不同運動方式上調(diào)FSTL1蛋白表達誘導心梗心臟血管新生

席 悅，蔡夢昕，田振軍

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不同運動方式上調(diào)FSTL1蛋白表達誘導心梗心臟血管新生

席 悅，蔡夢昕，田振軍

目的：探討不同運動方式對內(nèi)源性卵泡抑素樣蛋白1(FSTL1) 誘導心梗心臟血管新生的作用。方法：雄性SD大鼠隨機分為假心梗組(S)、心梗安靜組(MI)、心梗+間歇運動組(ME)、心梗+抗阻訓練組(MR) 和心梗+機械振動組(MV)，每組12只。左冠狀動脈前降支結(jié)扎制備心梗模型。ME組、MR組和MV組分別采用小動物跑臺、負重爬梯和小動物振動臺3種方式進行為期4周的訓練。訓練結(jié)束后采用免疫熒光染色法定位FSTL1蛋白表達并進行新生血管觀察與分析， RT-qPCR和WB法檢測心肌FSTL1基因與蛋白表達，血流動力學法評定心功能，Masson染色觀察分析心肌膠原面積百分比(CVF)。結(jié)果：心梗導致心肌FSTL1蛋白表達上調(diào)，且出現(xiàn)內(nèi)皮細胞增殖和血管新生，心肌fstl1基因表達不受心梗病理條件或運動方式的影響。不同運動方式均可進一步提高心肌FSTL1蛋白表達，顯著促進內(nèi)皮細胞增殖和血管新生，抗阻訓練效果最顯著，間歇運動次之，而機械振動效果最弱。不同運動方式均可降低CVF，有效改善心功能。結(jié)論：不同運動方式可有效刺激心梗心臟內(nèi)源性FSTL1表達增加，促進心肌血管新生，降低心梗心肌纖維化，改善心功能，其中，抗阻訓練的效果較間歇運動和機械振動更顯著。探索不同運動方式對心梗心臟保護效應(yīng)的差異，將為心梗心臟的運動康復機制研究和運動處方篩選與制定提供實驗依據(jù)。

心肌梗死；運動；卵泡抑素樣蛋白1；血管再生

心肌梗死(Myocardial infarction，MI)是心力衰竭致死的重要原因。目前，關(guān)于心梗心臟病理機制及藥物干預已有諸多文獻報道[15,14]。除藥物干預外，運動具有改善缺血心臟損傷和加速其恢復的作用[44,41,19]，但不同運動方式存在差別[4,39]，其生物醫(yī)學機制也尚未完全闡明。文獻證實，運動可降低心梗心肌細胞凋亡和改善氧化應(yīng)激及代謝功能[20]。間歇運動可有效降低梗死心臟病理性重塑[18]，增加最大攝氧量[24]并改善慢性心力衰竭(CHF)心功能和生活質(zhì)量[27]；抗阻訓練可顯著增加血管和心臟的自律調(diào)節(jié)[11]，增加心?；颊咦畲髷z氧量并降低左室舒張和收縮末壓[22]；機械振動則可加速血管的再灌注[21]，誘導血管再生調(diào)節(jié)因子如VEGF、MMP-2/9的循環(huán)水平[38]。但不同運動方式對心梗心臟血管新生作用是否有差異，缺少文獻報道。

有文獻報道，心肌可分泌促血管再生的卵泡抑素樣蛋白1(FSTL1)[29]，并作為慢性收縮性心衰左室重塑的標志物[6]，可降低壓力超負荷導致的病理性心臟肥大[36]，并發(fā)現(xiàn)具有促進細胞增殖與分化、血管新生、創(chuàng)傷修復和抑制炎癥反應(yīng)等多種生物學效應(yīng)[9]。心肌組織缺血缺氧可誘導FSTL1表達，促進血管代償性重建[30]；但運動干預能否上調(diào)心梗心肌FSTL1的表達，且是否存在運動方式差異，缺少文獻報道。本文采用間歇運動、抗阻訓練和機械振動等方式干預，探討心肌FSTL1表征、內(nèi)皮細胞增殖、心肌微血管重構(gòu)與心梗心臟形態(tài)及功能的影響，為心梗患者臨床康復手段與方法篩選提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

主要儀器：Powerlab 8/30生理信號采集系統(tǒng)，BM-II型病理組織包埋機，LEICA-RM2126切片機，YT-6C生物組織攤烤片機，核酸/蛋白定量儀，Bio-Rad電泳儀和電泳槽，凝膠成像系統(tǒng)，BX51奧林巴斯光學顯微鏡，Nikon熒光顯微鏡，Bio-Rad RT-qPCR儀等。

主要試劑：TRIzol和BCA蛋白定量試劑盒(西安晶彩)，TAKARA-RNA定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TAKARA)，TAKARA-PCR試劑盒(日本TAKARA)，PCR引物(上海生工)，Tween 20、兔多克隆抗體FSTL1(美國GeneTex)，vWF(美國Merck Millipore)，小鼠單克隆抗體PCNA(美國Cell Signaling)，CD31(美國GeneTex)，GAPDH(美國Bioworld)等。

1.2 心梗模型制備與動物分組

Sprague-Dawley大鼠60只[SPF級，購于西安交通大學實驗動物管理中心，動物合格證號：SCXK(陜)2012-003]，體重180～220 g，分籠飼養(yǎng)。適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，大鼠用戊巴比妥鈉(30 mg/kg體重)進行麻醉。利用先前已建立的冠狀動脈左前降支結(jié)扎法[25]制備心梗大鼠模型：利用小動物呼吸機輔助呼吸(60次/min，潮氣量16 ml，呼吸比2∶1)，連接心電圖。開胸，用6.0縫合線沿左心耳和肺動脈圓錐交界下緣2 mm處進針結(jié)扎，觀察到心電圖ST段抬高或T波倒置，且心肌顏色變淺或變白作為建模成功的標準，逐層縫合關(guān)胸。大鼠心梗術(shù)后隨機分為心梗安靜組(MI)、心梗+間歇運動組(ME)、心梗+抗阻訓練組(MR)、心梗+機械振動組(MV)，每組12只。假心梗對照組(S，12只)經(jīng)歷上述手術(shù)過程但不結(jié)扎。

1.3 運動方案

1.4 血流動力學檢測

4周訓練后，大鼠以上述方法進行麻醉。自右頸總動脈逆向插入壓力傳感器導管進入左心室腔，利用Powerlab 8/30(ML 870，澳大利亞)生理信號采集系統(tǒng)記錄心室內(nèi)各項血流動力學參數(shù)，如左室收縮壓(LVSP，mmHg)、左室舒張末壓(LVEDP，mmHg)、心率(HR，bpm)、正負最大左室壓力變化一階導數(shù)(±dP/dt max，mmHg/s)、左室壓力衰減時間常數(shù)(Tau，ms)等，以評價心功能。所有大鼠均在血流動力學檢測后處死并取樣。

1.5 組織學Masson染色

心臟樣本用預冷的4%多聚甲醛固定24～48 h。濃度梯度乙醇脫水，石蠟包埋后切片(5 μm)以用來進行組織病理學檢查。為了評價心肌纖維化程度，心臟組織切片進行Masson染色，光學顯微鏡觀察、拍攝，并利用Image-Pro Plus軟件進行分析并計算心肌膠原面積百分比(CVF%)。

1.6 免疫組織化學染色

FSTL1與CD31雙標：切片脫蠟至水，抗原修復后用兔多克隆抗體FSTL1(1∶100)及小鼠單克隆抗體CD31(1∶25)或兔多克隆抗體vWF(1∶50)及小鼠單克隆抗體PCNA(1∶50)共同孵育，4℃過夜。TRITC結(jié)合的山羊抗兔IgG(1∶100)及FITC結(jié)合的山羊抗小鼠IgG(1∶100)或TRITC結(jié)合的山羊抗小鼠IgG(1∶100)及FITC結(jié)合的山羊抗兔IgG(1∶100)共同作為二抗進行標記。細胞核利用DAPI染色(1∶800)。光學顯微鏡觀察、拍攝，利用Image-Pro Plus軟件進行圖像分析。

1.7 Western blot

取左室梗死邊緣區(qū)(5 mm)組織進行勻漿?？偟鞍滋崛〖癝DS-PAGE 方法依照先前研究進行[3]。FSTL1稀釋濃度為1∶1 000，GAPDH稀釋濃度為1∶10 000。利用辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5 000，美國Jackson ImmunoResearch)進行孵育后，蛋白條帶利用增強化學發(fā)光底物(ECL)進行發(fā)光。利用Image Processing and Analysis in Java 1.48軟件進行定量分析。

1.8 RT-qPCR

TRIzol提取左室梗死邊緣區(qū)總RNA。取3 μg總RNA經(jīng)TAKARA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA合成。利用TAKARA PCR試劑盒及其說明書進行CFX96TMReal-Time PCR系統(tǒng)檢測。每個樣本設(shè)立3組獨立重復。引物序列：fstl1-F:5′-GCCTCTCTCTCCTCCTCTCTCT-3′；fstl1-R:5′-GCATAGGGTTTGTTGGTTT GTT-3′；gapdh-F:5′-CAGTGCCAGCCTCGTCTCAT-3′；gapdh-R:5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。用比較Ct法(2-△△Ct)進行基因表達定量，數(shù)據(jù)利用大鼠GAPDH 的mRNA水平進行標準化。1.9 數(shù)據(jù)處理

免疫熒光和Masson染色經(jīng)顯微鏡觀察并采集圖片，免疫熒光染色的平均光密度值和Masson染色的CVF%數(shù)據(jù)用Image-Pro Plus 6.0軟件進行計算。利用Image Processing and Analysis in Java 1.48軟件采集Western blot數(shù)據(jù)，RT-qPCR結(jié)果采用Bio-Rad CFX manager軟件分析。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準誤表示，直方圖和散點圖利用GraphPad Prism 6.01軟件作圖。采用one-way ANOVA方差分析，SPSS 19.0進行顯著性檢驗，顯著性水平選擇P<0.05和P<0.01。

2 實驗結(jié)果

2.1 不同運動方式對心梗心臟FSTL1表征的影響

免疫熒光染色結(jié)果顯示，F(xiàn)STL1呈紅色，細胞核DAPI呈藍色，F(xiàn)STL1表達位于心肌細胞質(zhì)。陽性表達的平均光密度值統(tǒng)計結(jié)果顯示，MI組與S組比較，F(xiàn)STL1+表達顯著增加(P<0.01)；ME組和MR組與MI組比較，F(xiàn)STL1+表達均顯著增加(P<0.01)，MR組更顯著。MV組較ME組和MR組顯著減少(P<0.01)。

RT-qPCR結(jié)果顯示，各組fstl1 mRNA表達均呈降低趨勢，組間無顯著性差異。Western blot結(jié)果與免疫熒光染色統(tǒng)計結(jié)果相一致。表明，心梗心臟FSTL1表達出現(xiàn)代償性顯著升高，不同方式運動均可進一步上調(diào)FSTL1蛋白表達，不同運動方式間存在顯著性差異，其效果為抗阻訓練>間歇運動>機械振動(圖1，圖2)。

圖1 心肌FSTL1表征的免疫熒光觀察結(jié)果(×200)

圖2 心肌FSTL1的IOD值統(tǒng)計與FSTL1基因及蛋白定量結(jié)果

2.2 不同運動方式對心梗心肌血管新生的影響

vWF和CD31為內(nèi)皮細胞標記物，PCNA為細胞增殖核抗原，雙色熒光標記可反映血管新生。免疫熒光染色結(jié)果顯示，vWF和CD31呈綠色，F(xiàn)STL1和PCNA呈紅色。MI組與S組比較，vWF+/PCNA+細胞數(shù)量和CD31+/FSTL1+血管平均數(shù)量顯著增加(P<0.05)。ME組、MR組和MV組與MI組比較，vWF+/PCNA+細胞數(shù)量均顯著增加(P<0.01：ME vs.MI、MR vs.MI；P<0.05：MV vs.MI)。表明，心梗心肌新生血管出現(xiàn)代償性顯著增加，不同方式運動均可進一步顯著增加新生血管數(shù)量，不同運動方式間存在顯著性差異，其效果為抗阻訓練>間歇運動>機械振動(圖3，圖4)。

圖3 心肌血管新生的免疫熒光觀察結(jié)果(×200)

圖4 心肌vWF+/PCNA+細胞數(shù)量和CD31+/FSTL1+血管平均數(shù)量統(tǒng)計結(jié)果

2.3 心肌組織學和心功能觀察與檢測結(jié)果

Masson染色觀察顯示，光鏡下心肌間質(zhì)膠原呈藍色，心肌細胞呈粉紅色，細胞核呈藍褐色。心梗區(qū)心肌組織發(fā)生替代性纖維化，瘢痕區(qū)膠原纖維過度增生，并呈放射狀分布，梗死邊緣區(qū)和非梗死區(qū)膠原纖維向周圍間質(zhì)延伸(圖5)。顯微圖像分析結(jié)果顯示(圖6)，MI組與S組比較，心肌膠原面積百分比(CVF%)顯著增加(P<0.01)。不同運動方式間存在顯著差異，其效果為MI組>MV組>ME組>MR組。

血流動力學結(jié)果顯示(圖7)，MI組與S組比較，LVSP和±dP/dt max均顯著降低(P<0.01)，LVEDP顯著性升高(P<0.01)；ME組、MR組和MV組與MI組比較，LVSP和±dP/dt max均顯著升高(P<0.01：ME vs.MI、MR vs.MI；P<0.05：MV vs.MI)，LVEDP顯著性降低(P<0.01)。表明，心梗心臟發(fā)生心肌替代性纖維化，心功能顯著降低，運動干預顯著降低心肌纖維化，顯著改善心功能，不同運動方式間存在差異。

圖5 心肌Masson染色觀察結(jié)果(×40)

圖6 心肌膠原面積百分比(CVF%)統(tǒng)計結(jié)果

2.4 心肌組織FSTL1表征、血管新生與心肌膠原面積百分比(CVF%)及心功能的相關(guān)分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，F(xiàn)STL1蛋白表達與vWF+/PC-NA+細胞數(shù)量之間存在顯著正相關(guān)(r=0.945，P<0.01)。表明，內(nèi)皮細胞增殖數(shù)量隨心肌FSTL1蛋白表達量增加而增加。FSTL1蛋白表達與CVF%、vWF+/PCNA+細胞數(shù)量與CVF%之間均存在顯著負相關(guān)(r=-0.763，P<0.01；r=-0.825，P<0.01)。表明，心肌纖維化程度隨心肌FSTL1蛋白表達量及vWF+/PCNA+細胞數(shù)量的增加而降低(圖8)。血管新生與血流動力學參數(shù)的相關(guān)分析顯示，vWF+/PCNA+細胞數(shù)量與LVSP、+dP/dt max和-dP/dt max均存在顯著正相關(guān)(r=0.747、0.851、0.887，P<0.01)，而與LVEDP存在顯著負相關(guān)(r=-0.769，P<0.01)。表明，隨著心肌新生血管的增加，心功能顯著改善(表1)。

圖7 心臟血流動力學參數(shù)統(tǒng)計結(jié)果

圖8 心肌組織FSTL1表征與血管新生及心肌膠原面積百分比(CVF%)的相關(guān)分析

表1 血管新生與血流動力學參數(shù)的相關(guān)分析

3 討論與分析

3.1 不同運動方式刺激內(nèi)源性FSTL1表征分析

3.2 不同運動方式刺激血管新生的比較分析

研究表明，游泳運動可降低心肌纖維化，并通過激活VEGF通路，增加血管新生[8]。心力衰竭患者跟蹤研究顯示，3個月的有氧運動訓練使內(nèi)皮祖細胞(EPCs)數(shù)量和血清血管生成素-2(AP-2)蛋白水平顯著升高[7]。不同強度和時間的有氧運動，如20～60 min、2周～6個月、75%～85%最大心率及60%～70%最大攝氧量等條件下，循環(huán)EPCs數(shù)量均顯著增加，有助于血管再生和血管新生[32]。力量訓練8周可使AP-1增加48%，VEGF和FST家族蛋白表達顯著上調(diào)[16]；不同強度和時間的抗阻訓練可使CYR61、ANGPTL2和ANGPT2等血管新生相關(guān)基因的mRNA表達發(fā)生變化[26]。此外，生理性缺氧訓練4周可改善VEC的遷移能力，增加循環(huán)EPCs，心肌毛細血管密度也顯著升高[40]。給予糖尿病小鼠1周低強度震動可增加血管新生及肉芽組織形成，加速傷口愈合和創(chuàng)面上皮形成[42]，全身性機械振動訓練可顯著升高循環(huán)MMP-2/9、VEGF和內(nèi)皮抑素水平，刺激血管新生[1]。表明，不同運動方式均可誘導機體血管新生，但缺乏針對同一病理條件下不同運動方式作用效果的比較。本文結(jié)果表明，心梗后進行不同方式運動均可顯著增加心臟內(nèi)皮細胞的增殖，且抗阻訓練效果最顯著，為缺血心臟病的運動康復手段和方法篩選提供了實驗依據(jù)。

3.3 運動上調(diào)FSTL1蛋白表達促進血管新生，改善心梗心臟功能的可能機制分析

規(guī)律運動可降低心梗急性期死亡率，其原因在于血管內(nèi)皮細胞功能、心肌收縮力和心壁壓力的改善[12]。研究指出，F(xiàn)STL1在心血管功能改善中發(fā)揮重要作用[34]。四周壓力超負荷的心肌細胞特異性fstl1敲除小鼠表現(xiàn)出心肌肥厚和心室功能的降低[36]。fstl1基因過表達可阻止心臟代償性肥大和心力衰竭，并證實心肌fstl1基因表達與AMPK信號存在調(diào)控關(guān)系[36]。FSTL1不僅對心肌細胞營養(yǎng)發(fā)揮作用，還具有在動脈損傷后促血管新生和減少血管內(nèi)膜形成的作用[23]。G?rgens等[10]發(fā)現(xiàn)，C2C12骨骼肌細胞可分泌FSTL1到培養(yǎng)基并直接作用于內(nèi)皮細胞信號通路，促進其功能和存活。內(nèi)皮細胞過表達FSTL1可提高內(nèi)皮細胞的分化和遷移，并減少細胞凋亡[30]。運動訓練可通過增強循環(huán)促血管生成細胞的功能及增加循環(huán)EPCs數(shù)量，改善心力衰竭患者的血管內(nèi)皮功能[35]。在運動刺激下，具有增殖和分化能力的EPCs會被動員釋放入外周血，參與修復損傷的血管內(nèi)皮，促進缺血組織血管再生，維護血管內(nèi)皮的完整性及功能[32]。表明，F(xiàn)STL1可調(diào)控運動對心血管的保護作用，并改善血管損傷造成的不良影響。本文實驗發(fā)現(xiàn)，運動干預后心梗心臟FSTL1能夠與CD31+細胞共定位，并形成血管樣組織。相關(guān)性分析證實，內(nèi)皮細胞增殖數(shù)量、心肌纖維化程度與心臟FSTL1表達呈高度相關(guān)。提示，F(xiàn)STL1可促進內(nèi)皮細胞增殖和心肌血管新生，改善心梗心臟纖維化和心功能。除了心源性FSTL1可誘導心肌血管新生外，推測心肌FSTL1或許部分來源于遠隔器官入血循環(huán)至靶器官，但缺乏實驗證據(jù)。FSTL1改善內(nèi)皮細胞功能已有報道，但循環(huán)水平FSTL1是否參與EPCs的遷移、分化及歸巢還需進一步驗證。

4 結(jié)論

不同運動方式可有效刺激心梗心臟內(nèi)源性FSTL1表達增加，促進心肌血管新生，降低心梗心肌纖維化，改善心功能，其中，抗阻訓練的效果較間歇運動和機械振動更顯著。探索不同運動方式對心梗心臟保護效應(yīng)的差異，將為心梗心臟的運動康復機制研究和運動處方篩選與制定提供實驗依據(jù)。

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Different Exercise Modes Up-regulate FSTL1 and Induce Angiogenesis in the Heart with Myocardial Infarction

XI Yue,CAI Meng-xin,TIAN Zhen-jun

Objectives:The aim of this study is to investigate the effects of different exercise modes on endogenous follistatin like-1(FSTL1) induced angiogenesis in the heart with myocardial infarction(MI).Methods:3-month old adult male sprague-dawley rats were randomly divided into 5 groups(n=12):Sham-operated group(S),sedentary MI group(MI),MI with interval exercise group(ME),MI with resistance training group(MR) and MI with mechanical vibration group(MV).The MI model was established by ligation of the left anterior descending(LAD) coronary artery.Rats in ME,MR and MV group were underwent 4 weeks’ training using small animal treadmill,weighted climbing up ladder and small animal vibrating platform,respectively.FSTL1 protein location and neovascularization were observed and analyzed by immunofluorescence staining;FSTL1 gene and protein expression were measured by RT-qPCR and Western blot;Heart function was evaluated by hemodynamics;Collagen volume fraction(CVF) of myocardium was observed and analyzed by Masson’s trichrome staining.Results:MI resulted in the up-regulation of myocardium FSTL1,endothelial cell(EC) proliferation and angiogenesis.Myocardial fstl1 gene expression was not affected by MI pathological conditions or exercise modes.Different exercise modes could further increase myocardial FSTL1 protein expression,significantly improve EC proliferation and angiogenesis.The effect of resistance training was more significant than interval exercise,and the mechanical vibration was the weakest.The CVF was reduced and the heart function was effectively improved by different exercise modes after MI.Conclusion:Different exercise modes effectively stimulate endogenous FSTL1 expression and myocardial angiogenesis,decrease myocardial fibrosis and improve heart function after MI.The effect of resistance training is better than interval exercise and mechanical vibration.Comparing the effects of different exercise modes on MI heart protection will provide the experimental basis for exercise rehabilitative mechanism research and the filtration and formulation of exercise prescription of MI patient.

myocardialinfarction;exercise;follistatinlike-1;angiogenesis

1000-677X(2016)10-0032-08

10.16469/j.css.201610005

2016-07-11；

2016-08-02

國家自然科學基金資助項目(31371199)。

席悅(1988-)，男，陜西西安人，在讀博士研究生，主要研究方向為運動心血管生物學，E-mail：tianzj2013@hotmail.com；蔡夢昕(1987-)，女，河南商丘人，在讀博士研究生，主要研究方向為運動心血管生物學；田振軍(1965-)，男，陜西綏德人，教授，博士研究生導師，主要研究方向為運動心血管生物學，E-mail：tianzj611@hotmail.com。

陜西師范大學 體育學院暨運動生物學研究所，陜西 西安 710119 Shaanxi Normal University,Xi’an 710119,China.

G804.7

A