間歇出酶/出菌絲的培養(yǎng)方式對里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的影響

蔣 露， 王步成， 白合超， 勇 強， 余世袁*

(南京林業(yè)大學(xué) 林木遺傳與生物技術(shù)省部共建教育部重點實驗室， 江蘇 南京 210037)

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·研究報告——生物質(zhì)能源·

間歇出酶/出菌絲的培養(yǎng)方式對里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的影響

蔣 露， 王步成， 白合超， 勇 強， 余世袁*

(南京林業(yè)大學(xué) 林木遺傳與生物技術(shù)省部共建教育部重點實驗室， 江蘇 南京 210037)

以微晶纖維素和淀粉水解液作為碳源生產(chǎn)纖維素酶，在里氏木霉Rut C30分批補料生產(chǎn)纖維素酶的過程中通過間歇取出部分酶的培養(yǎng)方式保護纖維素酶。實驗結(jié)果顯示:采用間歇出酶培養(yǎng)方式，在分批補料3 d后，每1、 2或者3天取出部分酶液。當(dāng)平均每天取出15 %的酶液，酶活顯著增加，總纖維素酶酶活較單純分批補料提高26.5 %～32.6 %，而總β-葡萄糖苷酶酶活提高超過46 %；采用間歇出酶出菌絲培養(yǎng)方式，當(dāng)每天取出15 %的酶液時，纖維素酶產(chǎn)量比分批補料增長35.4 %，去除和酶液等量的菌絲，酶活和分批補料相比增長32.5 %，而且這兩種培養(yǎng)方式所生產(chǎn)的纖維素酶的酶解效率高達82 %，遠超商品酶Celluclast(62.03 %)。

纖維素酶；分批補料；β-葡萄糖苷酶;里氏木霉

能源是當(dāng)今人類生存和發(fā)展的重要資源?；剂喜豢稍偕視斐森h(huán)境污染，而可再生能源的發(fā)展不僅可以減少環(huán)境污染而且可以確保能源安全[1]。利用木質(zhì)纖維原料生產(chǎn)的生物乙醇被認(rèn)為是最有前途的可再生能源。在燃料乙醇生產(chǎn)中，纖維素酶的作用至關(guān)重要，而商品纖維素酶價格較為昂貴，是目前亟待解決的問題。因此，生產(chǎn)低成本的纖維素酶十分重要。間歇培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)和分批補料培養(yǎng)是纖維素酶生產(chǎn)的3種主要模式。最常見的培養(yǎng)方法是分批補料培養(yǎng)，即在培養(yǎng)體系中以固定時間間隔補充某些原料和營養(yǎng)元素[2]。然而，分批補料生產(chǎn)纖維素酶存在需要長時間的培養(yǎng)才能實現(xiàn)高酶活性的問題，并且在培養(yǎng)過程中，許多機械、化學(xué)和熱力學(xué)因素可能對酶蛋白產(chǎn)生負面影響，從而造成酶活性的降低。本研究以纖維素酶產(chǎn)量為指標(biāo)，探討里氏木霉(Trichodermareesei)Rut C30以微晶纖維素和淀粉水解液作為碳源分批補料培養(yǎng)生產(chǎn)纖維素酶的過程中，間歇出酶和間歇出酶出菌絲兩種方式對酶產(chǎn)量的影響，以期為纖維素酶的新的生產(chǎn)方式提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌種

里氏木霉(Trichodermareesei) Rut C30，纖維素酶生產(chǎn)菌株，于4 ℃保存在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)斜面培養(yǎng)基上，由南京林業(yè)大學(xué)生物化工實驗室提供。

1.2 材料

微晶纖維素：Avciel PH-101，含纖維素82 %(以絕干質(zhì)量計)，相對結(jié)晶度72 %，購于Sigma公司。商品纖維素酶(Celluclast，Sigma C2730-50 mL，Cellulose fromTrichodermareeseiATTC 26921)，濾紙酶活為72 FPU/g。

淀粉水解液，自制。取玉米淀粉300 g倒入1 L 0.2 mol/L鹽酸中在120 ℃下水解90 min。冷卻后，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至(5.0± 0.2)。將該水解液稀釋至原體積的3～4倍，加入適量活化好的釀酒酵母發(fā)酵去除水解液中的葡萄糖，發(fā)酵48 h后離心去除酵母，上清液納濾除去發(fā)酵產(chǎn)生的鹽、酒精等小分子物質(zhì)，收集截留液，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至一定濃度，備用。水解液的成分為(g/L)：龍膽二糖 5.59、纖維二糖 12.27、麥芽糖 1.56、葡萄糖 0.36。

1.3 培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基：Mandels培養(yǎng)基[3]。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基(g/L)：淀粉水解液糖濃 6.5(以水解液中二糖質(zhì)量濃度計，下同)、葡萄糖 1、蛋白胨 1、硫酸銨 1.83、尿素 0.3、 KH2PO42、 MgSO40.3、 CaCl20.3、 FeSO4·7H2O 0.005、 MnSO4·H2O 0.001 6、 ZnSO4·7H2O 0.001 4、 CoC12·6H2O 0.003 7，吐溫80 2ml/L，添加檸檬酸緩沖液使pH值在 (4.8±0.1)。

1.4 纖維素酶的制備

里氏木霉Rut C30斜面上的孢子接種于裝有50 mL活化培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在30 ℃、 170 r/min培養(yǎng)36 h。活化好的菌絲按接種量10 %(體積分?jǐn)?shù))接入裝有50 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于170 r/min的搖床中培養(yǎng)。產(chǎn)酶第1天溫度控制在30 ℃，第2天之后控制在28 ℃。纖維素酶的生產(chǎn)按3種方式進行操作。

1.5 產(chǎn)酶方式

1.5.1 分批補料產(chǎn)酶 每天每升產(chǎn)酶液中補加4 g微晶纖維素、 1 g淀粉水解低聚糖、 1.09 g硫酸銨和0.24 g尿素，連續(xù)培養(yǎng)10 d，然后5 000 r/min離心，取上清液即為所得酶液(試樣號0-0)。

1.5.2 間歇出酶 在分批補料的基礎(chǔ)上從第4天到第8天進行間歇出酶，間歇出酶采用3種方式，每種方式做3個平行樣，培養(yǎng)10 d后，5 000 r/min離心，取上清即所得酶液。3種出酶方式如下： 1)第4天開始每天離心將上清液取出15 %(按體積算)剩余部分倒入錐形瓶即出酶15 %，同時補充相同體積的填補液(培養(yǎng)基，下同)，然后放入搖床繼續(xù)培養(yǎng)(試樣號1-15)，其它出酶量同此操作； 2)從第4天開始每2天出酶，每次出酶量為30 %(按體積算)，同時在取出后補充相同體積的填補液，然后放入搖床繼續(xù)培養(yǎng)(試樣號2-30)，其它出酶量同此操作； 3)從第4天開始每3天出酶，每次出酶量為45 %(按體積算)，同時在取出后補充相同體積的填補液，然后放入搖床繼續(xù)培養(yǎng)(試樣號3-45)，其它出酶量同此操作。

1.5.3 間歇出酶出菌絲 間歇出酶出菌絲是在分批補料間歇出酶的情況下進行，如果取出酶液和菌絲的量一樣，只要直接搖勻取出所需要量的發(fā)酵液，然后填補相同體積的填補液，然后放入搖床繼續(xù)培養(yǎng)。如果取出酶液量和菌絲量不一樣，菌絲體的量多于酶，取出所需要體積的菌絲量的發(fā)酵液高速離心后將多于酶液體積的部分的上清液返回搖瓶，填補相同體積的填補液，然后放入搖床繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)10 d后， 5 000 r/min離心，取上清液即為所得酶液。3種出酶出菌絲方式如下： 1)第4天開始每天離心將上清液取出 15 %(按體積算)剩余部分倒入錐形瓶即出酶 15 %，無菌絲取出，同時補充相同體積的填補液(培養(yǎng)基，下同)，然后放入搖床繼續(xù)培養(yǎng)(試樣號1-15-0)，其它間歇時間及出酶量同此操作； 2)從第4天開始每天出酶，將酶液和菌絲混勻直接取出15 %(按體積算)的發(fā)酵液，在取出后補充相同體積的填補液，然后放入搖床繼續(xù)培養(yǎng)(試樣號1-15-15)，其它間歇時間及出酶出菌絲量同此操作； 3)從第4天開始每天出酶，每次出酶量為15 %(按體積算)，同時將50 %的菌絲取出，在取出后補充相同體積的填補液，然后放入搖床繼續(xù)培養(yǎng)(試樣號1-15-50)，其它間歇時間及出酶出菌絲量同此操作。

1.6 酶水解性能測定

對1.5節(jié)3種生產(chǎn)方式所生產(chǎn)的纖維素酶和商品酶進行酶解性能測定，酶解條件如下：酶水解底物為稀HCl預(yù)處理玉米秸稈，酶解底物質(zhì)量濃度為5 g/L，纖維素酶用量為20 FPU/g(以纖維素計)，酶解體系為50 mL，用1 mol/L檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)pH值到4.8， 50 ℃，150 r/min下振蕩培養(yǎng)48 h。酶解得率計算式為：

酶解得率=還原糖質(zhì)量×0.9/纖維素質(zhì)量×100 %

1.7 分析方法

1.7.1 酶活測定 纖維素酶的活性用濾紙酶活力測定[4]。一個濾紙酶活力的國際單位(FPU)定義為：在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下每分鐘生成 1 μmol 葡萄糖所需的酶量。

β-葡萄糖苷酶酶活使用4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷測定[4]。一個β-葡萄糖苷酶活力單位(U)定義為：每分鐘水解生成1 μmol對硝基苯酚所需要的酶量。

1.7.2 糖質(zhì)量濃度測定 葡萄糖和纖維二糖的測定采用Agilent technology 1100 series,高效液相色譜系統(tǒng)。待測樣品經(jīng)10 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)離心后過0.22 μm濾膜。在Agilent 1100型高效液相色譜儀上，采用Bio-Rad Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm)色譜柱，0.005 mol/L硫酸作為流動相，流速為0.6 mL/min，檢測器采用視差折光檢測器，進樣量為10 μL。外標(biāo)法測定糖組分質(zhì)量濃度。

1.7.3 菌絲質(zhì)量濃度測定 測里氏木霉菌絲濃度。由于固體纖維素和菌絲同時存在，無法用稱重法測定菌絲。為避免固體纖維素干擾[5]，對細胞內(nèi)蛋白質(zhì)濃度進行測定，發(fā)酵液離心后，收集固體量的25 %并用蒸餾水洗滌兩次。將固體轉(zhuǎn)移入15 mL 0.2 mol/L的NaOH中，在100 ℃煮沸20 min[6]。然后使用標(biāo)準(zhǔn)Bradford法[7]測細胞內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度以此推算菌絲質(zhì)量濃度。在595 nm處的吸光度以分光光度計測定。菌絲質(zhì)量濃度(g/L)按下式計算：

菌絲質(zhì)量濃度=細胞內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度×6.886-0.192

2 結(jié)果與討論

2.1 間歇出酶對產(chǎn)酶的影響

2.1.1 間歇出酶方式的影響 按1.5.2節(jié)的操作進行間歇出酶，間歇出酶量選擇10 %～20 %(每天，試樣號1-10、 1-15和1-20)、 20 %～40 %(每2天，試樣號2-20、 2-30和2-40)、 40 %～50 %(每3天，試樣號3-40、 3-45和3-50)，結(jié)果見表1。

表 1 間歇出酶方式對補料纖維素酶生產(chǎn)的影響

1)0-0:對照樣,為分批補料方式生產(chǎn)纖維素酶 ，下表同control,fed-batch process,similarly hereinafter

如表1所示，3種方式的間歇出酶都增加了纖維素酶的總酶活。由此可見，間歇出酶可以提高里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的能力。當(dāng)每天回收10 %～20 %的酶液時，總的纖維素酶酶活和分批補料(對照樣0-0)相比提高21.5 %～31.4 %。其中每天回收15 %的酶液時總酶活提高率最大，可以達到31.4 %，同樣每2天或者每3天使總酶活提高量最大的出酶量分別為30 %和45 %，提高率可以達到32.6 %和26.5 %。由此可以看出，間歇出酶有利于纖維素酶的生產(chǎn)，出酶量的大小對產(chǎn)酶量影響較大。

由表1數(shù)據(jù)可以看出，合理的出酶量為平均每天回收15 %，即從培養(yǎng)第4天開始每天出酶15 %(1-15)、每2天出酶30 %(2-30)、每3天出酶45 %(3-45)，在培養(yǎng)結(jié)束時總酶活提高率可達到26.5 %～32.6 %。因此，每隔一段時間取出部分酶液并沒有對菌絲生長和酶的生產(chǎn)造成不利影響。

目前，許多學(xué)者采用的發(fā)酵方式是分批補料式培養(yǎng)。例如，Ahamed等[8]用高濃度纖維素、乳糖和乳糖酸的混合物為碳源，用分批補料的培養(yǎng)方式生產(chǎn)纖維素酶最后得到酶產(chǎn)量為5.02 FPU/mL，菌絲濃度達到14.7 g/L。Dos Reis等[9]用40 g/L的纖維素為主要碳源，輔加以蔗糖、豆粕、小麥麩等，分批補料7 d以后可以得到8.3 FPU/mL的酶活。在培養(yǎng)期間，許多因素可能對酶蛋白產(chǎn)生負面影響，使酶活降低。發(fā)酵液長時間的受剪切力、酶與纖維素等固形物的碰撞、氣液接觸的影響以及產(chǎn)物抑制等會對酶蛋白產(chǎn)生損害從而影響纖維素酶的生產(chǎn)[10]。在本研究中，在分批補料生產(chǎn)纖維素酶的基礎(chǔ)上采用間歇出酶技術(shù)很大程度上避免了β-葡萄糖苷酶長期留在搖瓶中所帶來的負面影響，保護了酶蛋白，有利于長期產(chǎn)酶。由結(jié)果可以看出，與對照組相比，纖維素酶酶活提高了18.6 %～32.6 %，證明該方法可行。

間歇出酶也有利于β-葡萄糖苷酶的生產(chǎn)，具體亦見表1。由表1可知，經(jīng)過10 d的培養(yǎng)，分批補料(對照)生產(chǎn)的總β-葡萄糖苷酶的酶活為124.6 U，而當(dāng)采用間歇出酶方式生產(chǎn)纖維素酶后，β-葡萄糖苷酶酶活有顯著提高，其總β-葡萄糖苷酶活均達到了182 U以上，與分批補料生產(chǎn)(對照)相比，總酶活提高率均高達46 %以上，其中以每2天出酶這種培養(yǎng)方式提高最為明顯。

里氏木霉被認(rèn)為不善于產(chǎn)β-葡萄糖苷酶。有研究顯示，低聚糖，特別是龍膽二糖，被認(rèn)為是β-葡萄糖苷酶的良好誘導(dǎo)劑。Juhász等[11]用Solka Floc 200和乳糖作為誘導(dǎo)物對β-葡萄糖苷酶誘導(dǎo)，在培養(yǎng)7 d后最高β-葡萄糖苷酶酶活可達到1.4 U/mL。也有人為節(jié)省成本，用廉價的玉米秸稈為碳源誘導(dǎo)里氏木霉生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶，其酶活最高也可達到1.31 U/mL[12]。在本研究中，淀粉水解液中含有低聚糖，如龍膽二糖、纖維二糖和麥芽糖，可以用作碳源誘導(dǎo)纖維素酶和β-葡萄糖苷酶。分批補料培養(yǎng)(對照)β-葡萄糖苷酶酶活達到124.6 U，而間歇出酶產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酶活最高可達348.9 U。因為β-葡糖苷酶具有較高的分子質(zhì)量，很容易在長時間培養(yǎng)中變質(zhì)，而酶定期回收可以有效保護β-葡萄糖苷酶，這可能是在回收酶后β-葡萄糖苷酶和纖維素酶總酶活提高的原因。

2.1.2 間歇出酶填補液的影響 在此研究中，出酶是指在離心后取出一定量的培養(yǎng)液，菌絲殘渣返回搖瓶，隨后加入一定量培養(yǎng)基作為填補液補足體系繼續(xù)培養(yǎng)。為了檢測填補液的pH值和營養(yǎng)鹽對酶生產(chǎn)的影響，將培養(yǎng)基成分分為3種類型的填補液即水、0.05 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH值4.8)和營養(yǎng)鹽(FeSO4·7H2O、 MnSO4·H2O、 ZnSO4·7H2O和CoCl2·6H2O，質(zhì)量濃度同1.3節(jié))，其對纖維素酶生產(chǎn)的影響如表2所示。

表 2 間歇出酶過程中不同填補液對纖維素酶生產(chǎn)的影響

由表2可知，采用間歇出酶培養(yǎng)方式產(chǎn)酶，纖維素酶總酶活均有較大提高，尤其是當(dāng)平均每天出酶量為15 %時，無論哪種填補液總纖維素酶活都比對照提高了25 %～35 %，可見填補液的pH值和營養(yǎng)鹽對纖維素酶生產(chǎn)的影響很小，但是β-葡萄糖苷酶在填補液是0.05 mol/L檸檬酸緩沖液和營養(yǎng)鹽時提高不少，而用水做填補液時總β-葡萄糖苷酶活較對照樣明顯降低。這可能是因為β-葡萄糖苷酶對pH值和營養(yǎng)鹽較敏感?？梢娕囵B(yǎng)基填補液中檸檬酸緩沖液和營養(yǎng)鹽溶液能有效地控制pH值并提供相應(yīng)的營養(yǎng)物質(zhì)，有利于β-葡萄糖苷酶合成。

2.2 間歇出酶出菌絲對產(chǎn)酶的影響

2.2.1 對產(chǎn)纖維素酶和β-葡萄糖苷酶的影響 分批出酶是將部分酶液取出并將菌絲返回到培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，這樣的大規(guī)模的操作會有染菌的風(fēng)險。既然在補料前大部分碳源和氮源已經(jīng)耗完(通過對產(chǎn)酶酶液中的糖進行分析得知)，那就可以考慮是否可以在出酶時將部分菌絲一并帶出，這樣既保證了無雜菌感染又可以保證不會因為碳源過早消耗盡而對產(chǎn)酶有影響。間歇出酶出菌絲按1.5.3節(jié)中的操作步驟進行，在出酶時帶出的菌絲將不會被倒入搖瓶繼續(xù)產(chǎn)酶，以培養(yǎng)基為填補液，補加量和出酶量一致，連續(xù)培養(yǎng)10 d。表3給出了間歇出酶出菌絲對產(chǎn)酶的影響。

表 3 間歇出酶出菌絲對產(chǎn)酶及菌絲的影響

如表3所示，纖維素酶總酶活提高率為23.6 %～35.4 %，但是出菌絲量不同對酶的生產(chǎn)還是有影響的。當(dāng)每天出15 %酶液，不出菌絲時，纖維素酶總酶活較對照樣提高了35.4 %，而當(dāng)出相同量的菌絲時，纖維素酶總酶活提高了30 %左右，β-葡萄糖苷酶提高了60 %以上；總β-葡萄糖苷酶酶活最大達到287.1 U相當(dāng)于3.3 U/mL，其比Sukumaran等[13]同樣用里氏木霉生產(chǎn)纖維素酶所報告的1.72 U/mL更高；盡管如此，如果每天取出50 %的菌絲體，β-葡萄糖苷酶的產(chǎn)量明顯低于對照。這表明菌絲濃度控制酶的生產(chǎn)，特別是對于β-葡萄糖苷酶。將少量的菌絲體丟棄對纖維素酶生產(chǎn)并未產(chǎn)生明顯影響，還具有方便生產(chǎn)和降低染菌的優(yōu)點。重復(fù)2～3次測試均是類似的結(jié)果。

2.2.2 對產(chǎn)酶菌絲和蛋白濃度的影響 表3還給出了分批補料生產(chǎn)10 d后蛋白和菌絲質(zhì)量濃度的變化。纖維素的存在極大地干擾菌絲體濃度的測定，不同研究者采用不同的方法去解決這個問題，例如用氫氧化鈉溶解細胞測蛋白質(zhì)濃度[6,14]、高氯酸[15]或超聲波的方法[16]、 DNA含量的測定[17]和用乙酸與硝酸的混合物去除菌絲體細胞[18]等方法。本研究采取的是氫氧化鈉溶解細胞測蛋白質(zhì)的方法。由表3所示，無論是分批補料、出酶還是出菌絲其蛋白質(zhì)量濃度均控制在2.2～3.9 g/L，然而菌絲質(zhì)量濃度卻有顯著差異。對照試驗，即分批補料培養(yǎng)未進行出酶，最終菌絲質(zhì)量濃度 7.3 g/L，當(dāng)每天出15 %酶液，最終菌絲質(zhì)量濃度降低到4.2 g/L(無菌絲去除)和2.9 g/L(15 %的菌絲體去除)，而纖維素酶總酶活的增加量分別為35.4 %和32.5 %。然而，如果除去50 %的菌絲體，則該菌絲質(zhì)量濃度下降到 2.1 g/L。雖然纖維素酶的產(chǎn)量并沒有受到太大影響但是β-葡萄糖苷酶酶活大量減少。每2天和每3天出酶的樣品也有類似趨勢。由此可見，雖然分批補料菌絲較多，但是產(chǎn)酶能力不見得是最好，而當(dāng)部分菌絲取出，菌絲質(zhì)量濃度維持在3～4 g/L時，產(chǎn)酶能力較好。

Ahamed等[8]使用50 g/L的纖維素、 10 g/L葡萄糖和10 g/L酵母提取物作為起始碳源，在7 L生物反應(yīng)器分批補料培養(yǎng)里氏木霉Rut C30，5 d后得到纖維素酶酶活5.02 U/mL，菌絲質(zhì)量濃度為9 g/L。Mohagheghi等[19]用木糖和纖維素為碳源分批補料培養(yǎng)里氏木霉10～14 d，其纖維素酶活可達到12～12.5 FPU/mL，菌絲質(zhì)量濃度達到16 g/L。雖然碳源和氮源的連續(xù)補給有利于細胞的增殖，但是由本研究上述結(jié)果可知分批補料所產(chǎn)生的高濃度的菌絲對產(chǎn)酶并不是都有促進作用。出酶和出菌絲可以使菌絲保持在一個相對合理的濃度，例如本實驗中3～4 g/L的菌絲就足夠維持產(chǎn)酶。該培養(yǎng)方法的優(yōu)點在于不僅可以增強酶的生產(chǎn)率，也降低了冗余的真菌細胞對碳源和氮的消耗。

2.3 纖維素酶對稀鹽酸預(yù)處理玉米秸稈的水解性能

為了評估各種纖維素酶的水解能力，對3 種自產(chǎn)纖維素酶酶解鹽酸預(yù)處理的玉米性能進行了研究，并和商品酶Celluclast作對比，結(jié)果見表4。

表 4 不同纖維素酶酶解48 h后酶解得率比較

從表4看出， 3種自產(chǎn)酶的酶解能力都比商品酶好。商品酶酶解48 h后酶解得率僅為62.03 %，而分批補料生產(chǎn)的自產(chǎn)酶酶解得率為86.44 %，比商品酶提高了39 % 。間歇出酶和間歇出酶出菌絲的酶解得率也都高達82.73 %和82.80 %，與商品酶相比均提高34 %以上。上述研究表明，3種酶制劑的水解能力幾乎相同。這表明，分批補料生產(chǎn)中采用間歇出酶或者間歇出酶出菌絲的生產(chǎn)方式都能提高纖維素酶酶活，并且這些操作并未影響酶的水解能力，酶仍然有很好的酶解性能。鐘健等[20]用特異腐質(zhì)霉所產(chǎn)的中性纖維素酶并添加葡萄糖苷酶和木聚糖酶酶解汽爆玉米秸稈120 h后，其纖維素水解得率為64.9 %，該種纖維素酶的酶解性能遠小于本研究所產(chǎn)的纖維素酶。而本研究自產(chǎn)纖維素酶是內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解和β-葡萄糖苷酶的復(fù)合物，木質(zhì)纖維原料轉(zhuǎn)化成可利用的糖是由纖維素酶不同組分酶的協(xié)同作用完成的。張偉等[21]用里氏木霉產(chǎn)纖維素酶酶解堿處理小麥秸稈，當(dāng)酶投加量為35 FPU/g(以玉米秸稈質(zhì)量計)，水解96 h，最高酶水解得率為60.73 %，遠低于本研究的自產(chǎn)纖維素酶的酶解得率，說明本研究自產(chǎn)的纖維素酶具有較好的酶解性能。

3 結(jié) 論

3.1 以微晶纖維素和淀粉水解液作為碳源生產(chǎn)纖維素酶，在里氏木霉(Trichodermareesei)Rut C30分批補料生產(chǎn)纖維素酶的過程中，間歇出酶和間歇出酶出菌絲的生產(chǎn)方式都有利于纖維素酶的生長。當(dāng)每天取出酶液量平均為15 %時，與對照樣相比，總纖維素酶酶活提高26.5 %～32.6 %，總β-葡萄糖苷酶酶活提高46 %以上。

3.2 采用間歇出酶出菌絲方式時，當(dāng)出酶同時取出適量菌絲使菌絲質(zhì)量濃度保持在3～4 g/L時，里氏木霉的產(chǎn)酶能力較好，同時，菌絲的適當(dāng)去除也降低了冗余的真菌細胞對碳和氮的消耗。

3.3 對采用3種方式自產(chǎn)的纖維素酶進行酶解性能研究，結(jié)果顯示：與商品酶Celluclast的酶解性能對比，自產(chǎn)纖維素酶對鹽酸預(yù)處理的玉米秸稈的酶解能力相當(dāng)，且預(yù)處理玉米秸稈的酶解得率均超過80 %，遠高于商品酶的酶解能力(62.03 %)。

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Influence of Periodic Enzyme and Mycelia Recovery on Cellulase Production by Trichoderma reesei

JIANG Lu, WANG Bu-cheng, BAI He-chao, YONG Qiang, YU Shi-yuan

(Key Laboratory of Forest Genetics & Biotechnology,Ministry of Education,Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China)

The cellulase was produced by fed-batch cultivation ofTrichodermareeseiRut C30 with microcrystalline cellulose and starch hydrolysate as carbon source under the protection of periodic enzyme recovery.The results showed that after three days of fed-batch cultivation,cellulase was partially recovered 15 %,30 % or 45 % at every 1,2 or 3 days.The total enzyme activites of cellulase andβ-glucosidase obtained by the methods significantly increased by 26.5 %-32.6 % and over 46 % more than that of fed-bath.Mycelia could also be removed to avoid infection.When enzymes were recovered 15 % every day, the cellulase production increased by 35.4 % (without mycelia removal) and 32.5 % (with 15 % mycelial removal) compared with those of normal fed-batch cultivation.A high hydrolytic ability of the produced cellulase with enzyme and mycelia recovery was also detected and the hydrolysis efficiency could reach more than 82 %，far more than that of Celluclast(62.03 %).

cellulase;fed-batch culture;β-glucosidase;Trichodermareesei

2016-01-06

“十二五”國家科技支撐計劃資助(2015BAD15B09)

蔣 露(1990— )，女，江蘇宜興人，碩士生，研究方向為生物質(zhì)能源科學(xué)與技術(shù)；E-mail：544915512@qq.com

*通訊作者：余世袁，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事生物質(zhì)能源轉(zhuǎn)化研究；E-mail：syu@njfu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1673-5854.2016.06.008

TQ351

A

1673-5854(2016)06-0049-07