。除了介導(dǎo)泛素化過程以外，泛素還對蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和翻譯后調(diào)控起到一定作用。

泛素化過程參與調(diào)節(jié)一系列細(xì)胞反應(yīng)，如蛋白質(zhì)更新、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞器生物合成和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)維持等。簡單來說，通過小分子泛素對底物蛋白的修飾，待降解的蛋白在E1(ubiquitin-activating，泛素激活酶)、E2(ubiquitin-conjugating，泛素結(jié)合酶)和E3(ubiquitin ligase，泛素連接酶)這3種酶間逐級傳遞，期間添加多個(gè)泛素作為標(biāo)識并最終被26S蛋白酶體降解。這些底物蛋白可以被(多)單泛素化[(poly)mono-ubiquitination]或多泛素化(poly-ubiquitination)。多泛素鏈(poly-ubiquitin)的延伸能發(fā)生在泛素分子7個(gè)賴氨酸殘基中的任意一個(gè)上，且不同賴氨酸位點(diǎn)發(fā)生泛素化可以導(dǎo)致迥異的細(xì)胞效應(yīng)發(fā)生。研究表明，4個(gè)(含)以上泛素分子連接到Lys(K48)位點(diǎn)能驅(qū)動(dòng)蛋白酶體降解，而Lys63(K63)位點(diǎn)的泛素化以及單泛素化過程則能保護(hù)被修飾的底物蛋白免于降解，而是將其轉(zhuǎn)運(yùn)至功能性的細(xì)胞信號通路上，如轉(zhuǎn)運(yùn)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和自噬[35，46]。另外，近期很多研究顯示，“非典型”的泛素鏈，即除K48 和K63以外的連接在眾多生命過程中發(fā)揮廣泛作用[18]。類似地，不同的E2酶也能介導(dǎo)不同的泛素連接類型發(fā)生，如E2酶UBE2N(也稱作Ubc13)與UBE2V組成異源二聚物，能形成K63-linked泛素鏈，但截止目前，其他E2酶選擇哪種連接方式則不甚明了[19，46]。

與有限的E2酶相對應(yīng)，數(shù)百種蛋白分子都可以發(fā)揮E3酶的作用[71]，因此，也是泛素化過程中調(diào)控最為多樣化的一步。E3酶的調(diào)控機(jī)制通常涉及到自泛素化(auto-ubiquitination)。E3酶可以在自身和底物蛋白上組裝成多泛素鏈。

2 運(yùn)動(dòng)、線粒體質(zhì)量控制與蛋白質(zhì)泛素化

線粒體是雙層膜包裹的細(xì)胞器，在真核細(xì)胞中扮演重要角色，它是脂肪酸氧化、三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化等重要生理生化過程發(fā)生的主要場所。線粒體處于持續(xù)動(dòng)態(tài)變化，這對維持很多細(xì)胞功能都至關(guān)重要，如能量產(chǎn)生、代謝和細(xì)胞死亡等。線粒體的融合和分裂被認(rèn)為是調(diào)節(jié)線粒體網(wǎng)絡(luò)健康程度的重要保障。處于應(yīng)激狀態(tài)或受損的線粒體需要被標(biāo)記并選擇性地降解，以防止其與健康的線粒體整合。功能異常的線粒體會影響生物合成通路，使細(xì)胞產(chǎn)生過量的ROS并激活細(xì)胞死亡通路。線粒體功能異常還可能導(dǎo)致細(xì)胞損傷，受損的線粒體能釋放出高濃度的Ca2+以及細(xì)胞色素c，從而觸發(fā)細(xì)胞凋亡。因此，及時(shí)清除功能異常的線粒體對維持細(xì)胞生存十分重要，受損線粒體清除不當(dāng)會導(dǎo)致衰老、代謝疾病和神經(jīng)退化性疾病如帕金森氏癥(Parkinson’s Disease,PD)等的發(fā)生。為了維持線粒體的健康程度，細(xì)胞產(chǎn)生了一種質(zhì)量控制機(jī)制，通過溶酶體隔離并降解受損線粒體，這一過程被稱為線粒體自噬[48]。線粒體生物發(fā)生和線粒體自噬間也需達(dá)到平衡，且線粒體融合和分裂同時(shí)有序進(jìn)行。

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)通過調(diào)節(jié)線粒體蛋白質(zhì)的更新(turnover)和/或蛋白活性來控制線粒體的蛋白質(zhì)平衡，這也是線粒體質(zhì)量控制的一種重要機(jī)制。UPS受損和線粒體功能失調(diào)是衰老的兩個(gè)重要特征，且與衰老相關(guān)的疾病，如阿爾茲海默癥、PD和癌癥等均相關(guān)[26，56，79]。UPS和自噬溶酶體系統(tǒng)通過清除無用和受損的蛋白質(zhì)從而共同為維持細(xì)胞蛋白質(zhì)平衡貢獻(xiàn)力量，減輕受損蛋白造成的細(xì)胞毒性[30]。盡管線粒體本身具備若干處理機(jī)制用于應(yīng)對自由基，然而它們?nèi)猿Ｊ苎趸瘧?yīng)激損傷，因此，需要依賴于UPS移除受損的線粒體蛋白。有效的UPS對于維持線粒體健康至關(guān)重要。反之亦然，過多的ROS生成不僅導(dǎo)致受損蛋白質(zhì)增加，且會氧化和損傷蛋白酶體亞基本身從而降低其催化活性。因此，健康的線粒體對于維持UPS系統(tǒng)有效性也是必備條件。衰老常常伴隨著UPS功能降低，包括蛋白酶體亞基的下調(diào)、酶的錯(cuò)配、底物的過度堆積和ATP水平降低等以及突變線粒體DNA堆積，類似的變化在阿爾茲海默癥和PD中也可見[78]。由于線粒體的主要生化反應(yīng)和關(guān)鍵功能均位于線粒體膜上，因此，已有的多數(shù)有關(guān)泛素化對線粒體蛋白作用的研究都圍繞著膜蛋白展開。

UPS是一個(gè)ATP依賴的過程，主要針對性清除大多數(shù)生存周期較短的蛋白質(zhì)，而運(yùn)動(dòng)被認(rèn)為對UPS的組成成分和整體功能無論在生理還是病理?xiàng)l件下均具有某種程度的調(diào)控作用，因而對于維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)平衡和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用[36]。近幾年，有幾項(xiàng)研究探索了運(yùn)動(dòng)對UPS整體活性的影響。24 h跑臺運(yùn)動(dòng)后，蛋白酶體的β2亞基活性顯著增加，而β1和β5亞基的活性卻未見明顯變化[36]。當(dāng)施以5天跑臺訓(xùn)練干預(yù)，末次運(yùn)動(dòng)后24 h可見蛋白質(zhì)降解率降低，且伴隨蛋白酶體β5亞基活性降低[44]。與此相對，后肢懸掛則導(dǎo)致β5亞基活性增加，而β1和β2亞基活性未發(fā)生變化[37]。8周有氧訓(xùn)練后，小鼠骨骼肌26S蛋白酶體的活性顯著增加，然而被泛素化蛋白的總量無顯著變化[16]。針對心衰病人因UPS過度激活而導(dǎo)致的骨骼肌衰減癥狀，中等強(qiáng)度的有氧運(yùn)動(dòng)亦可通過重鑄蛋白酶體活性使其獲得改善[17]。當(dāng)前已有的有關(guān)運(yùn)動(dòng)對UPS影響的研究大部分局限于探討蛋白酶體活性這一層面，而針對性探索運(yùn)動(dòng)對UPS系統(tǒng)構(gòu)成成分，如E1/E2/E3酶的研究則相對稀缺。已有的研究包括探索大鼠跑臺訓(xùn)練和人被動(dòng)自行車運(yùn)動(dòng)對E2酶的影響，其中，前者未見E2酶發(fā)生變化，而后者可見E2酶活性降低[44，80]。此外，另一個(gè)存在的問題，是已有的運(yùn)動(dòng)-UPS相關(guān)研究多數(shù)只探討到骨骼肌蛋白質(zhì)泛素化的層面，而沒有深入到線粒體這一特定細(xì)胞器。例如，Rnf28和MuRF1是被研究較多的兩種骨骼肌E3酶，其被有氧運(yùn)動(dòng)和抗阻訓(xùn)練的調(diào)控作用均已有探討，然而，線粒體相關(guān)E3酶則較少涉及，此部分將在接下來的段落中重點(diǎn)論述[34，72]。

2.1 運(yùn)動(dòng)、線粒體生物發(fā)生與蛋白質(zhì)泛素化

線粒體生物發(fā)生指細(xì)胞內(nèi)新興線粒體形成的過程。骨骼肌收縮、低溫刺激、熱量限制等應(yīng)激因素均能改變線粒體生物發(fā)生的速率。一系列信號分子亦對線粒體生物發(fā)生起到調(diào)控作用，其中被研究得最廣泛的是PGC-1(過氧化物酶體增殖活化受體 γ共激活因子-1)，它對促進(jìn)線粒體蛋白合成、增加線粒體DNA拷貝數(shù)、增加線粒體數(shù)量和促進(jìn)其功能均起到重要作用。除此之外，NRF1/2(核呼吸因子)、Tfam(線粒體轉(zhuǎn)錄因子A)、Mfn1/2(線粒體融合因子)等也對線粒體生物發(fā)生的信號通路貢獻(xiàn)頗大。運(yùn)動(dòng)被發(fā)現(xiàn)能在老年人群中增加線粒體DNA拷貝數(shù)并促進(jìn)線粒體生物發(fā)生[59]。作為一種核編碼蛋白，Tfam被輸入進(jìn)線粒體，且對線粒體DNA的轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要?；诖笫竽Ｐ偷囊豁?xiàng)研究表明，電刺激誘導(dǎo)肌肉收縮后，Tfam的mRNA表達(dá)在第4天顯著升高，隨之蛋白質(zhì)輸入機(jī)制(PIM)組件蛋白及Tfam蛋白含量增加[32]。此外，PGC-1α敲除小鼠骨骼肌線粒體完整性受到破壞，而自主跑輪運(yùn)動(dòng)可以將受損線粒體修復(fù)[29]。

PGC-1α和PGC-1β在線粒體生物發(fā)生和能量代謝中發(fā)揮重要作用，包括參與調(diào)控呼吸和脂肪酸的β氧化。體外培養(yǎng)細(xì)胞中PGC-1β過表達(dá)會導(dǎo)致線粒體數(shù)量增加和呼吸功能增強(qiáng)[73]。PGC-1β轉(zhuǎn)基因小鼠亦表現(xiàn)出高能量消耗和對肥胖的抵抗作用[40]。一種首先在類風(fēng)濕滑膜細(xì)胞cDNA中發(fā)現(xiàn)的E3泛素連接酶滑膜素(Synoviolin，Syvn1)是哺乳動(dòng)物中Hrd1p/Der3p的類似物，位于線粒體[1]。Fujita等[25]的研究發(fā)現(xiàn)，Syvn1條件性敲除小鼠體重降低，白色脂肪組織減少。且Syvn1能泛素化PGC-1β，Syvn1敲除后PGC-1β靶基因表達(dá)上調(diào)，線粒體數(shù)量增加，呼吸和基礎(chǔ)代謝率亦增加。因此，可以說，Syvn1通過泛素化PGC-1β來調(diào)控線粒體生物發(fā)生和能量代謝。此外，PARIS是新近被發(fā)現(xiàn)的PGC-1α的負(fù)調(diào)節(jié)因子。Parkin能泛素化PARIS并致其降解，從而增強(qiáng)線粒體基因轉(zhuǎn)錄[69]。

2.2 運(yùn)動(dòng)、線粒體動(dòng)態(tài)變化與蛋白質(zhì)泛素化

線粒體動(dòng)態(tài)變化包括線粒體融合和分裂，其中，前者主要由位于線粒體外膜的Mfn1/2(Mitofusin，線粒體融合蛋白)、線粒體膜間隙的Opa1(optic atrophy 1,視神經(jīng)萎縮蛋白1)和線粒體內(nèi)膜的動(dòng)力蛋白相關(guān)GTP酶(dynamin-related GTPase)介導(dǎo)，而后者主要由Drp1(Dynamin related protein 1，動(dòng)態(tài)相關(guān)蛋白)和Fis1(Fission 1，線粒體分裂蛋白)介導(dǎo)。線粒體融合使得受損的線粒體DNA與未受損的線粒體相混合，從而保留線粒體功能[8]。缺少線粒體融合活性的變異小鼠展現(xiàn)出嚴(yán)重的線粒體DNA變異和DNA耗竭，并隨之發(fā)生呼吸缺陷[9]。分裂事件則在細(xì)胞遭受高水平應(yīng)激的時(shí)候有利于細(xì)胞凋亡[50]。線粒體分裂則通過胞漿Drp1轉(zhuǎn)位到線粒體，并與分裂因子Fis1和Mff共同作用來調(diào)控。片段化線粒體，即受到不可逆損傷的線粒體可以通過自噬途徑得到清除[45]。另外，氧化應(yīng)激和營養(yǎng)剝奪等細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)能誘導(dǎo)線粒體一過性地形成高度融合的網(wǎng)絡(luò)形態(tài)。線粒體過融合被認(rèn)為是用以抵抗應(yīng)激刺激的適應(yīng)性結(jié)果，通過高度融合的線粒體維持細(xì)胞活力并改善能量供應(yīng)，此過程已知部分由Drp1磷酸化而致Drp1水平下降介導(dǎo)[76]。然而，是否尚有其他細(xì)胞機(jī)制參與介導(dǎo)線粒體融合則不甚明了。運(yùn)動(dòng)對線粒體動(dòng)態(tài)變化的影響已在諸多實(shí)驗(yàn)中探索過，如急性跑臺運(yùn)動(dòng)后可見Mfn1和Mfn2的mRNA含量以及Mfn1的蛋白水平逐漸降低，且運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后也可見骨骼肌Mfn2含量增加[5，20，24]。有趣的是，除了介導(dǎo)線粒體生物發(fā)生，PGC-1α同樣在運(yùn)動(dòng)后通過誘導(dǎo)Mfn2參與介導(dǎo)線粒體融合[5]。與之相反，急性運(yùn)動(dòng)后Fis1的mRNA和蛋白水平是顯著增加的。

Parkin是一種IBR型的RING域E3酶，是根據(jù)其對PD的致病作用命名的。PD是一種黑質(zhì)多巴能神經(jīng)元及其他神經(jīng)元亞群發(fā)生逐漸退化，導(dǎo)致大范圍的運(yùn)動(dòng)和非運(yùn)動(dòng)殘疾的機(jī)能失調(diào)疾患。Parkin的基因變異是導(dǎo)致常染色體隱性遺傳PD的最常見原因[14]。應(yīng)激狀態(tài)下，Parkin轉(zhuǎn)移到功能受損的線粒體并泛素化Mfns使之被蛋白酶體降解[6]。然而，由于在Parkin缺乏的細(xì)胞中，Mfns的更新同樣受泛素/蛋白酶體系統(tǒng)調(diào)控，因此，可能存在另外一種E3泛素連接酶也具有類似Parkin的調(diào)控作用有待發(fā)現(xiàn)[6]。與此相類似，Parkin在Mfn1/2雙敲除的細(xì)胞中也可以啟動(dòng)線粒體自噬，這表明除了Mfns之外，應(yīng)該還存在其他線粒體外膜相關(guān)蛋白也發(fā)揮著類似Mfns的作用[75]。目前已有研究探討超長時(shí)間跑臺運(yùn)動(dòng)對Parkin的影響，結(jié)果顯示，運(yùn)動(dòng)后，骨骼肌磷酸化Drp1的蛋白水平增加，而Mfn1和Parkin表達(dá)均未見明顯變化。在哺乳動(dòng)物中，MARCH5(也稱作MITOL)，一種線粒體相關(guān)的RING-finger E3酶可以通過泛素化Fis1、Mfn1/2及動(dòng)員Drp1從胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體調(diào)控線粒體形態(tài)[42，64]。Park等[65]的研究顯示，應(yīng)激狀態(tài)下線粒體的適應(yīng)是通過MARCH5作用于乙?；腗fn1實(shí)現(xiàn)的。很可惜，目前還沒有運(yùn)動(dòng)干預(yù)對MARCH5影響的相關(guān)研究。

Omi/HtrA2是一種核編碼的線粒體蛋白酶。當(dāng)位于線粒體膜間隙時(shí)，Omi/HtrA2的表達(dá)對于蛋白質(zhì)質(zhì)量控制和線粒體平衡起到重要作用。在應(yīng)激條件下，Omi/HtrA2能降解E3酶MUL1，而后者對于Mfn2蛋白的表達(dá)和線粒體自噬都有一定調(diào)控作用[12]。MUL1有SUMO連接酶的活性，能夠穩(wěn)定Drp1[4]，且兼具泛素連接酶的活性，能在空間結(jié)構(gòu)上與Mfn結(jié)合并降解Mfn[55]，因此，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中MUL1的高表達(dá)導(dǎo)致線粒體網(wǎng)絡(luò)變小，且呈片段化[52]。Yun等[82]的研究表明，MUL1通路和PINK1/Parkin通路均能通過操控Mfn來調(diào)控線粒體質(zhì)量，且其作用是平行的。除上述E3酶之外，RNF5和Huwe1也被發(fā)現(xiàn)分別通過泛素化Fis1和Mfn2調(diào)控線粒體動(dòng)態(tài)變化及凋亡[49，84]。

2.3 運(yùn)動(dòng)、線粒體自噬與蛋白質(zhì)泛素化

2.3.1 線粒體自噬

線粒體自噬是細(xì)胞自噬的一種。細(xì)胞自噬是一種高度保守的，通過一系列代謝通路降解細(xì)胞器和細(xì)胞器成分的過程，而線粒體自噬是細(xì)胞自噬中相對不保守的一種。在自噬過程中，細(xì)胞膜包覆著將被降解的細(xì)胞器或細(xì)胞器成分，形成一種被稱為自噬體的雙層膜結(jié)構(gòu)，自噬體進(jìn)而與溶酶體融合以完成物質(zhì)降解。在細(xì)胞自噬通路中，幾個(gè)關(guān)鍵的分子為ULK1復(fù)合物(Atg1,Atg13)、PI3K復(fù)合物(Atg14,Vps34,Beclin1)、Atg5、Atg12、Atg16、 LC3和Lamp2等[3]。線粒體自噬與細(xì)胞自噬共享下游通路，兩者不同的地方主要在于線粒體自噬的啟動(dòng)裝置，即能夠單單觸發(fā)線粒體自噬，而非細(xì)胞自噬的條件。已有研究揭示了可能作為“啟動(dòng)裝置”的分子，如與泛素結(jié)合的調(diào)節(jié)蛋白p62/SQSTM1能夠聚積在受損的線粒體上，從而招募受損線粒體至自噬體[27]；又如Nix蛋白位于線粒體上，可以直接與LC3結(jié)合從而形成自噬體。除此之外，PINK1和Parkin兩種蛋白也在近幾年被發(fā)現(xiàn)對線粒體自噬起到重要調(diào)控作用[74]。

2.3.2 運(yùn)動(dòng)、PINK/Parkin與線粒體自噬

在哺乳動(dòng)物中，線粒體的清除主要依賴于PINK1和Parkin介導(dǎo)的通路。PINK1是一種線粒體絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它更新的速度很快，因此，在線粒體膜處于正常極性的狀態(tài)下含量很低[38]。然而，線粒體膜電位的去極化抑制了PINK1的降解，從而導(dǎo)致PINK1在線粒體外膜聚積[58]。Parkin被招募至線粒體，PINK1在絲氨酸位點(diǎn)65(S65)磷酸化Parkin的Ubl域和泛素分子[41]。S65位點(diǎn)的磷酸化促進(jìn)Parkin從胞漿到線粒體的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而使Parkin泛素化包括自己在內(nèi)的一系列線粒體外膜蛋白。因此，可以說，Parkin的E3酶活性對有效通過線粒體自噬途徑清除功能障礙的線粒體至關(guān)重要。以Parkin為代表的E3酶的自泛素化過程可以被去泛素酶(deubiquitinase,DUBs)拮抗，后者能從已被泛素化的E3酶上清除泛素分子，從而保護(hù)E3酶免于遭遇蛋白酶體降解。

運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練一般被認(rèn)為誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。例如，4周自主跑輪運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致骨骼肌自噬蛋白表達(dá)增加[54]。與此相類似，8周游泳訓(xùn)練在骨骼肌中上調(diào)自噬相關(guān)蛋白Bnip3的含量[39]。然而，PINK1和Parkin的mRNA和蛋白含量均未見明顯變化，表明運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)線粒體自噬可能是不依賴于PINK1/Parkin信號通路的。此外，不同運(yùn)動(dòng)干預(yù)方式對PINK1和Parkin在不同組織中的調(diào)控作用也不盡相同。例如，盡管自主跑輪運(yùn)動(dòng)和耐力訓(xùn)練都能提高肝臟中的自噬信號分子Beclin1和Beclin1/Bcl-2比，然而，只有耐力訓(xùn)練能上調(diào)Mfn1、Mfn2、PINK1和Parkin的表達(dá)[31]。另有證據(jù)認(rèn)為，跑臺訓(xùn)練能上調(diào)肝臟Parkin的水平，而持續(xù)同樣時(shí)間的自主跑輪運(yùn)動(dòng)則下調(diào)其水平[68]。在大腦皮質(zhì)中，12周跑臺訓(xùn)練或自主跑輪運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致PINK1含量升高，不過Parkin水平未見改變[57]。

除自身外，Parkin亦能泛素化其他線粒體蛋白，包括Mfn1/2，線粒體蛋白轉(zhuǎn)入受體亞基TOM20、TOM40和TOM70，己糖激酶，Bcl-2家族成員，線粒體Rho GTP酶，Drp1和電壓依賴陰離子選擇通道蛋白1(VDAC1)[27，62]。然而，一項(xiàng)研究結(jié)果顯示，急性抗阻運(yùn)動(dòng)后，盡管線粒體DNA拷貝數(shù)和蛋白含量降低，泛素化VDAC及其與PINK1/Parkin之間的關(guān)聯(lián)并無顯著增加，表明有除VDAC以外的蛋白介導(dǎo)急性運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)線粒體蛋白降解[61]。Parkin的結(jié)構(gòu)顯示，與E2酶UBE2結(jié)合的RING1域表面在正常情況下是處于自抑制狀態(tài)的[77]。當(dāng)線粒體去極化時(shí)，PINK1在S65殘基磷酸化Parkin，導(dǎo)致Parkin的UBl域被釋放[7]。這使得它與不同的E2酶，如UBE2L3或UBE2N產(chǎn)生聯(lián)系。在體外實(shí)驗(yàn)時(shí)，Parkin還對其他一些E2酶，如UBE2D(也稱作UbcH5)產(chǎn)生泛素化活性[43]。從功能上說，K48位點(diǎn)連接的泛素鏈可使Parkin被指派至蛋白酶體并降解[53]，然而，與UBE2N結(jié)合可以導(dǎo)致K63位點(diǎn)連接的泛素鏈在底物上聚集，從而致其自噬降解[63]。Geisler等[28]探索了可能參與調(diào)節(jié)Parkin介導(dǎo)線粒體自噬的一系列UBE2酶，發(fā)現(xiàn)敲除E2酶UBE2N、UBE2L3或UBE2D2/3顯著減少對去極化線粒體的自噬清除，然而并不干擾線粒體PINK1的穩(wěn)定性和Parkin的轉(zhuǎn)位。單獨(dú)敲除UBE2N能特異性防止K63位點(diǎn)泛素化的發(fā)生，然而，多泛素分子和p62依然存在于線粒體上。只有當(dāng)所有UBE2s都被敲除時(shí)，線粒體的多泛素化水平和p62招募會顯著減少。另外，Mfns、TOM20、TOM70、VDAC1和Parkin的泛素化水平也相應(yīng)降低。因此，可以說，UBE2N、UBE2L3和UBE2D2/3協(xié)同完成對Parkin介導(dǎo)線粒體自噬的貢獻(xiàn)作用。

除Parkin外，自噬受體蛋白p62和Beclin1同樣對線粒體自噬的發(fā)生至關(guān)重要。p62能與線粒體外膜上的多泛素化蛋白結(jié)合并介導(dǎo)被標(biāo)記的線粒體通過自噬體吞噬[27]。而自噬蛋白Beclin1則在自噬體的形成和成熟中扮演重要作用。Beclin1可以與Parkin結(jié)合，調(diào)控Parkin轉(zhuǎn)位到線粒體。Beclin1在兩個(gè)水平上控制線粒體自噬，在自噬起始階段線粒體去極化時(shí)控制Parkin轉(zhuǎn)位，同時(shí)，自噬體的形成同樣需要Beclin1[11]。

2.3.3 MUL1與線粒體自噬

線粒體是一種對自由基和細(xì)胞內(nèi)生物能量高度敏感的細(xì)胞器，在探測到兩者變化時(shí)能充當(dāng)哨兵角色，并調(diào)控HIF1α和AMPK等信號通路，而后兩者為自噬的關(guān)鍵調(diào)控因子[67，83]。AMPK是一種保守的細(xì)胞和線粒體能量感受器，它能磷酸化ULK1，而后者是啟動(dòng)細(xì)胞自噬和線粒體自噬的關(guān)鍵調(diào)控分子[23]。在細(xì)胞遭受中等程度氧化應(yīng)激時(shí)，線粒體外膜蛋白質(zhì)發(fā)生泛素化，并往待蛋白酶體降解的途徑發(fā)展；而在慢性和嚴(yán)重應(yīng)激的刺激下，線粒體膜電位遭受破壞，繼而走向選擇性線粒體自噬的道路[60]。Li等[51]的研究表明，ULK1亦是MUL1的底物，MUL1以依賴于ATG5和ULK1的方式調(diào)控亞硒酸鹽誘導(dǎo)的線粒體自噬，在亞硒酸鹽干預(yù)下，ULK1部分轉(zhuǎn)位到線粒體并與MUL1發(fā)生關(guān)聯(lián)。

3 運(yùn)動(dòng)、USPs與線粒體質(zhì)量控制

人類蛋白質(zhì)組包含約80種有功能的DUBs，隸屬于5個(gè)亞類，其中最大的一個(gè)亞類是泛素特異性蛋白酶(ubiquitin-specific protease,USP)家族，然而，目前有關(guān)USP的研究還較少，與運(yùn)動(dòng)或線粒體相關(guān)的探索更是稀少[47]。已有的運(yùn)動(dòng)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)包括以下幾項(xiàng)：比目魚肌在經(jīng)受持續(xù)拉伸后可見USP28基因表達(dá)增加[70]；后肢懸掛后可見小鼠USP28的mRNA表達(dá)增加，而USP19的mRNA表達(dá)未見顯著變化[37]；高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)則能顯著上調(diào)USP9x和USP10[81]。

USP15是一種廣泛在大腦和其他器官中表達(dá)的DUB，它能逆轉(zhuǎn)Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬，如PD病人的成纖維細(xì)胞中可見因PARK2基因變異而導(dǎo)致的線粒體自噬缺陷和Parkin水平降低，敲除USP15則可以緩解這種變化[13]。事實(shí)上，USP15既不會影響Parkin的泛素化狀態(tài)，也不會影響Parkin向線粒體的轉(zhuǎn)移，只是能夠抵消Parkin介導(dǎo)的線粒體泛素化過程。因此，可以說，USP15是一種Parkin的拮抗劑，抑制USP15可能是針對因?yàn)镻arkin水平降低而導(dǎo)致PD疾患的有效治療辦法。在一項(xiàng)基于芯片分析技術(shù)對不同種族人群的比較研究發(fā)現(xiàn)，12周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以在“高反應(yīng)人群中”顯著增加USP15的mRNA表達(dá)[66]。

除USP15外，最新的研究發(fā)現(xiàn)，USP30和Parkin共同參與對線粒體自噬的調(diào)節(jié)[18]。USP30是已知的唯一一種與線粒體直接相連的DUB。當(dāng)線粒體受損時(shí)，在Lys6、Lys11和Lys63位點(diǎn)形成的泛素鏈在線粒體上以Parkin依賴的方式被合成，而USP30則會優(yōu)先水解Lys6和Lys11位點(diǎn)的泛素鏈，因此，與Parkin形成了一個(gè)偶聯(lián)系統(tǒng)，其中，前者抑制線粒體自噬而后者則起到促進(jìn)作用[18]。不過這并不排除其他USP和其他位點(diǎn)泛素鏈在線粒體自噬中的作用。

除Parkin外，研究發(fā)現(xiàn)了12個(gè)與線粒體相關(guān)的蛋白質(zhì)能夠被外源性表達(dá)的USP30高度去泛素化，MUL1、VDAC1、VDAC2、VDAC3和MTX1均處于影響線粒體質(zhì)量控制和線粒體形態(tài)的信號通路中[2，10，55]，其中，最顯著被USP30去泛素化的是MUL1(也稱作MULAN或MAPL)。MUL1是一種線粒體E3酶，它與幾種線粒體相關(guān)疾病，如肌肉萎縮和PD等有關(guān)。MUL1的酶和生化功能都與Parkin很相似，這表明USP30隸屬于一個(gè)連接酶和去泛素酶構(gòu)成的龐大網(wǎng)絡(luò)中，共同維持線粒體穩(wěn)態(tài)。Cunningham等[18]提出了一個(gè)由USP30及其底物構(gòu)成的線粒體健康狀態(tài)監(jiān)控模型。他們提出，USP30的監(jiān)控作用阻止了泛素鏈在線粒體蛋白上的異常堆積，從而防止在線粒體健康的情況下發(fā)生異常的線粒體自噬。與此相類似，位于蛋白酶體上的DUB同樣可以防止底物蛋白質(zhì)在不應(yīng)被泛素化降解時(shí)發(fā)生誤降解[15，33]。當(dāng)線粒體發(fā)生損傷時(shí)，Parkin被招募至線粒體膜并被高度激活，這使得泛素-去泛素平衡移向泛素鏈的堆積，并最終激活線粒體自噬通路。當(dāng)Parkin發(fā)生病態(tài)變異，或因某種原因?qū)е翽arkin活性降低時(shí)，E3酶不能與USP30的去泛素化能力相抗?fàn)?，從而?dǎo)致線粒體自噬通路不被激活。這些受損的卻未被標(biāo)記的細(xì)胞器會污染線粒體網(wǎng)絡(luò)，從而導(dǎo)致疾病狀態(tài)。

表1 主要線粒體相關(guān)E3泛素連接酶及去泛素酶一覽表

在以往的研究中，并沒有證據(jù)表明USP8與線粒體質(zhì)量控制有關(guān)。然而，Durcan等[21]于2014年最新的研究發(fā)現(xiàn)，USP8對于Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬至關(guān)重要。Parkin主要在自身形成非經(jīng)典的K6位點(diǎn)連接的泛素聚集體，這對招募Parkin至去極化的線粒體，及隨后的線粒體自噬是必備的步驟，而USP8能優(yōu)先地從Parkin清除K6位點(diǎn)泛素鏈[21，22]。有趣的是，當(dāng)USP8被沉默時(shí)，K6位點(diǎn)形成的泛素聚集體會在Parkin上持續(xù)表達(dá)，這將干擾Parkin與PINK1和磷酸化泛素的結(jié)合，使得Parkin轉(zhuǎn)位到受損線粒體的過程產(chǎn)生時(shí)間延遲。另外，Parkin與p62、LC3或其他自噬受體的結(jié)合也會受阻，因而不能完成線粒體自噬全程[22]。

4 小結(jié)與展望

作為降解、清除受損蛋白質(zhì)的主要通路，UPS參與調(diào)節(jié)一系列細(xì)胞過程，其中，不同干預(yù)措施對多樣化的E3泛素酶及USPs的調(diào)控一直是相關(guān)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。近年來的研究表明，線粒體的形態(tài)和功能亦直接受到UPS的調(diào)控，后者通過參與線粒體生物發(fā)生、線粒體動(dòng)態(tài)變化和線粒體自噬等過程移除受損的線粒體蛋白質(zhì)，維持線粒體質(zhì)量，同時(shí)對阿爾茲海默癥、PD和癌癥等的發(fā)生發(fā)展也存在干預(yù)作用。較新的研究顯示，運(yùn)動(dòng)干預(yù)能改變UPS組分的激活程度，在生理及病理?xiàng)l件下均對UPS的功能發(fā)揮調(diào)控作用，從而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和胞內(nèi)蛋白質(zhì)平衡。然而，截止目前，特定性探索運(yùn)動(dòng)干預(yù)介導(dǎo)蛋白質(zhì)泛素化調(diào)控線粒體質(zhì)量控制的機(jī)制性研究還很缺乏。在未來的研究中，以下幾方面的課題探索將填補(bǔ)本領(lǐng)域的空白，具有理論探討意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值：

1)擬探討運(yùn)動(dòng)對線粒體自噬相關(guān)因子Parkin和MUL1的調(diào)控作用，以期在動(dòng)物整體層面上闡明其在線粒體質(zhì)量控制中可能發(fā)揮的平行作用；2)擬探討不同運(yùn)動(dòng)方式對線粒體動(dòng)態(tài)變化相關(guān)因子MARCH5的干預(yù)作用，并闡述其通過修飾Mfn1、Mfn2、Drp1和Fis1對線粒體融合和分裂的調(diào)控作用及機(jī)制；3)擬探討線粒體生物發(fā)生及線粒體自噬相關(guān)信號通路Parkin/PARIS/PGC-1α在運(yùn)動(dòng)介導(dǎo)線粒體效應(yīng)中的作用機(jī)制；4)擬探討不同運(yùn)動(dòng)方式對線粒體相關(guān)去泛素酶，如USP8、USP15和USP30的干預(yù)作用，并探索其他潛在USPs對線粒體相關(guān)E3酶的拮抗作用；5)擬探索UPS在運(yùn)動(dòng)改善肥胖、II型糖尿病和PD中的介導(dǎo)作用。

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The Mechanism of Exercise-Induced Protein Ubiquitination Regulating Mitochondrial Quality Control

SUN Yi1,2，DING Shu-zhe1,2，JI Liu1,2

Mitochondria are under dynamic changes.The balance between mitochondria biogenesis,mitochondria fusion,mitochondria fission and mitophagy is vital to maintenance of cellular functions,among which ubiquitin-proteasome system is considered to play a key role.In this review,we aim to discuss the effect of protein ubiquitination on mitochondrial quality control via regulating mitochondrial biogenesis,mitochondrial dynamics and mitophagy.Relevant molecular mechanism,especially the roles of E3 ligases and ubiquitin-specific proteases will be elaborated.In addition,ubiquitination mediated effect of exercise on mitochondrial quality control will be explored,so as to construct theoretic foundation and provide direction for future researches in this area.

ubiquitin-proteasomesystem；mitochondria；exercise；qualitycontrol；ubiquitination

1000-677X(2016)10-0048-08

10.16469/j.css.201610007

2015-12-24；

2016-09-01

中國博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014M561430)；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31600967)；青少年P(guān)OWER工程協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目(44801400)；《青少年健康評價(jià)與運(yùn)動(dòng)干預(yù)》教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)項(xiàng)目(40500-541235-14203/004)。

孫易(1985-)，女，黑龍江哈爾濱人，講師，博士，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)對肥胖和II型糖尿病的干預(yù)機(jī)制，E-mail：ysun@tyxx.ecnu.edu.cn；丁樹哲(1963-)，男，黑龍江哈爾濱人，教授，博士，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)榫€粒體運(yùn)動(dòng)適應(yīng)與信號調(diào)控，E-mail：szding@tyxx.ecnu.edu.cn；季瀏(1961-)，男，江蘇泰興人，教授，博士，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)榍嗌倌牦w質(zhì)健康評價(jià)、體育課程與教學(xué)、體育心理學(xué)，E-mail：lji@tyxx.ecnu.edu.cn。

1. 華東師范大學(xué) 青少年健康評價(jià)與運(yùn)動(dòng)干預(yù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200241；2. 華東師范大學(xué) 體育與健康學(xué)院，上海 200241 1. Key Laboratory of Adolescent Health Assessment and Exercise Intervention of Ministry of Education,East China Normal University,Shanghai 200241, China；2. School of Physical Education and Health Care,East China Normal University,Shanghai 200241, China.

G804.5

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