河北地區(qū)蚯蚓種群遺傳多樣性分析

張玉峰，劉瑩瑩，李叢勝，畢艷孟，申磊

（1.廊坊師范學院生命科學學院，河北廊坊065000；2.中國農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，北京100193）

河北地區(qū)蚯蚓種群遺傳多樣性分析

張玉峰1，劉瑩瑩1，李叢勝1，畢艷孟2，申磊1

（1.廊坊師范學院生命科學學院，河北廊坊065000；2.中國農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，北京100193）

為了探討蚯蚓遺傳多樣性與土壤環(huán)境的關(guān)系，2015年6～10月在河北地區(qū)進行蚯蚓資源調(diào)查和樣品采集，利用PCR技術(shù)擴增線粒體基因16S rDNA、ND1序列，分析了該區(qū)蚯蚓優(yōu)勢種類天錫杜拉蚓（Drawida gisti）的遺傳多樣性。結(jié)果表明：來自河北23個采集點的研究樣本，16S、ND1全部DNA序列的平均單倍型多樣性分別為0.76和0.64，平均核苷酸多樣性分別為0.042和0.039，群體間平均遺傳距離分別為0.045和0.054。土壤性質(zhì)顯著影響種群的遺傳變異水平。

蚯蚓；天錫杜拉蚓；遺傳多樣性；土壤性質(zhì)；河北地區(qū)

蚯蚓為大型土壤動物，在土壤的許多理化過程中發(fā)揮著重要作用，如，松動土壤，增加土壤的通氣性和持水能力，促進土壤有機質(zhì)的合成與分解。近些年，有關(guān)陸棲寡毛類動物的分子生態(tài)學研究較少，King等[3]采用AFLP技術(shù)研究了英國正蚓科蚯蚓潛在的物種多樣性，證明地理隔離對促進新種的形成具有重要影響；Buckley等[4]使用16S和28S rRNA對新西蘭環(huán)毛蚓的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進行了分析，并結(jié)合新西蘭地質(zhì)演化史上的一系列重大地質(zhì)事件，推斷了蚯蚓物種群間的遺傳分化時間以及地質(zhì)事件對生物多樣性的影響。在我國，有關(guān)土壤動物分子生態(tài)學的研究鮮有報道[5～7]。天錫杜拉蚓（Drawida gisti）屬寡毛綱（Oligochaeta）鏈胃科（Moniligastridae）杜拉蚓屬（Drawdia），是我國一種常見的淺居型（epi-endogeic）蚯蚓，經(jīng)?；顒佑谕寥辣韺?，偏愛生境為農(nóng)家菜園和玉米地[1]。天錫杜拉蚓在我國分布范圍廣泛，吉林、安徽、湖北、江蘇等地均有分布[2]。2015年6～10月在河北地區(qū)進行蚯蚓樣本的野外采集時，亦發(fā)現(xiàn)天錫杜拉蚓為該地區(qū)的優(yōu)勢種類。作者通過線粒體基因片段分析了天錫杜拉蚓的遺傳多樣性，并探究了土壤理化性質(zhì)對其種群遺傳多樣性的影響，以證明蚯蚓多樣性對土壤環(huán)境的依賴性。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

河北省地處華北平原，毗鄰內(nèi)蒙古高原，東臨渤海，西望太行山；區(qū)域內(nèi)環(huán)繞京、津兩大城市，東北

部與遼寧省交界，南部、東南部分別與河南和山東兩省接壤；地勢由西北向東南傾斜，地貌類型主要為平原、山地、高原等，土壤類型主要有褐土和潮土。該區(qū)氣候條件較好，四季分明，雨熱同期，屬于典型的溫帶大陸性季風氣候；氣溫分布特征呈西、南高，東、北低；年降水量總趨勢是東南部地區(qū)多于西北部地區(qū)[8]。本研究的蚯蚓樣品采集點主要分布在平原地區(qū)，共23個（表1）。

表1 各研究地點的地理位置與土壤養(yǎng)分含量Table1 Geographic location and content of soil nutrient in each site

1.2 試驗材料

蚯蚓分布的主要生境為農(nóng)田、果園、潮濕的枯枝落葉層等。在每采集點，均采用五點法取樣，樣方大小為50 cm（長）×50 cm（寬）×20 cm（深），利用挖掘法采集蚯蚓。依據(jù)《中國陸棲蚯蚓》[2]進行蚯蚓的形態(tài)學鑒定，選取形態(tài)特征明顯的性成熟天錫杜拉蚓作為研究群體。試驗蚯蚓在采集當日用70%酒精處死，保存于95%酒精中，備用。

1.3 試驗方法

以蚯蚓尾部體壁組織為材料，利用試劑盒DNeasy Tissue&Blood kit（QIAGEN）提取DNA。

PCR擴增與DNA測序。16S引物序列：上游CTT AAA GAT TTT GGC GGT GTC，下游CTC TTG CAC GGT TAG GAT AC；ND1引物序列：上游GAA TAG TGC CAC AGG TTT AAA C，下游TTA ACG TCA TCA GAG TTA TC。PCR反應體系組分與反應條件見張玉峰[6]。采用1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測PCR產(chǎn)物質(zhì)量。測序工作由北京金唯智公司完成，DNA測序引物與PCR上游引物相同。對測序峰圖雜亂的DNA樣品，進行重復擴增與測序。

通過DNASTAR v.7.1.0軟件中的SeqMan應用程序，對DNA序列進行觀察、對齊、刪除空隙和兩端雜亂序列信號并轉(zhuǎn)換.ab1格式結(jié)果為FASTA格式。將測序結(jié)果經(jīng)BLAST在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行序列相似性搜索，與其相匹配的序列是蚯蚓16S rRNA、ND1等基因序列，并且匹配度均＞90%，說明擴增和測序結(jié)果準確可靠。利用分子遺傳軟件MEGA 5.0[10]計算各地理群體之間的遺傳距離（Kimura 2-Pairwise distance），分析各組DNA序列的堿基頻率、保守位點和變異位點。利用DNaSP 5.0軟件[11]，分析單倍型多樣性指數(shù)（h）、單倍型數(shù)量（H）與分布、核苷酸多樣性指數(shù)（Pi）。

利用SPSS統(tǒng)計軟件，對天錫杜拉蚓的遺傳多樣性與土壤環(huán)境要素進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA序列組成與多態(tài)性

16S、ND1全部DNA序列的平均單倍型多樣性分別為0.76和0.64，平均核苷酸多樣性分別為0.042和0.039。從各地理種群的單倍型多樣性和核苷酸多樣性信息（表2）可以看出，不同地理群體中，16S片段、ND1片段的單倍型多樣性范圍分別為0.12～0.90和0.15～1.00，核苷酸多樣性范圍分別為0～0.050和0～0.380。對DNA序列進行編輯、剪接，結(jié)果顯示，16S rRNA有效片段長度為524 bp，ND1序列有效長度為685 bp。ND1序列中有392個變異位點，其中，簡約信息位點186個，單核苷酸多態(tài)位點206個；16S序列中有363個變異位點，其中，簡約信息位點247個，單核苷酸多態(tài)位點116個。廊坊群體的DNA隔離位點與堿基顛換數(shù)較高，而承德群體的堿基轉(zhuǎn)換數(shù)較高。DNA序列變異位點比例分別為14.8%（ND1）、13.0%（16S）。16S和ND1序列中腺嘌呤和胸腺嘧啶含量豐富（64.6%，65.4%）。群體間平均遺傳距離（表3）分別為0.045（16S）、0.054（ND1）。

表2 蚯蚓測序樣本的遺傳多樣性Table2 Genetic diversity of earthworm sequencing samples

表3 地理群體間K2-P遺傳距離Table3 Kimura 2-Pairwise Genetic distances between geographic groups

2.2 蚯蚓遺傳多樣性與土壤養(yǎng)分含量的相關(guān)性

ND1序列的單倍型數(shù)量與土壤有機碳含量呈極顯著正相關(guān)（r=2.167，P＜0.01）、與全氮含量呈顯著正相關(guān)（r=8.648，P＜0.05），獨享單倍型數(shù)量和單倍型多樣性均與土壤速效磷含量呈顯著負相關(guān)（r分別為-0.070 6和-0.013 3，P均＜0.05）；其他遺傳多樣性

指標與土壤養(yǎng)分含量的相關(guān)性均不顯著。

3 結(jié)論與討論

Edwards[1]指出陸棲蚯蚓的分布與土壤性質(zhì)具有密切關(guān)系，其與同事們首次提出了環(huán)境因子可能對陸棲蚯蚓的遺傳多樣性產(chǎn)生影響，蚯蚓種群遺傳變異與土壤因子之間具有一定的相關(guān)性，因此，可能起因于祖先種在土壤環(huán)境中的遷移、定居所形成的現(xiàn)有種群格局是在環(huán)境因子的作用下所形成的遺傳格局，而不是形態(tài)學格局。Novo等[12]研究表明，基于COI序列的西班牙陸棲蚯蚓（Hormogaster elisae）遺傳距離與土壤類型具有顯著的相關(guān)性，而遺傳距離、土壤理化性質(zhì)與蚯蚓體長之間的相關(guān)性均不明顯。本研究結(jié)果顯示，D.gisti種群內(nèi)遺傳距離與土壤因子之間的相關(guān)性不顯著，而地理群體的單倍型數(shù)量、核苷酸多樣性與土壤理化性質(zhì)（有機碳、全氮、速效磷含量）之間具有顯著的相關(guān)性。雖然這些研究類群和研究結(jié)果略有不同，但在土壤性質(zhì)影響蚯蚓種群遺傳多樣性的研究結(jié)論上均較為一致。然而，背暗流蚓（Aporrectodea caliginosa）單倍型的分布狀況與土壤因子之間并沒有顯著的相關(guān)性[13]。正蚓科蚯蚓，如背暗流蚓為表棲型（epigeic）蚯蚓，可能是由于長期生活在土壤表面的潮濕枯枝落葉層下，并未深入到土壤中生活，所以土壤性質(zhì)的改變對其遺傳變異的影響較?。欢戾a杜拉蚓隸屬鏈胃蚓科，為淺居型或上食下居型（epiendogeic）。因此，蚯蚓種類的分類學差異、生態(tài)習性以及對土壤偏愛程度的差異可能是上述結(jié)論存在差異的主要原因。Novo等[12]利用地理距離隔離模型（IBD）解釋了西班牙陸棲蚯蚓高度的遺傳變異，地理種群之間距離越遠，其遺傳變異程度越高。此外，不同的分類地位、生活習性差異、基因片段長度也是遺傳差異的重要因素。

本研究運用線粒體部分基因片段對河北地區(qū)蚯蚓種群多樣性進行分析，并探究了多樣性的影響因素，結(jié)果表明：（1）基于線粒體16S基因的天錫杜拉蚓種群遺傳變異水平略低于ND1基因；（2）遺傳多樣性與部分土壤理化指標具有顯著的相關(guān)性。這為我國蚯蚓分子生態(tài)學的發(fā)展提供了重要的基礎資料。

但是，本次研究仍有如下問題有待后續(xù)深入探索。（1）各采集地點蚯蚓樣本數(shù)量差異是對種群遺傳多樣性，尤其是單倍型分布以及多樣性分析的一個重要影響因素。因此，進一步拓展蚯蚓的采集地點，是未來研究中值得重視的問題。（2）利用16S、ND1序列等引物可以對天錫杜拉蚓擴增出有效片段，而COI通用引物以及重新設計的引物均不能有效地擴增出相應的PCR產(chǎn)物，因此，優(yōu)化已知基因PCR反應所需的擴增引物，也是未來需要解決的一個熱點問題。

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Analysis of Genetic Diversity of Drawida gisti and Soil Properties

ZHANG Yu-feng1，LIU Ying-ying1，LI Cong-sheng1，BI Yan-meng2，SHEN Lei1
（1.College of life Sciences，Langfang Teachers University，Langfang 065000，China；2.College of Resources and Environmental Sciences，China Agricultural University，Beijing 100193，China）

The study aimed to discussing relation between earthworm genetic diversity and soil environment.Based on field studies conducted from July to October 2015，it was analyzed the genetic diversity of Drawida gisti using mitochondrial 16S and ND1 genes which were amplified by PCR in samples obtained from twenty-three localities，DNA polymorphism within and between groups was analyzed.The average haplotye diversity based on 16S and ND1 genes were 0.76 and 0.64，respectively，mean nucleotide diversity were 0.042 and 0.039，respectively，mean genetic distance between groups were 0.045 and 0.054，respectively.Genetic variation was significantly influenced by soil properties.

Earthworm；Drawida gisti；Genetic diversity；Soil properties；Hebei District

Q958

A

1008-1631（2016）04-0045-04

2016-01-06

河北省自然科學基金項目（C2015408038）；河北省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練項目(201510100034)；河北省高等學?？茖W技術(shù)研究項目（QN2014055）；廊坊師范學院博士自然科學基金項目（LSBS201305）

張玉峰（1982-），男，河北滄州人，講師，博士，主要從事土壤動物生態(tài)學工作。E-mail：805758301@qq.com。